3. STANOVENÍ SÍRY pomocí analyzátoru itp 3.1. IZOTACHOFORÉZA Kapilární izotachoforéza patří mezi elektromigrační metody, tato metoda využívá různou pohyblivost iontů v elektrickém poli. Pomocí ITP se stanovují kationty i anionty. Nelze je však stanovovat současně. Vzorek se dávkuje mezi dva elektrolyty, vedoucí elektrolyt (LE) a koncový elektrolyt (TE). Po připojení stejnosměrného napětí k systému se udržuje konstantní proud a dochází k separaci jednotlivých částic na základě jejich odlišné pohyblivosti. Po připojení stejnosměrného napětí dochází k pohybu iontů, přičemž platí podmínka: μ[LE] > μ[X] > μ[TE] kde μ[LE] je elektroforetická pohyblivost vedoucího elektrolytu, μ[X] je elektroforetická pohyblivost stanovovaného iontu, μ[TE] je elektroforetická pohyblivost koncového elektrolytu Vlastní analýza je rozdělena na dvě části. Po připojení stejnosměrného elektrického pole se ionty začnou pohybovat k opačně nabité elektrodě různou rychlostí. Dochází k vytvoření tzv. izotachoforetických zón. Každá zóna obsahuje ionty pouze jedné látky. Po ustavení rovnováhy se začnou všechny zóny pohybovat stejnou rychlostí. Sousední zóny jsou odděleny ostrým rozhraním. To je způsobeno tzv. samozaostřovacím efektem. Na tomto rozhraní se skokem mění intenzita elektrického pole a koncentrace iontů. Obr. 3.1. Separace směsi složek A a B (a – v čase nástřiku, b a c – proces migrace) Rychlejší částice se dostanou na začátek dělící směsné zóny, kdežto méně pohyblivé částice se zadržují. Po chvíli dojde k ustavení rovnovážného stavu, v němž jsou již částice odděleny a pohybují se všechny stejnou rychlostí. Tento proces znázorňuje obrázek 7.1. V rovnováze mají jednotlivé zóny v důsledku samozaostřovacího efektu velmi ostrá rozhraní a koncentrace jednotlivých iontů uvnitř zóny je konstantní. Tato koncentrace závisí na pohyblivosti iontu, ale také na koncentraci a typu vedoucího elektrolytu. Výsledkem izotachoforézy je časový záznam nazvaný izotachoforegram, který udává závislost signálu detektoru na čase. POPIS ELEKTORFORETICKÉHO ANALYZÁTORU: Separační jednotka se skládá z 6 částí, které jsou zobrazeny na obrázku 3.2. · 1 – dávkovací ventil · 2 – první kolona (předseparační) s vodivostním detektorem · 3 – spojení kolon tvořené blokem spojení kolon, plnicím blokem a elektrodovou nádobou pro první kolonu · 4 – druhá kolona (analytická) s vodivostním detektorem a UV detekční celou připojenou optickými vlákny k detektoru · 5 – elektrodový systém tvořený plnícím blokem a elektrodovou nádobkou pro analytickou kolonu · 6 – upevňující lišta Obr. 3.2. Separační jednotka EA 102 3.2. STANOVENÍ POMOCÍ ITP Před samotnou analýzou je třeba promýt celý systém analyzátoru destilovanou vodou. Poté se rezervoár TE naplní koncovým elektrolytem a rezervoáry CE 1 a CE 2 elektrolytem vedoucím. Spodní kolonu propláchneme vedoucím elektrolytem pomocí dvou injekčních stříkaček. Dávkování vzorku, ale také promývání horní kolony, se provádí dávkovacím kohoutem, který má tři polohy (obrázek č. 7.3). Je-li kohout v poloze A, je horní kolona uzavřena, v poloze B dochází k průtoku koncového elektrolytu kolonou a nadávkování vzorku, v poloze C je systém připraven k analýze. Vzorek je dávkován injekční stříkačkou, zatímco je kohout v poloze A, posunutím do polohy B se vzorek nadávkuje a současně se nechá odtéct malé množství koncového elektrolytu (kontrola průchodnosti). Pootočení kohoutu do polohy C je zahájena analýza. Přístroj EA 102 je připojen k počítači s příslušným softwarem – ITPPro32, který zachycuje a zpracovává daný signál. Obr. 3.3. Polohy dávkovacího kohoutu 3.3. PŘÍPRAVA ELEKTROLYTŮ Jako vedoucí elektrolyt použijeme 10 mM HCl + 10 mM β-alanin + 3 mM BTP + 0,1% HPMC. Do 100 ml odměrné baňky vneseme tolik kyseliny chlorovodíkové, aby její koncentrace byla 10 mM. Přidáme takové množství β-alaninu, aby jeho koncentrace byla 10 mM a tolik BTP (bis-tris propan), aby jeho koncentrace byla 3 mM. Poté k roztoku přidáme 20 ml 0,1% HPMC (hydroxypropyl-methyl-celulosa). Jako koncový elektrolyt použijeme 10 mM citronan sodný. Do 100 ml odměrné baňky navážíme tolik citronanu sodného, aby jeho výsledná koncentrace byla 10 mM. 3.4. PŘÍPRAVA VZORKŮ Navážením si připravíme 10mM standard SO[4]^2- (např. (NH[4])[2]SO[4]). Dále postupujeme v ředění dle pokynů vyučujícího. Stanovované vzorky je potřeba před analýzou zbavit oxidu uhličitého pomocí ultrazvukové lázně. Z připraveného roztoku vzorku odpipetujeme do tří 25ml baněk 5 ml tohoto roztoku. První baňku doplníme po rysku destilovanou vodou. Do druhé baňky napipetujeme 1 ml roztoku standardu a do třetí baňky napipetujeme 2 ml roztoku standardu. Poté obě baňky doplníme destilovanou vodou po rysku. Každý roztok proměříme 3×. 3.5. METODY VYHODNOCENÍ 3.5.1. KVALITATIVNÍ ANALÝZA Zóny vzniklé po separaci na izotachoforegramu porovnáme se zónami standardu. K tomu se využívá tzv. RSH faktor, což je relativní výška vlny udávaná v procentech. Tento faktor je definován vztahem: kde: h[x] je výška vlny látky, h[L] je výška vlny vedoucího elektrolytu, h[T] je výška vlny koncového elektrolytu 3.5.2. KVANTITATIVNÍ ANALÝZA K vyhodnocení analýzy se využívá metoda přídavku standardu (příp. metoda kalibrační přímky). Metoda přídavku standardu eliminuje vliv matrice. Koncentrace analytu odpovídá délce naměřené zóny. Z izotachoforegramu. Délka zóny s příslušnou hodnotou RSH faktoru se srovnává s délkou zóny po přídavku standardu. K výpočtu koncentrace iontů analytu ve vzorku při využití metody přídavku jednoho standardu s doplněním baňky po rysku se používá následující vztah: kde: c[vz] je výsledná koncentrace vzorku [mg.l^-1]; c[st] je koncentrace roztoku standardu [mg.l^-1]; V[st] je objem přídavku standardu [l]; l[vz] je délka zóny vzorku [s]; V[vz] je objem vzorku [l]; l[vz+st ]je délka zóny po přídavku standardu [s] V případě více přídavků se koncentrace iontů vypočítáme z regresní přímky dle vztahu: kde: c[vz] je koncentrace vzorku; c[st] je koncentrace standardu; V[vz] je objem vzorku; a je úsek; b je směrnice přímky. Obr. 7.4. Příklad izotachoforegramu 3.6. OPTIMALIZACE METODY Při optimalizaci metody se mění parametry analýzy a zjišťují se ideální podmínky pro měření. Při jednokrokové analýze je třeba zjistit optimální proud, při kterém se jednotlivé zóny objeví v přijatelném čase a v přijatelném rozlišení ® tj zjišťujeme optimální retenční čas. U dvoukrokové analýzy se dosahuje lepšího rozlišení a často i nižších limitů detekce, v prvním kroku bývá proud vyšší a ve druhém se snižuje ® určení optimálního rozlišení. Podmínky pro dvoukrokovou analýzu nastavené výrobcem pro elektrolytický systém: počáteční 80 µA, koncový 30 µA Jednotlivé parametry mohou být měněny podle pokynů vyučujícího. 3.7. VYHODNOCENÍ ANALÝZY 1) Popis a graf izotachoforegramu, popis průběhu analýzy. 2) Vyhodnocení stanovení aniontů SO[4]^2- izotachoforeticky, porovnání s dalšími metodami (pokud bylo provedeno kvantitativní stanovení).