C7075: Bioanalytická chemie v laboratorní medicíně Vybrané bioanalyty krve a jejich stanovení ümočovina ükreatinin ücelkový a přímý bilirubin üaminotransferáza – ALT üaminotransferáza - AST üalkalická fosfatáza ALP üsodné ionty üdraselné ionty üchloridové ionty üglukóza üglykovaný hemoglobin ücelková bílkovina üC-reaktivní protein CRP ülidský choriový gonadotropin HCG Stanovení vybraných analytů v krvi 2 = konečný produkt rozkladu bílkovin ütvoří se v játrech a krví je transportována do ledvin a filtrována do moči üzvýšená hladina v krvi značí zvýšený příjem bílkovin nebo zvýšený rozklad bílkovin v důsledku hladovění, infekce, horečky a podobně, snížená hladina naznačuje jaterní selhání, hyperhydrataci nebo nedostatečný příjem bílkovin v potravě üběžně je stanovována také v moči pro potřeby zjištění dusíkové bilance (= rozdíl mezi příjmem dusíku (bílkovin) v potravě a vylučováním dusíku (močoviny) v moči) Močovina Doporučená metoda stanovení = enzymově s využitím ureázy = fotometrické sledování poklesu NADH měřením absorbance při 340 nm, kdy rychlost úbytku NADH je přímo úměrná koncentraci močoviny (Warburgův optický test) močovina + H2O + 2H+ CO2 + 2NH4+ NH4+ + 2-oxoglutarát + NADH L-glutamát + H2O + NAD+ ureáza GMD 3 Warburgův optický test = principem je přeměna oxidované formy NAD+ na redukovanou formu NADH, která se projeví změnou absorbance při 340 nm Obsah obrázku text, obrazovka, monitor, zařízení Popis byl vytvořen automaticky Močovina Další metody stanovení močoviny = elektrochemické metody a biosenzory üzakotvení ureázy na příslušném nosiči a reakce s močovinou üměření přímé potenciometrie nebo konduktometrie üvyužívá se v POCT systémech 4 Kreatinin = konečný produkt rozkladu svalového kreatinu ükreatinfosfát je zdrojem energie pro svaly, z kreatinu pak vzniká kreatinin, který již nelze fosforylovat a který je vylučován ledvinami do moči ükoncentrace kreatininu v séru je přímo úměrná svalové hmotě organismu üjedná se o indikátor ledvinových chorob a sledování průběhu onemocnění Kreatininová clearance = vyšetření pro zjištění filtrační schopnosti ledvin = porovnání hladiny kreatininu v krvi před a po sběru moči (za 24 hodin) a srovnání s hladinou v nasbírané moči 5 Kreatinin Metoda stanovení Jaffého reakcí = reakce kreatininu a kyseliny pikrové v alkalickém prostředí za vzniku červenooranžového komplexu (známá od roku 1886) = není zcela specifická, reagují i další chromogeny (pyruvát, aceton, glukóza…) OH - + NO2 NO 2 HO NO 2 CH 3 - + NO 2 NO 2 O NO2 C = O N H N C H HN CH3 HN N C = O N H CH 2 Enzymové metody = založené na stanovení kreatinu z kreatininu účinkem kreatinikinázy kreatinin + H2O kreatinináza® kreatin kreatin + H2O kreatináza® sarkosin + močovina sarkosin + H2O + O2 sarkosinoxidáza® glycin + HCHO + H2O2 2 H2O2 + AAP + fenol POD® chinonmonoiminové barvivo + 4 H2O Obsah obrázku text Popis byl vytvořen automaticky 6 = přirozené žluté barvivo, vznikající rozpadem hemoglobinu üv krvi je většinou vázán na albumin = nekonjugovaný bilirubin üv játrech dochází ke konjugaci s kyselinou glukuronovou = konjugovaný bilirubin üfyziologicky je vylučován do žluče, při zvýšení koncentrace v krvi se vylučuje močí üfyziologická hyperbilirubinemie se objevuje kolem 3. dne života a mizí do konce 1. týdne üzvýšený konjugovaný bilirubin může indikovat uzávěr žlučových cest, hepatitidu, úraz jater, cirhózu, nežádoucí účinek léku nebo dlouhodobý abúzus alkoholu Bilirubin má v séru 3 frakce: ünekonjugovaný bilirubin = ve vodě nerozpustný, volně vázaný na albumin ükonjugovaný (přímý) bilirubin = mono /di-glukuronid, ve vodě rozpustný üdelta – bilirubin = kovalentně vázán na albumin amidovou vazbou Bilirubin Obsah obrázku text Popis byl vytvořen automaticky 7 Metoda podle Jendrassika a Grófa = bilirubin reaguje ve slabě kyselém prostředí s diazotovanou kyselinou sulfanilovou za vzniku červené formy azobarviva, přidá-li se alkalický roztok, vzniká modrá forma azobilirubinu Stanovení celkového bilirubinu = probíhá za přítomnosti akcelerátorů (směs kofeinu, benzoanu sodného a octanu sodného), protože nekonjugovaný bilirubin reaguje pomalu, akcelerátory uvolňují bilirubin z jeho vazeb na albumin a současně jej solubilizují Stanovení konjugovaného (přímého) bilirubinu = probíhá stejně, ale bez akcelerátorů Bilirubinometry – transkutánní měření hladiny bilirubinu bez nutnosti odběru krve a čekání na laboratorní rozbor = jemná a bezbolestná alternativa k tradičnímu vyšetřování žloutenky u novorozenců = přímé spektrofotometrické stanovení při dvou vlnových délkách: 454 a 540 nm Bilirubin Obsah obrázku text Popis byl vytvořen automaticky 8 = L-alanin:2-oxoglutarátaminotransferáza üenzym, obsažený převážně v cytoplazmě jaterních buněk (méně buňky srdečního svalu, ledvin…) üzvýšené hodnoty jsou typické pro poškození jater (virová hepatitis) a onemocnění žlučových cest ü Funkce = katalyzuje reverzibilní přenos aminoskupiny mezi L‑alaninem a 2‑oxoglutarátem üpři transferu aminoskupiny je žádoucí přítomnost pyridoxal–5´-fosfátu (P5P) jako koenzymu L-alanin + 2-oxoglutarát pyruvát + L-glutamát Doporučená metoda IFCC = fotometrické sledování rychlosti úbytku NADH měřením absorbance při 340 nm, kdy pyruvát redukuje NADH na L-laktát za katalýzy laktátdehydrogenázou (LD) Alaninaminotransferáza – ALT (EC 2.6.1.2.) pyruvát + NADH + H+ laktát + NAD+ ALT, P5P LD Aminotransferázy 9 = L-aspartát:2-oxoglutarátaminotransferáza üenzym, obsažený převážně v cytoplazmě a mitochondriích téměř všech buněk üzvýšené hodnoty jsou typické u jaterních chorob, při nekróze myokardu a u onemocnění kosterního svalstva ü Funkce = katalyzuje reverzibilní přenos aminoskupiny mezi L‑aspartátem a 2‑oxoglutarátem üopět se při transferu aminoskupiny využívá pyridoxal–5´-fosfátu (P5P) jako koenzymu L-aspartát + 2-oxoglutarát oxalacetát + L-glutamát Doporučená metoda IFCC = fotometrické sledování rychlosti úbytku NADH měřením absorbance při 340 nm, kdy oxalacetát redukuje NADH na L-malát za katalýzy malátdehydrogenázou (MD) Aspartátaminotransferáza – AST (EC 2.6.1.1.) oxalacetát + NADH + H+ malát + NAD+ AST, P5P MD Aminotransferázy 10 = fosfohydroláza monoesterů kyseliny o-fosforečné üenzym, který se stanovuje se při vyšetření jaterních nemocí nebo onemocnění kostí ünachází se zejména v jaterních buňkách (tvoří výstelku žlučových cest) a buňkách tvořících kost, dále bývá malé množství v placentě a ve střevech üvyskytuje se v několika izoformách – jaterní, kostní, placentární, střevní üjedná se o glykoprotein, který v aktivním centru obsahuje ionty Zn2+ üsvou aktivitu ALP vykazuje v alkalické prostředí při pH 9,8 - 10 ü Funkce = katalyzuje v alkalickém prostředí hydrolýzu monoesterů kyseliny o-fosforečné a katalyzuje přenos fosfátové skupiny na jiný alkohol za vzniku esteru (= transfosforylace) ük přenosu dochází nejen u vazeb P-O-C, ale také P-O-P, P-S a P-N üALP je schopna defosforylovat také některé fosfolipidy Celková aktivita ALP je dána součtem aktivit jednotlivých izoenzymů, pocházejících z různých orgánů a tkání Alkalická fosfatáza – ALP (EC 3.1.3.1) 11 Doporučená metoda IFCC = fotometrické stanovení 4-nitrofenolu po hydrolytické přeměně 4-nitrofenylfosfátu v prostředí AMP pufru (2-amino-2-methyl-1-propanol) při pH 9,8– 10,0 - měření žlutého produktu při 405 -410 nm Další metody ü stejný princip, avšak jiný transfosforylační pufr – MEG (N-methyl-D-glukamin), DEA, Tris… ü použití jiného substrátu (1-naftylfosfát, glycerolfosfát) a jiných koncentrací ü reakce pak probíhá podle obecného schématu monoester kyseliny o-fosforečné + H2O alkohol/fenol + o-fosforečnan ALP Alkalická fosfatáza – ALP (EC 3.1.3.1) 12 = hlavní extracelulární ionty – reprezentují až 90% všech kationtů v plazmě üstanovují se k vyhodnocení rovnováhy elektrolytů a ke kontrole funkce ledvin üse změnami hladiny Na+ souvisí změny obsahu vody v těle (dehydratace, otoky…) üvyšší hladiny Na+ zvyšují riziko vysokého krevního tlaku (norma ± 140 mmol/l) Metody stanovení 1. Pomocí iontově selektivní elektrody ISE = nejčastější metoda s využitím skleněné elektrody 2. Plamenová emisní fotometrie = rutině se již nepoužívá, dříve velmi běžná, excitované atomy Na emitují spektra při 768 nm Sodné ionty Na+ 3. Spektrofotometrické stanovení - enzymatické = metoda je založena na aktivaci enzymu ß-galaktosidázy ionty sodíku a na hydrolýze chromogenního substrátu, rychlost hydrolýzy se měřila kineticky při 420 nm, dnes se nepoužívá Obsah obrázku interiér, plavidlo, vana, nádobí Popis byl vytvořen automaticky 13 = hlavní intracelulární ionty üstanovují se k vyhodnocení acidobazické rovnováhy elektrolytů či nemoci ledvin üpřes stěnu buňky difundují velmi pomalu a krvi je jejich koncentrace do 5 mmol/l Metody stanovení 1. Pomocí iontově selektivní elektrody ISE = nejčastější metoda s využitím iontově výměnné elektrody se zabudovaným valinomycinem 2. Plamenová emisní fotometrie = rutině se již nepoužívá, dříve velmi běžná, excitované atomy K emitují spektra při 589 nm 3. Spektrofotometrické stanovení - enzymatické = metoda je založena na aktivaci vhodného enzymu ionty draslíku, například: fosfoenolpyruvát + ADP pyruvát + ATP pyruvátkináza, K+ pyruvát + NADH + H+ laktát + NAD+ LD absorbance se stejně jako u jiných optických testů měří při 340 nm. Draselné ionty K+ 14 = hlavní extracelulární anionty (cca 60% z frakce anorganických aniontů) üse stanovením dalších iontů jde o běžnou součást rutinního vyšetření pro diagnostiku poruch v koncentraci iontů nebo v acidobazické rovnováze (norma ± 100 mmol/l) üobsah chloridů kolísá vlivem dehydratace, zvracení, průjmů nebo hormonálního působení üvedle krve se stanovují se také v potu a slouží při diagnostice cystické fibrózy Metody stanovení 1. Pomocí iontově selektivní elektrody ISE = jedná se o iontovou výměnu mezi kvarterní amoniovou solí z membrány elektrody a chloridy 2. Coulometrické stanovení = jedná se o generaci stříbrných iontů Ag+ ze stříbrné elektrody, které reagují s přítomnými Cl- za vzniku nerozpustné sraženiny, kdy obsah chloridů je přímo úměrný času, který se měří 3. Fotometrické stanovení = dnes už se nepoužívá, šlo o reakci chloridů s thiokyanatanem rtuťnatým za vzniku chloridu rtuťnatého, kdy uvolněný thiokyanatan reagoval s Fe3+ za vzniku červeného komplexu Chloridové ionty Cl- 15 Obsah obrázku interiér, ovoce, stůl, jídlo Popis byl vytvořen automaticky üjejí stanovení se provádí k diagnóze a sledování cukrovky (diabetes mellitus) ühladina glukózy v krvi (= glykémie) je hormonálně udržována ve stálém úzkém rozmezí üprodukce inzulínu hladinu glukózy snižuje, glukagon naopak hladinu glukózy zvyšuje přeměnou jaterního glykogenu üreferenční rozmezí glukózy v krvi: 3,5 – 6 mmol/l ühodnota nad 7,0 mmol/l dg. diabetes mellitus Funkce = slouží v těle pro všechny buňky jako hlavní zdroj energie ü pro mozek a nervový systém je jediným zdrojem energie Stanovení glukózy üna lačno (min 8 hodin bez jídla), sledování glykemického profilu üpřímo po podání známého množství glukózy, tzv. orální glukózový toleranční test (= oGTT) = stanovení glukózy v čase 0 a pak v čase 120 min po vypití nápoje se 75 g glukózy hladina vyšší než 11 mmol/l diabetes mellitus Glukóza 16 Metody stanovení = enzymové metody s využitím GOD (glukózaoxidázy), HK (hexokinázy) nebo GDH (glukózadehydrogenázy) 1. Stanovení oxidační kopulací s GOD a POD üv praxi nejrozšířenější üspektrofotometrické stanovení je založeno na oxidaci glukózy vzdušným kyslíkem katalyzované GOD na D-glukonolakton a H2O2, který se dále využívá k oxidační kopulaci 4-aminoantipyrinu s derivátem fenolu za katalýzy POD na chinonmonoiminové barvivo β-D-glukóza + O2 β-D-glukonolakton + H2O2 H2O2 + 4-aminoantipyrin + fenol chinonmonoiminové barvivo + H2O GOD POD üprvní reakce je specifická, druhá může být rušena redukujícími látkami (např. kyselina askorbová, bilirubin, kys. močová) Glukóza 17 Metody stanovení = enzymové metody s využitím GOD (glukózaoxidázy), HK (hexokinázy) nebo GDH (glukózadehydrogenázy) 2. Stanovení hexokinázou HK üpo deproteinaci vzorku se používá v referenčních metodách v klinických laboratořích üglukóza je v přítomnosti adenosintrifosfátu (ATP) fosforylována pomocí enzymu HK na glukóza-6-fosfát, který se v přítomnosti NADP+ oxiduje na glukonolakton-6-fosfát, kdy současně dochází k redukci NADP+ na NADPH za katalýzy glukóza-6-fosfátdehydrogenázy (G6PD), spektrofotometricky se stanovuje NADPH při 340 nm glukóza + ATP glukóza-6-fosfát + ADP glukóza-6-fosfát + NAD+/NADP+ glukonolakton-6-fosfát + NADH/NADPH HK G6PD üprvní reakce není specifická a reagují u ní všechny hexózy, avšak druhá reakce je specifická pouze pro fosforylovanou glukózu Glukóza 18 Metody stanovení = enzymové metody s využitím GOD (glukózaoxidázy), HK (hexokinázy) nebo GDH (glukózadehydrogenázy) 3. Stanovení glukózadehydrogenázou GDH ümálo využívaný přístup üglukóza je oxidována v přítomnosti NAD+ pomocí glukózadehydrogenázy na glukonolakton za současné redukce NAD+ na NADH a absorbance se sleduje při 340 nm β -D-glukóza + NAD+ β -D-glukonolakton + NADH GDH Metoda využívaná v minulosti před enzymovým stanovením = reakce glukózy s o-toluidinem, kdy se v kyselém prostředí ledové kyseliny octové po zahřátí fotometricky měřilo modrozelené zbarvení üpodobně reagují i galaktóza a manóza, ale protože nejsou přítomny v biologických tekutinách, bylo stanovení pro glukózu specifické üproblémem byla agresivita chemikálií, nutnost varu a deproteinace Glukóza 19 = hexapeptid s jednou molekulou glukózy neenzymově navázanou na valin = glukosa–val-his-leu-thr-pro-glu üslouží jako parametr k posouzení diabetu mellitu a ke kontrole účinnosti léčby üglukóza se v krvi spontánně ireverzibilně váže na proteiny včetně hemoglobinu A a přetrvává na něm po celou dobu životnosti červených krvinek (cca 120 dní) üpři dlouhodobě vyšší koncentraci glukózy je v krvi přítomno větší procento glykovaného hemoglobinu HBA1c a tato hladina se téměř nemění üHBA1c se stanovuje v celé nesrážlivé krvi jako podíl z obsahu celkového hemoglobinu ü ü Vznik HBA1c Obsah obrázku text Popis byl vytvořen automaticky Glykovaný hemoglobin (HBA1c) 20 HPLC/ESI/MS a HPLC/CE = po enzymovém rozštěpení hemoglobinu se pomocí HPLC rozdělí N-terminální glykované a neglykované hexapeptidy a nasbírají se frakce, které jsou dále analyzovány kapilární elektroforézou se spektrofotometrickou detekcí nebo identifikovány pomocí ESI-MS Metody stanovení = stanovení se provádí afinitní kapalinovou chromatografií, iontově-výměnnou kapalinou chromatografií, imunologicky nebo elektroforeticky - dnes je čím dál častější využití analyzátorů pro přímé stanovení HBA1c Obsah obrázku elektronika Popis byl vytvořen automaticky Glykovaný hemoglobin (HBA1c) 21 = albumin (cca 50%) + globuliny (α, β a γ – globuliny) üstanovení celkové bílkoviny patří mezi základní biochemická vyšetření üinformuje o stavu výživy a chorobách ledvin, jater a dalších stavech üpoměr A/G, který by měl být mírně vyšší než 1, pomáhá v dalším rozhodování üpro přesnější stanovení diagnózy jsou pak prováděna další specifická vyšetření (stanovení koncentrace albuminu, jaterních enzymů, elektroforéza bílkovin krevního séra apod.) Albumin = jeho hlavní rolí je transport malých molekul v těle a udržování tekutiny uvnitř krevního řečiště Globuliny = zahrnují různé enzymy, protilátky (imunoglobuliny) apod. Celková bílkovina 22 Metody stanovení 1. Metoda s biuretovým činidlem = referenční metoda = fotometrické stanovení, které poskytují bílkoviny díky vazbě –CO-NH- s alkalickým roztokem měďnatých iontů Cu2+, měří se červenofialový komplex při 540 - 550 nm biuretové činidlo = NaOH, vinan sodno-draselný, síran měďnatý a jodid draselný Obsah obrázku stůl, vsedě, voda, sklo Popis byl vytvořen automaticky CO(NH2)2 HN(CONH2)2 + Cu2+ OH- 180 O C HN H2NCO H2NCO HN H2NCO Cu 2+ NH OCNH2 NH H2NCO OCNH2 OCNH2 OCNH2 Nevýhody: üv analyzátorech se kalibrace provádí na čistý bovinní albumin, což může vnášet chybu 2 – 5 g bílkoviny/l üdetekční limit kolem 2 g/l je použitelný pro sérum, avšak nelze metodu použít pro stanovení v moči nebo likvoru Celková bílkovina 23 Obsah obrázku text Popis byl vytvořen automaticky Metody stanovení 2. Metoda s benzethonium chloridem = celková bílkovina reaguje s benzethonium chloridem za vzniku zákalu, který se měří turbidimetricky při 505 nm üvhodná pro stanovení celkové bílkoviny v moči a likvoru 3. Kjeldahlova metoda = historicky nejstarší metoda stanovení celkové bílkoviny = dochází k mineralizaci vzorku s kyselinou sírovou a vydestilování amoniaku do předlohy s kyselinou, kde dojde k přeměně bílkovinného dusíku na amonnou sůl, jejíž koncentrace se stanoví titrací pomocí hydroxidu sodného Celková bílkovina 24 = protein akutní fáze, jehož koncentrace se zvyšuje zejména při bakteriální infekci v těle ütvoří se v játrech a je vylučován do krevního oběhu ümá schopnost srážet C-polysacharid pneumokoků üjeho koncentrace narůstá již po pár hodinách po vypuknutí zánětu a kulminuje během 1-3 dnů, kdy může dosahovat až tisíc mg/l ük monitorování průběhu zánětu při různých zánětlivých a autoimunitních onemocněních ük předpovědi rizika vzniku kardiovaskulárních onemocnění, srdečního infarktu a mrtvice Metody stanovení Imunoturbidimetricky s latexovými částicemi = CRP tvoří se specifickou protilátkou imunokomplex a měří se turbidita při 340 nm ücitlivost metody se uvádí 1 mg/l CRP + Ab {CRP-Ab}¯ Obsah obrázku elektronika, kolík Popis byl vytvořen automaticky C-reaktivní protein CRP 25 = glykoproteinový hormon přítomný v krvi a moči během těhotenství üobjevuje se již asi 8. den po oplodnění vajíčka a nejvyšší hladina hCG bývá 8.- 10. týden üpomáhá sledovat vývoj těhotenství a diagnostikovat mimoděložní těhotenství, selhávající (patologické) těhotenství, případně sledovat ženy po potratu üdále se stanovuje při diagnostice trofoblastických chorob a tumorů zárodečného původu Metody stanovení Metody RIA (Radioimmunoassay) a ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) = pro kvantifikaci hCG v séru Lidský choriogonadotropin hCG HCG ELISA kit | CE-GMP | 818-591 3030-USA. 26 Metody stanovení v moči Test diagnostickým proužkem s koloidním zlatem – binární metoda ANO/NE Sorbovaná AuAb1 Nasákavá vrstva Směr difuze vzorku Kotvené Ab2 Ab3 Plastová podložka Vzorek směr nasávání vzorku Místo koloidního zlata může být primární protilátka značena i jinak, např. organickým barvivem. Pak zbarvení na kotvených zónách závisí na druhu použitého barviva. AuAb1 + �-Ab3 ® �-Ab3-Ab1Au (negativní kontrola) hCG + AuAb1 ® {AuAb1-hCG} (pozitivní reakce) {AuAb1-hCG} + �-Ab2 ® �-Ab2-{hCG-Ab1Au} (červený proužek) pozitivní negativní Lidský choriogonadotropin hCG 27 www.labtestsonline.cz Literatura a zdroje informací ØChromý, Vratislav a kol.: Bioanalytika – Analytické metody v klinické chemii a laboratorní medicíně, Ústav chemie PřF MU, Brno, 2011. Obsah obrázku klipart Popis byl vytvořen automaticky ØZima, Tomáš a spol.: Klinická a toxikologická analýza, skripta pro potřeby kurzu, VŠCHT, 2008 ØRacek a kol.: Klinická biochemie, Galén / UK v Praze, nakladatelství Karolinum 1999 ØDastych, M. a Breinek, P.: Klinická biochemie – bakalářský obor Zdravotní laborant skripta LF MU, Brno 2015 28