anorganické monolity Pokročilá kapalinová chromatografie OffJ Jiří Urban, Ústav chemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno, urban@chemi.muni.cz nový typ stacionárních fází Plněná kolona ••••^^^•••••••••••••äC Celková porozita: 80 % Mezi částicemi: 40 % Uvnitř částic: 40 % Pracovní tlak, účinnost vs. rychlost, hledání kompromisu. Nižší variabilita! nový typ stacionárních fází Plněná kolona Celková porozita: 80 % Mezi částicemi: 40 % Uvnitř částic: 40 % Pracovní tlak, účinnost vs. rychlost, hledání kompromisu. Nižší variabilita! Monolitická kolona Celková porozita: 70 % Mezi částicemi: 60 % Uvnitř částic: 1 0 % světové monolity první monolitická fáze Filtrační papír Separace aminokyselin Lueciiie Glycine Glutiniiie Tryptophan Proline www.ca pita la na lytica l.com D.L Mould, R. Synge 50. léta 20. století J. Knox - late 1 960s-l 970s S. Hjertén, F. Svec, J.M.J. Fréchet N. Tanaka www.ecronicon.com monolitické stacionárni faze 00019036 10 pm MERCK REM-Tcam J. Sep. Sci. 27 (2004) 843. monolitické stacionární fáze J. Sep. Sci. 27 (2004) 843. monolitické stacionární fáze Průtočné póry Skeleton 1 — 2 jim, 60 %, mechanická stabilita, 80/ KF ~ 1 jim, póry 1 0 — 25 nm, 20 % 300 m2/g/ fázový poměr, k J. Sep. Sci. 27 (2004) 843. monolitické stacionární fáze Průtočné póry Skeleton 1 — 2 jim, 60 %, mechanická stabilita, 80/ KF ~ 1 jim, póry 1 0 — 25 nm, 20 %, 300 m2/g/ fázový poměr, k J. Sep. Sci. 27 (2004) 843. příprava anorganických monolitů Startinig Sol / °x .o /Si ° "o / I JSA Tetrametoxysilan (TMOS) Tetraetoxysilan (TEOS) O x H3C OH Kyselina octová (0.01 M) Kyselá hydrolýza alkoxysilanů v přítomnosti interního polymeru (PEO). Probíhá v ledové lázni, do zgelovatění. Alkoxy skupina je někdy nahrazena silanolovou skupinou s metanolem nebo etanolem. / Polyakrylová kyselina (PAA) Polyetylén oxid (PEO) Vliv na velikost a koncentraci průtočných pórů Málo porogenu — póry nejsou spojené. Hodně porogenu — dochází ke vzniku částic príprava anorganických monolitu 0 1 2 3 4 5 Pore Diameter, Dp / jjm Vliv na velikost a koncentraci průtočných pórů Málo porogenu — póry nejsou spojené. Hodně porogenu — dochází ke vzniku částic příprava anorganických monolitů Startinig Sol / / Tetra metoxys i la n (TMOS) 0 "o Tetraetoxysilan (TEOS) "OH Polyetylén oxid (PEO) Phase Separation and Gelation Dochází k polykondezaci, fázové sepraci, precipitaci a vzniku nerozpustného produktu. Fázová separace Dramatický růst viskozity („tuhnutí" skla). v CF I V «VA F _ I - ~\F F - F V_ -\F F . im pozdější nastup zgelovatem, tím vetsi se vytvorí průtočné póry. S rostoucí dobou polymerace dochází ke zpomalení jejího průběhu. příprava anorganických monolitů Startinig Sol / / Tetra metoxys i la n (TMOS) 0 "o Tetraetoxysilan (TEOS) "OH Polyetylén oxid (PEO) Phase Separation and Gelation Aging and Solvent Exchange 0.01 M vodný roztok hydroxidu amonného 80 °C — póry 14 nm 1 20 °C — póry 25 nm Fázová separace Zrání gelu V průběhu zrání gelu (~ několik dní) dochází k tvorbě větších mesopórů v původním mikroporézním materiálu Malé molekuly ~ 1 0 nm ■ Proteiny 20 - 30 nm Vliv pH prostředí a teploty zrání příprava anorganických monolitů i-1-1—i—i—i—i-]-1-1-1-1-1—i—i—r Pore Diameter, Dp / nm Vliv pH prostředí a teploty zrání V kyselém prostředí se póry netvoří a vyšší teplota rozšiřuje jejich distribuci. příprava anorganických monolitů Vliv teploty zrání Temperature [°C] Efficiency [plates/m, RSD%] Total porosity, £j Permeability, K[xl0_14m2] Separation impedance 40 5000[25%] 0.970 10.55 379,000 42 74,000 [12%] 0.957 3.24 5640 43 95,000 [8%| 0.936 3.40 3260 44 86,000 [8%] 0.929 3.25 4160 Chromolith 98,000 0.924 8.66 1200 40 °C 43 °C J. Chromatogr. AI 217 (2010) 5737-5740. příprava anorganických monolitů Startinig Sol / / Tetra metoxys i la n (TMOS) 0 "o Tetraetoxysilan (TEOS) "OH Polyetylén oxid (PEO) Phase Separation and Gelation Aging and Solvent Exchange Evaporation Drying Fázová separace Zrání gelu Sušení gelu Gel musí být usušen velmi opatrně, aby nedošlo k jeho porušení. v im vice malých poru, tím pomalejší a pozvolnější proces (~ 20 nm). Je nutné ve vzniklém monolitu eliminovat velmi malé mikropóry. „Skoupá" literatura, někteří autoři to popisují jako jeden z nejdůležitějších kroků, jiní to ani nezmiňují. h-j* 'í\ £v\l' ?! Příklad: Chromolith (L = 5 cm) schne asi měsíc \ * i. příprava anorganických monolitů Startinig Sol / / Tetra metoxys i la n (TMOS) 0 "o Tetraetoxysilan (TEOS) "OH Polyetylén oxid (PEO) Phase Separation and Gelation Aging and Solvent Exchange Fázová separace Zrání gelu Evaporation Drying - 60 °C po dobu tří dnů 600 °C po dobu dvou hodin Vznik bimodální porézní struktury Sušení gelu wĚ/Ě Tepelná úprava příprava anorganických monolitů Startinig Sol / / Tetra metoxys i la n (TMOS) 0 "o Tetraetoxysilan (TEOS) "OH Polyetylén oxid (PEO) Phase Separation and Gelation Aging and Solvent Exchange Evaporation Drying tit Fázová separace Meso-& Micropores Zrání gelu Interconnected Macropores Volume : <1.5 cm3g-1 Volume : 0.2 -2 cm3g-1 Diameter: 0.1 -10 urn Vznik bimodální porézní struktury Sušení gelu Tepelná úprava monolitické stacionární fáze J. Sep. Sci. 27 (2004) 843. distribuce pórů U) co E o >° CD E _g o > Q) i_ O CL 0 "I-1 I I I 1111-1-1 I I I lili-1-1 I I I Mil-1-1 I H I III-1-1 I I I III Průtočné póry Mesopóry 1 i_■ I I 1 I lil_I_I I I 1 Mil ------' Q'»».»»ocdooooI J_' I I I lili_I_I I.....I_ ■ ■ I 1111 50 40 30 10 0 0.001 0.01 0.1 1 10 100 O) (D E Z> co ô E > o (D 20 *2 O) o CL E "D b Pore Diameter, dD I £/m zapouzdření (cladding) PTFE (Polytetrafluorethylen) PEEK (Polyether ether keton) 20 MPa, pozor na THF Alternativně připravit „radiáln monolity. J. Sep. Sci. 27 (2004) 843. povrchu Stejné jako u normálního silikagelu. Monolitická fáze je ponořená do reakčního roztoku C18 ■ octadecyldimethyl-tyN-diethylaminosilan Endcaping (volné silanolové skupiny) ■ Modifikace Hexamethyldisilazanem a N-(trimethylsilyl)imidazolem pro bazické látky a látky vytvářející vodíkové můsky ■ Promýt 2 h s TMSI v suchém ACN při 60 °C HILIC kolona 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine 8 7 6 5 > E4 > 3 2 o C_ h- O CL Q O OJ c '-a "i_ 0) c ■v Q. Cl n CL H D 4 6 t [min] Separace nukleosidů a nukleotidů 10 J. Chromatogr. A 1 373 (2014) 90-96. 1871 vnitřní struktura Spojování kolon Dominantní průtočné póry Využití nízkého tlakového spádu Neuspokojivé výsledky (|s0 Radiální heterogenita Mechanická a termální (hodně reakcí) Elektronový mikroskop vs. permeabilita l Nutná kontrola přípravy (b) IaccV Spot Magn Dot WD ÉKp 1— —1 10 |im w IlUUkV 4 0 4bl2x St 2 0 0 XL30ShbCi U1382 Acc V Spot M.iqn 10 0 kV 4 O 38 ••••S4 radiální heterogenita, úprava směsi (matematické) modely Unit element Stationary phase skeleton Through-macropore Unit element element H — Hax + Hf + Hc Podélná difúze ■ Mass transfer Difúze v pórech 2DL Up 2t/p (1 -€e)(/g55/2&f)[€r + (l -€i)Krf [6C+(1 -€e)[eř+(l -OřJl2 (1 -€e)(^s/^e)[€/ + (l -g|)^ať [ce + d - ee)[€/ + (1 - ce)Ka]]2 Radius (P ) - určeno pomocí SEM J. Phys. Chem. B 106 (2002) 8898. Náhodné uspořádání propojených válců porézního silikagelu obklopené kruhovými průtočnými póry. (matematické) modely Síť válcovitého skeletonu. Všechny domény jsou stejné, skelet je tvořen krátkými válcovitými trubičkami umístěnými do tetraedru. Průtočné póry jsou vše ostatní. rekonstrukce struktury Konfokální mikroskopie a rekonstrukce pomocí zobrazovacích techn Vliv experimentálních podmínek ■ Rostoucí koncentrace katalyzátoru ■ Jiná koncentrace polyethylenoxidu ■ Jiná aditiva Chromatogr. A 1 1 1 9 (2006) 95. specimen rekonstrukce struktury fluidní dynamika Skeleton + Průtočný pór ^dom Odpovídá Velikosti Částic V plněných kolonách (Pro vy$oce homogenní monolit) ~ 60 % podélná difúze J. Chromatogr. A 1 030 (2004) 177. permeabi lita Definována velikostí, tvarem a distribucí průtočných pórů 00019036 10 \im MERCK «E«-it«n Strukturní charakteristika F3 (1 - «o)2 / - délkový parametr odpovídající velikosti, distribuci a zakřivení průtočných pórů Ekvivalentní velikost částic (permeabilita) 3 U sf perm 180^mD(l - Éb)2 L Ekvivalentní velikost částic (disperze) "disp i [6b + e JI - effC— p b 211/2 éd2(1 - eh)m2 Anal. Chem. 2002, 74, 2470-2477., J. Sep. Sci. 2003, 26, 1005-1016. účinnost Monolitické (silikagelové) fáze Účinnost: 3 — 5 |um částice Permeabilita: 5 — 10 |um částice Rychlá analýza? Krátká kolona, malé částice/doména Účinná separace? Větší doména, větší částice 30 | -*-»' .9 20 a) X 1 CL O o Jak zlepšit účinnost (monolitických) kolon? 1) lepší radiální hustota (homogenita) 2) snížit průměr pórů a skeletonu (nevýhoda nižší KF) 3) snížit rozptyl ve velikostech skeletu plněná O O monolit 12 3 4 Linear Velocity, u I mm s*1 vnitřní struktura druhá generace 1st generation T generation Flow 5x10 4x10 3x10 c O 2x10 1x10 1" generation 2" generation /7(Mm) k 4 88 2.61 492 261 4 76 2 73 ft 333 290 3.34 288 3.35 2 92 1 generation generation 10 15 Chord length (pm) 20 3 3 2.5 2.0 ~ď 1.5 í li -C: 1.0 0.6 * * • 1" generation 2 generation 3 4 (; (mm/s) * * * B _l_J_L_I_J_L_L_ _i_I_J_í_I_J_L_J_ 10 ľ= u d ID 15 2ü J. Chromatogr. Al 303 (201 3) 28-38. druha generace Inverzní chromatografie sférické výluky Monolithic column 1G 2G Vo (cm3) r0 {fim) J Průtočné póry Vrl![nm) ] Mesopóry o Rozptyl X2 V>Up (nm) 1.225 ±0.011 ^54^>J= 0.280 0.265 ± 0.007 0.326 0.093 3.465x 10"5 8.810 1.160 ±0.007 ^94g>t 0.075 0.343 ± 0.008 0.318 0.120 6.659 x 10-5 8.882 ■10 c pare diameter [A] J. Chromatogr. A 1 359(201 4)1 1 2-1 1 6. druhá generace Snížení velikosti domény & zmenšení průtočných pórů & zlepšení homogenity 1 Lim 2 Lim www.americanpharmaceuticalreview.com druhá generace _ 3(H CL LU 100 x 4.6 mm 1" Generation 100 x 4.6 mm new research sample 50 x 2.3 mm new research sample 3 u [mm/s] www.americanpharmaceuticalreview.com vliv podélné difúze 0 3 6 9 us [mm/s] www.americanpharmaceuticalreview.com kinetic plot 3 4 5 6 7 8 log N druhá generace 10 •1 101 10 N 10^1 10 10' Sub-2 i^m technology 2004 (1000 bar) Core-shell technology 2006 (400 bar) 10 New Monolithic columns 2011 (200 bar) Monolit ~ Sub-2 jini t!=0.72 cp I-1-1—Pr N-16000 10s 101 10 100 s 10 10J 10" 10* N 10! www.americanpharmaceuticalreview.com impedance kolony E = N2 r] KF tM Ap H2 ■ Plněné kolony 3000 ■ Monolity 250 - 800 ■ OTC 32 (maximum) Vztah mezi rychlostí analýzy (tM), účinností (N), pracovním tlakem (Ap) a viskozitou mobilní fáze [ľ]) Zvýšení impedance kolony 1) nižší viskozita mobilní fáze (zvýšení pracovní teploty) 2) vyšší tlak (spojení kolon) 3) redukce heterogenity stacionární fáze (radiální i domény) a velikosti domény 4) nižší KF (zvýšení objemu průtočných pórů, pozor na mechanickou stabilitu) cytochrom c, digest 3 jLim Porézní 2.7 jLim Core-shell Monolit O 2 4 G 8 10 O Retention Factor * ŕ • 10 7 ■ + 0.25 Lil/min 0.50 lil/min 1.00 |il/min jlJjlL /00 ^l/min 4.00 |ll/min e ) r 246S 10 0 2 4 G81Ü Retention Factor Retention Factor J. Chromatogr. A 1 228 (201 2) 270-275. 1 000 000 pater 100 200 300 Time (min) Anal. Chem., 2008, 80, 8741-8750. „ Science is organized knowledge. Wisdom is organized life. " Immanuel Kant