MONOLITY Pokročilá kapalinová chromatografie ÍC1ÍÍI Urban, Ustav chemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno, urban@chemi.muni.cz 7533 SVĚTOVÉ MONOLITY RADIKÁLOVÁ POLYMERACE HISTORIE 2-hydroxyethyl-methakrylátové gely 22% vodný roztok Nízká permeabilita (4 ml/h) Nízká účinnost Polyuretany ■ Polyurethanové pěny s otevřenými póry připravené napěněním in šitu ■ Silikagel Ross W. D., Jefferson R. T.: J. Chrom. Sei. 8, 386 (1970). Hansen L. C, Sievers R. E.: J. Chromatogr. 99, 123 (1974). Kubín M., Špaček P., Chromeček R.: Collect. Czech. Chem. Commun. 32, 3881 (1967). www.tipnavylety.cz STLAČENÉ GELY Vliv průtoku mobilní fáze 0.50 0.25 0.12 Polymerace vodného roztoku N,N'-methylenebis-akrylamidu a kyseliny akrylové v přítomnosti anorganické soli, nejčastěji síranu amonného Stlačení na méně než 10 % původního objemu Separace bílkovin v iontově-výměnném módu (neočekávané) zvýšení permeability po stlačení gelu Lineární gradient 2.25 - 0.25 M síran amonný ■ myoglobin (M) ■ ribonuclease (R) ■ ovalbumin (O) ■ a-chymotrypsinogen A (C) ■ phycoerythrin (P) 0 10 20 30 (min) a 0 4 S (min) J. Chromatogr., 473 (1 989) 273., J. Chromatogr. 586 (1 991) 21 -26. MEMBRÁNOVÁ CHROMATOGRAFIE Pro separace vysokomolekulárních látek je potřeba velmi krátká kolona (B.G. Belenkii) O HoC O 7 CH-. O Glycidyl metakrylát h3c O O' O Ethylen dimetakrylát 0 Reaktivní povrch Propane sutphone-NaOH " -C^—;CH2 O Diethyl amine R—OH NoOH I-—CH-CH, I I OH O-lCHa)3--SO, I-CH-CHj-N-(CHa-CHjJj -O-R OH CM-CH,- I OH 5400x J. Chromatogr. 555 (1 991) 97-1 07. MEMBRÁNOVÁ CHROMATOGRAFIE Piu suuuiulu vysukuinulukuluiiiilIi luluk |u uuliuuu vuhiii kiulku kuluiiu (D.G. Buluiikii) O H2C O 7 CH- O Glycidyl metakrylát ch. h3c O O' ch- ch- O Ethylen dimetakrylát 0 Reaktivní povrch Propane sutphone-NaOH " -C^—;CH2 O Diethyl amine R—OH NoOH I-—CH-CH, I I OH O-lCHa)3--SO, I-CH-CHj-N-(CHa-CHjJj -O-R OH CH-CH,- I OH 5400x J. Chromatogr. 555 (1 991) 97-1 07. MEMBRÁNOVÁ CHROMATOGRAFIE Piu suuuiulu vysukuinulukuluiiiilIi luluk |u uuliuuu vuhiii kiulku kuluiiu (D.G. Buluiikii) O H2C O 7 CH- O Glycidyl metakrylát ch. h3c O O' ch- ch- O Ethylen dimetakrylát 0 Reaktivní povrch Propane sutphone-NaOH " -C^—;CH2 O Diethyl amine R—OH NoOH I-—CH-CH, I I OH O-lCHa)3--SO, I-CH-CHj-N-(CHa-CHjJj -O-R OH CH-CH,- I OH 5400x J. Chromatogr. 555 (1 991) 97-1 07. MEMBRÁNOVÁ CHROMATOGRAFIE Vliv složení polymerační směsi (rostoucí koncentrace GMA) 600 t- Pressure, MPa Separace bílkovin Membrána 1 x 20 mm (1) Myoglobin (2) Ovalbumin (3) Ribonucleáza A (4) Lysozym (5) Chymotrypsinogen -I-1-I-u 30 20 10 0 Time (min J. Chromatogr. 555 (1 991) 97-1 07. POLYMERNÍ MONOLITY O CH3 O Glycidyl metakrylát ch2 o Ethylen dimetakrylát Cyklohexanol Dodekanol Azobisisobutyronitril 6 h při 70 °C 30 x 8 mm Chromatografie iontové výměny modifikováno (diethylamino)hydroxypropylem E 1.00 2.00 3.00 4.00 x 101 minutes Anal. Chem. 64 (1992) 820-822. RADIKÁLOVÁ POLYMERACE Fáze polymerace Azobisisobutyronitril 1) Iniciace n. 2) Propagace A N n 3) Terminace Teplotou iniciovaná polymerace UV zářením iniciovaná polymerace POLYMERNÍ MONOLITY Modifikace vnitřní stěny Kapilára Iniciace uv, z... Monolitická kapilární kolona Polymerační směs ■ Funkční monomery (ST, CMS, BMA, GMA, ■ Síťující monomery (DVB, EDMA, ...) ■ Porogenní rozpouštědla (alkoholy, ...) ■ Iniciátor (AIBN, benzofenon) azobisisobutyronitril benzofenon ••) Polymetakryláty Styren-divinylbenzen DVB (B)MA EDMA T Styren ROBUSTNOST MONOLITŮ Digest šesti proteinů, monolit 250 mm Izokratická separace malých molekul Intens x107 5 000 0 20 40 60 80 100 120 Time (min) J. Chromatogr. A,1217 (2010) 6610-6615. r 0 Stabilní a reprodukované výsledky (stále ale pouze výzkumné laboratoře) 24 024 024 Time, min Fenol (1), toluen (2), and thiomočovina(3) v 98% ACN, průtok 1 0 nl/min. J. Sep. Sci. 201 3, 36, 2806-281 2 DISTRIBUCE PÓRŮ 6 - 1 10 100 1000 Pore diameter, nm Dramaticky jiná porézní struktura a distribuce pórů Chem. Mater. 1 995, 7, 707-7] 5. PORÉZNÍ VLASTNOSTI Rtuťová porozimetrie Chromatografická porozi 8 4 - -1—i i i n 1 10 100 1000 10000 Pore diameter, nm Chem. Mater. 7 (1 995) 707. Suchý vs. nabobtnaný stav Porozita, aktivní povrch, distribuce pórů 0.9- ü) 0.8 H o L. o a "rô 0.7-o Chromatografie i 06- Rtuťová porozimetrie 10 —r— 20 -i— 30 -1— 40 Monomers [%] vs. J. Chromatogr. A 11 82 (2008) 161 - 1 68. KONTROLA MORFOLOGIE 2 DOMINANTNÍ PRŮTOČNÉ PÓRY MAKROPORÉZNÍ MONOLITY Monolit Polymer C8 Silikagel 50 x 4.6 mm 1 50 x 4.6 mm, 1 0 |J,m 1 50 x 4.6 mm, 5 |J,m Peptidy Proteiny (a) 1 J 2 ^ u (b) Nízký pracovní tlak 1 Rychlý průtok mobilní fáze (c) ( : Jl_ 40 2 4 0 KííiĽiitiuii [íjíIí'. min 1 0 líiti ľ Monolit 0 5 10 J. Chromatogr. A 865 (1 999) 1 69-174. Flow rate, raIVmin -»-1-«—■ 0 0,5 Ketention tíme, min 1 0 10 20 Ret en í km timeT s Rychlé gradientově separace VLIV MALÝCH PÓRŮ Gradientova eluce malých molekul A 12 3 4 t [min] J. Sep. Sci. 29 (2006) 1 064 - 1 073. E. COLI DIGEST 1 m monolit, piková kapacita 1038 100 200 300 400 Time (min) 500 600 J. Chromatogr. A,l 21 7 (201 0) 661 0 - 661 5. MONOLITICKÉ STACIONÁRNÍ FÁZE Anorganické monolity Organické monolity malé molekuly velké molekuly 0 00 0 25 0 50 0 75 1 00 1 25 1 50 1 75 0 00 0.25 0 50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 Time, min Time, min KONTROLA VLASTNOSTÍ Polymerační teplota Cas polymerace Složení polymerační směsi Funkční monomer Síťující monomer Porogenní rozpouštědla Modifikace povrchu Chemická Grafting Kompozitní materiály Planární uspořádání TEPLOTA POLYMERACE 15 CL 10 I < Í 5 10 100 1000 Póre diameter, nm 10000 Vyšší teplota I Víc radikálů I Víc center polymerace I „Hustší" monolit I Menší póry Chem. Mater. 1 995, 7, 707-7} 5. TEPLOTA POLYMERACE Povrch & Objem pórů Distribuce pórů 50 80 70 80 00 100 1 10 100 1000 10000 Polymerization temperature, "C pore diameter, nm Macromolecules 28 (1 995) 7580 - 7582. Chem. Mater. 1 995, 7, 707-7\5. KONVERZE POLYMERAČNÍ REAKCE 100+■ 90 7; 2; 100 75 50 25 L 0 0.5 1 2 3 6 ■ etylen dimetakrylát ■ butyl metakrylát 0 l.** 100 - .O O 50 - • styren (•) ethylstyren (□) divinylbenzen (o) glyddyl metakrylát ethylen dimetakrylát 1.0 0.9- 0.7- Li.fi 0.5 (a) Celková porozita 1 ■ 0 : 01 0 * 0 • uracil 0 • * konverze 0 • 1 ____°_°____l --1-1-1-1-1-1-1-1-1-1 10 20 30 40 50 -1-'-1-1—1— 2 3 4 6 8 10 20 40 0 1000 2000 Polymerization time, min 8- 7- e- f 7 5 O 1- 4 ■4—* Ľ, n 3- D 2 - n 1 - 0- Polymerisation tíme, h J. Chromatogr. A 1217(2010)7514-7522. | J. Chromatogr. A 1217(2010)5389-5397 (b) 1 Permeabilita —1—1—1—1—1—t—j— 10 20 30 40 Polymerization time, h 5; KONVERZE POLYMERACNI REAKCE Morfologie a kvalita separace poly(styren-co-divinyl benzen) 3 h 48 h Macropores Mesopores Less cross-linked polymer; f 400 nm < (ľ m (a) 3 A 0V> 3 h I i 1 < ' I ' I 1 I 1 i I i I i I i I i I i I I 0 2 4 6 8 10 12 14 15 18 20 22 24 3^ 8 ; c (b) (1) 48 h [2> (3) (4) (5) (C) ;7' 1 i 1 I ' I.....i 1 i 1 i 1 i 1 i 1 !' I D £ 4 6 fl 10 12 14 1& 18 20 22 24 Time, min J. Chromatogr. A 1217(2010)7514-7522. | J. Chromatogr. A 1217(2010)5389-5397. KONVERZE POLYMERAČNÍ REAKCE J. Chromatogr. A 1217(2010)7514-7522. | J. Chromatogr. A 1217(2010)5389-5397. FUNKČNÍ Butyl metakrylát (BMA) O CH3 BMA CMMA 12 14 LMA 0 12 3 4 i-1-1 i i- i-r Cyklohexyl metakrylát (CHMA) CH3 9 3 EHMA —'-1 i i i 0 23401234 Ethylhexyl metakrylát (EHMA) O H2Cc (1) Insulin (2) Cytochrom c (3) BSA (4) P-laktoglobulin. I-•-f I T 0 12 3 4 Time, min Lauryl metakrylát (LMA) 0 Y"OCH2(CH2)10CH3 CHa H2C Stearyl metakrylát (SMA) O H2C OCH2(CH2)i6CH3 CH, Nutnost (neustálé) optimalizace složení směsi J. Sep. Sci. 34 (201 1) 2054 - 2062. 8891 8891 POVRCHU Glycidyl metakrylát 1875 POVRCHU Styren & Chlormethylstyren ci-R I Aicij Friedel-Craftsova alkylace HN- ,NH, NHj TAEA tris(aminoethyl)amin NEt3 N2(C(CN)(CH3)C2H4COOH)2 y-glucuronolakton rK5 mer48 (2007)2187-2198. 1875 OBECNÝ MONOLIT Anal. Chem. 82 (201 0) 1 621 - 1 623. | J. Chromatogr. A 1 21 7 (201 0) 821 2 - 8221. ZESITENI (HYPERCROSSLINKING) rozpouštědlo 1,2-dichloroethan katalyzátor FeCU zvýšena teplota ZVÝŠENÍ AKTIVNÍHO POVRCHU 600- původní monolit zesítěný monolit Ol E