"Když chemik neví, co s tím, tak to zahřeje. " Neznámý autor CHROMATOGRAFIE PŘI VYSOKÝCH TEPLOTÁCH Jiří Urban, Ústav chemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno, urban@chemi.muni.cz Pokročilá kapalinová chromatografie VISKOZITA MOBILNÍ FÁZE A PERMEABILITA Acetonitril Metanol 25 "C 90 "C 200 "C ÚČINNOST Difúzni koeficient ;_ „ T 1 r] 74.1 f)_8T ch. M B B~D ~ — C~-~ — m r, .1/0.6 u 1 m 'I sv v A A — turbulentní difúze Wilke-Chcmgova rovnice B - molekulová difúze ľ J* ~ I C C — odpor proti převodu hmoty 9 :. 0 1 ■ ... I ■ ... I ■ ... I ■ ... I ... ■ 0 20 40 60 80 "dp/Dm25 VLIV TEPLOTY NA ÚČINNOST 1000 t APmax = 800 bar 100 4 104 1 4 0.1 ' *5 Critical point 50 000 pater ■ lit_i 111 ...... ■ ■ i i i 11 Pozor na vysokoúčinné separace a na experimentální uspořádání 1000 10000 100000 plate number 1000000 16.D 70-80 °C Alternativně ledová lázeň 5 10 15 Water (mobile phase) flow rate {mUmin) 20 J. Sep. Sei. 30 (2007) 1 672 - 1 685. TERMODYNAMIKA RETENCE Gibbsova volná energie AG° = —RT • \r\K Distribuční koeficient Standardní molární entalpie \ AG° = AH0 - TAS0 / Standardní molární entropie převodu látky mezi stacionární a mobilní fází Gibbsova volná energie Obecný popis pravděpodobnosti průběhu (chemické) reakce (AG°) ■ -AG° — proběhne ■ AG° — neproběhne Entalpie Změna energie při přestupu z mobilní do stacionární fáze. Odpovídá rozdílu interakcí mezi stacionární a mobilní fází. Přechod mobilní > stacionární fáze je preferován (retence), což odpovídá záporným hodnotám entalpie, -AH°, které upřednostňujeme. Entropie Odpovídá změně entropie (míře neuspořádanosti) při přechodu z mobilní do stacionární fáze. Neuspořádanost je v prostoru stacionární fáze omezena, což se projeví negativními hodnotami AS0. Proto upřednostňuje pozitivní hodnoty změny entropie. R — plynová konstanta, 8.31 4 JK'moľ1 , T — termodynamická teplota, K,k— retenční faktor GIBBSOVA ENERGIE nižší teplota ~|", K vyšší teplota vyšší retence nižší retence GIBBSOVA ENERGIE nižší teplota ~|", K vyšší teplota vyšší retence nižší retence GIBBSOVA ENERGIE nižší teplota ~|", K vyšší teplota vyšší retence nižší retence VAN'T HOFFOVA ROVNICE Gibbsova volná energie Ac7° = -RT-lnK Distribuční koeficient AH° AS0 Ink = ——+ —- ln/? RT R Standardní molární entalpie \ AG° = AH° - TAS0 / Standardní molární entropie převodu látky mezi stacionární a mobilní fází \nK = - AH0 AS0' RT R _ 1 _ V s Van't Hoffova rovnice AH° ASU Vs Ink = - —— + ——+ ln o RT R Vi M \nK = ln/c/? /? = V, Mobilní v. Stacionární Fázový poměr R - plynová konstanta, 8.31 4 JK'moľ1 , T - termodynamická teplota, K, k - retenční faktor B \ogk = A+- www.chromatographyonline.com/elevated-temperatures-liquid-chromatography-part-iii-closer-look-van-t-hoff-equation www.chromatography-online.org/Retention/Thermodynamics/rs_l_l 5.php VAN'T HOFFOVA ROVNICE 1.00 0.80 0.60 O) .2 0.40 0.20 0.00 B ln k = — + A T 0.0029 0.0030 0.0031 0.0032 0.0033 0.0034 i A k-1 Poměr fází Konstantní při různých teplotách (?) :i:::::::t:t:í:::t:í:::;:i B logk = A+- AS0 + + ln RT R VM směrnice úsek entalpický příspěvek entropický příspěvek AH o AS o ENTALPIE vs. ENTROPIE Systém A In it I Systém B In it I 1/T 1/T ENTALPIE vs ENTROPIE Systém A Ink Dominantní vliv entalpie \/j Malý vliv entropie Systém B In k " AS0 "lnv R Malý vliv entalpie Velký vliv entropie ENTALPIE vs ENTROPIE Systém A Ink Dominantní vliv entalpie \/j Malý vliv entropie Rozdělení kontrolují molekulární síly, interakce vzorku se stacionární fází Systém B Malý vliv entalpie 1/T Velký vliv entropie Rozdělení kontrolované (náhodnou) entropií. Zádně interakce. Větší záporná entropie — větší retence (menší chaos). ENTALPIE vs. ENTROPIE Systém A Dominantní vliv entalpie \/j Malý vliv entropie Rozdělení kontrolují molekulární síly, interakce vzorku se stacionární fází Systém B Chirální separace Size-exclusion Malý vliv entalpie 1/T Velký vliv entropie Rozdělení kontrolované (náhodnou) entropií. Žádné interakce. Větší záporná entropie — větší retence (menší chaos). TERMODYNAMICKÝ POPIS RETENCE Termodynamika retence popisuje, že existují dva hlavní mechanismy. Nelze ale přímo odvodit, jak lze takto retenci kontrolovat. To se musí dít/studovat skrze rozdělovači koeficient (K) ovlivněný molekulárními interakcemi a poměr objemů stacionární a mobilní fáze (V TI 1 Temperature 1 1 Temperature 2 Pump Injector -| Column 1 |- -► Column 2 e.g. C18-Si02 e.g.ZirChrom-CARB Ortogonalita stacionární fází Detector 20 10 (A) Z) < 20 (B) 21 o Ě < 6 7 I 10 15 U ■PC, 1 ml/min Tocs=30°C;Tc.zrtJJ=125°C 10 25 30 T C, 3mJŕmin 10 11) Okénkový diagram 2 trial runs on column A *aITi),*a(Ti) 43- 43- 43- 2 trial runs on column B in (Tú. *r (Ta) 43- l"gíľí=(11!-,-[5l!'T 43- 'nB=tMä(1+*i1) 43- tE„, (Ta, T„ ) - tE.« (Ta H t Ei „ (T J - t.. 43- Anal. Chem. 72 (2000) 72, 1 1 0 - 1 1 8., Anal. Chem. 72 (2000) 2788 - 2796. teplotní kontrola selektivity on/off efekt T2 > TI 1 Temperature 1 1 Temperature 2 Pump Injector -| Column 1 |- -► Column 2 Detector e.g. C18-Si02 e.g.ZirChrom-CARB Ortogonalita stacionární fází 7- um ■ ü Tm - i—i—i—i—i—i—i—j—r- r=0.401 sd=03« o ....................j ■ ■ ■i 00 vin' I w 1 ,l i 4+5 « i h /L E -4- 4 1 i \1Á_: _1_1_1_J_1_1_1_1_L_1_1_1_1_1_1_1_1_■_1_! li la i i ! : Z ÍU Time [m\n\ ■5 li vil J. Chromatogr. A 1028 (2004) 31-62. STACIONÁRNÍ FÁZE 1. Zavedení methylových skupin poměr alkyl : CH3 : SiOH — 1:1:1 nověji - ethylenové můstky 2. Nesilikagelové nosiče a. Organické polymerní částice b. Uhlík c. Oxid hlinitý d. Modifikovaný oxid zirkoničitý - uhlíkem - Cl 8, Cl 8 a uhlíkem - polystyrenem - polybutadienem 3. Hybridní materiály, matrice polymer - silikagel, Zr02 - silikagel r Silica C18 Materials 1/2 Max C1B/Endcap 1/2 Free Silanols Zr-PBD Zr-Carbon ■•Sví ^~T*~ Hybrid Particle C18 1/3 Incorporated Methyls 1/3 MaxCie/Eridcap 1/3 Free Silanols Zr-PS Zr-CarbonCl8 TEPLOTNÍ STABILITA KOLON Inflow Outflow 20 65 65 20 40 Relative distance between measuring powitions [mm] 5 a 50 hodin Heating time [h] Retention time [min] —•— k Phenol -*- k Naphihalere -*- k AMhracsne -aftBr s hours alter 50 hauis J. Chromatogr. A 1 1 14 (2006) 89-96. Zr02 pokrytý polybutadienem, ZirChrom-PBD, 4.6 mmxl50 mm, 3[im, 300 °A STABILIZACE POVRCHU POLYMEREM V ideálním případě ■ nedochází k blokování pórů ■ je částice homogenně pokrytá Bloknckage of pore volume by PBD 1 DC Q m E s-. 80 -C B o j| c « E ô > 40 c Q. .S PC'S 0 * m Silica [88] Zirconia [92] 10 15 20 25 30 35 PBD volume/Pore volume [%] 40 (g Influence of PBD coating on pore diameter and surface area % of pore volume blocked by PBD {%) -Surface area - silica [88] - - * - -porediam. -silica [88J -surfacearea - zirconia[92] - - O - - porediam. - zirconia[92] Polymerní pokrytí poskytuje srovnatelnou účinnost jako silikagel (oproti čistě polymerním částicím) J. Chromatogr. A 1028 (2004) 31-62. SROVNÁNÍ SELEKTIVITY a> c Q> N C CD m "5 ■*-> D O O) o Normalized Selectivity Comparison PLRP Luna, ZirChrom-PBD, ■Jy

< 20000 //V V J. Chromatogr. A 1028 (2004) 31 POKRYTÍ POLYSTYRENEM vs. POLYBUTADIENEM 10 2Q 30 Normalized Retention Time Alkylbenzeny a aromatické uhlovodíky, 50% acetonitril, T = 30 °C J. Chromatogr. A 1028 (2004) 31-62. í UHLÍKEM NM 2 -^3~Y + 2 HX + NaN°2 9 XN=N ~0~Y + 2 H2° * NaX Reaction 1 DiamondBond Cl 8 Where Y-C11H37 Carbon clad zirconia l)]U/"IIIUITI Sali Derivalized Carbon clad zirconia Reaction 2 CH5 Ch^ Ch^ lCHJnt pjjhync (Chth, CH-, CH;. CH; Nor 40 35 30 25 20 15 10 5 0 150 °C Separation in 1 minute 1.4 i—r 1.6 1.8 min 1. Acetaminophen 2. Ketoprofen 3. Naproxen 4. Ibuprofen 5. Oxaprofen J. Chromatogr. A 1028 (2004) 31-62. 63 STABILITA VZORKU □ 30 "C Ľ340 *C □ 50 "C B 70 "G 185 ""C CytaraMna ArnoxIcIlHn Chlorampnenicúl Etopoalde Stabilita cytostatik a antibiotik při vyšší pracovní teplotě na stacionární fázi tvořené Zr02 pokrytým polybutadienem, 15% acetonitril + 0.1% FA STABILITA VZORKU-VLIV KOLONY Uhlíkem pokrytý Zr02 Polystyren-Divinylbenzen ZirChrom Carb, 1 50 mm X 4.6 mm, 3 |im PLRP-S, 1 50 mm X 4.6 mm, 3 |im Time (min) 0 10 20 Time (min) Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 46 (2008) 625—630. mAU ; 60 - 50 40 -30 -20 -10 -_ o -j- (A) o mAU U 2 4 6 VWD1 A, Wave length =254 nm (P102501\TEST0151.D) 80- 60- 40- 20 0 (B) 0 -i-1-1-r 2 21 °C 29.0% ACN 1.35 ml/min 195 bar 1 2.5 min 2.4 2.6 2.8 3 3.2 min TV 10 12 14 3 ti 80 °C ft 26.5% ACN 3.00 ml/min 195 bar 2.5 min V 0.9 0.95 1 1 05 1.1 1.15 12 125min T-1-1-1-1-1-T-1-1-í-T j-1-í-1-j-1-1-r-j-í-1-1-j-í- 8 10 12 14 rrin Spotřeba mobilní fáze 16.9 ml 7.5 ml 21 "C 80 °C ZirChrom-PBD, 1 00 x 4.6 mm J. Chromatogr. A 1028 (2004) 31- 66173832 TOKOFEROLY A LU 60 5