1 PROTEINOVÉ KOMPLEXY V REPLIKACI DNA CG030 Struktura a funkce proteinových komplexů Edit Lelkes 1.4.2021 2 Replikacia DNA polymeráza I - E.coli (Kornberg, 1957) Semikonzervatívna (Meselson a Stáhl, 1958) Replikačná vidlica - E.coli (Cairns, 1963) Okazakiho fragmenty (1968) Semikonzervatívna Obojsmerná Smer syntézy DNA: 5' -> 3' Presnosť: 1/106 Rýchlosť: • E. coli-50 000 b/min S. cerevisiae-3 600 b/min • Myš - 2 200 b/min • Človek-3000 b/min Načasovanie: Baktérie nemajú špecifickú fázu Eukaryota v S fázi Take a sample prior to adding to' 'N medium (Generation Ó) Three postulated methods of DNA Replication ^^^^ Semi-Conservative Conservative"' Dispersive* ■ Newly, synthesized strand Original template strand * not found to be biologically significant All DNA is initially "N-4abelad to c CD Q Add "N labeled cells to *N medium and grow for four generations Generation •nr.K, L WC 12% 0 20 40 60 80 3 Replikácia DNA polymeráza I - E.coli (Kornberg, 1957) Semikonzervatívna (Meselson a Stahl, 1958) Replikačná vidlica - E.coli (Cairns, 1963) Okazakiho fragmenty (1968) Semikonzervatívna Obojsmerná Smer syntézy DNA: 5' -> 3' Presnosť: 1/106 Rýchlosť: E. coli- 50 000 b/min S. cerevisiae-3 600 b/min Myš - 2 200 b/min Človek-3000 b/min Načasovanie: Baktérie nemajú špecifickú fázu • Eukaryota v S fázi Replikacia Semikonzervatívna Obojsmerná Smer syntézy DNA: 5' -» 3' • Vedúci reťazec Oneskorujúci sa (opžďujúci se) Paramecium Parlor ©AmoebaSisters backward 3 fáze replikácie: • Iniciácia Začiatok už v M/G1 (licensing), rozpletenie dvojšróbovice DNA, vznik replikačnej vidlice a naviazanie enzymatického komplexu • Elongácia • pridávanie nukleotidov a postup replikačnej vidlice Topologickéhý stres, tažko replikovatelné lokusy, proteiny na DNA, transkripcia, poškodená DNA • Terminácia • ukončenie replikácie 5 Proteinové komplexy v replikacii Prereplikačný komplex CMG helikáza RPA Primáza DNA polymerázy PCNA DNA ligáza Topoizomerázy I a II Histon remodelačné komplexy Lagging strand Leading strand PCNA / Pol 6 CMG complin PCNA (Boehm et. al., 2016) 6 Iniciácia Origin - post mitotic • Bakterie majú len 1 replikačný počiatok • Eukaryota - väčší zložitejší génom - viac počiatkov replikácie • Zostavenie prereplikačného komplexu v G1 • „replication licencing" • Fosforylácia MCM helikázy pomocou CDK a DDK kináz • Aktivácia replikačnej helikázy (CMG helikáza) v S • K MCM helikáze sa pripoja ďalšie proteiny 1. ORC komplex 2. MCM helikáza -> preRC 3. MCM dvojitý hexamer 4. MCM dvojitý hexamer -> CMG helikáza ORC • Origin of recognition complex • Objavené u S. cerevisiae • Podjednotky Ord, Orc2, Orc3, Orc4, Orc5, Orc6 (+CDC6) • Asociované s chromatinom - väzba na ARS • Autonomously replicating sequences Väzba k DNA závislá na ATP • Funkcia: zostavenie prereplikačného komplexu (preRC) v G1 • Transkripčné umlčenie, heterochromatinizácia, kondenzácia a kohézia chromosómov, cytokinéza • preRC: Cdc6, Cdt1, Mcm2-7, ORC • MCM helikázový komplex sa aktivuje až v S fázi (pomocou kináz) • Nie všetky replikačné počiatky sa aktivujú • Meier-Grolinov syndróm (AR-ORC, Cdc6), E B V, nádory CDC6 O MCM2-7 • Cdt1 • ORC4 OORC5 • ORC6 CDC6 binds ORC ORC-CDC6 recruits MCM2-7-CDT1 Bell (2017) 8 ARS • Autonomously replicating sequences • Sem sa viaže preRC • ORC sa viaže na DNA pomocou WH domén a AT hookov • Konsezus sekvencia u S. cerevisiae: • ORC naviazaný počas celého bunečného cyklu • A-element vysoko konzervovaný 5'- T/A T T T A Y R T T T T/A -3 100 bpdlhé ■ Aktívne (replikácia z 1 ARS každý druhý bunečný cyklus) B3 20bp B2 BI Origin recognition sequence Okrem S. cerevisiae a jej blízko príbuzných kvasiniek sa u žiadneho ďalšieho organizmu nepodarilo nájsť uniformnú konsenzuálnu sekvenciu pre väzbu ORC • AT-bohatá sekvence u S. pombe • ORC sa viaže v M/G1, uvoľní sa v S • Replikačné počiatky viac podobné mnohobuněčným jako S. cerevisiae • 1000 bpdlhé • Málo aktívne (replikácia z 1 ARS každý desiaty bunečný cyklus) http://glossomics.blogspot.cz/ 9 ARS Autonomously replicating sequences Sem sa viaže preRC ORC sa viaže na DNA pomocou WH domén a AT hookov Vyššie eukaryota: • Asymetrické AT bohaté sekvencie, rozhoduje epigenetika • G-kvadruplexy, počiatky transkripcie, Dnáza hypersenzitivné oblasti • Early replicating regions: • H3K4me1/2/3, H3K9ac, H3K18ac, H3K36me3, a H3K27ac • Euchromatin • Late replicating regions: • H3 a H4 hypoacetylácia, a H3K9 a H3K27 metylácia • Často tkáňovo specifické • V ľudských buňkách Ord sa počas S fáze uvoľní z komplexu a spát sa naviaže na konci mitózy • ARS: Kvasinky po 40kb, savci každých 200-300kb • Ľudská buňka asi 50 000 ARS 10 Podjednotky ORC ORC1 : • Interakcia so Sir1 (S.c), HP1 (D.m.) • transkripčná represia • BAH doména sa viaže na H4K20me2 • esenciálna interakcia pre asociáciu s chormatinom ORC2: • Lokalizácia aj pri centromerách • delécia -> mitotické defekty • AT hook: väzba k DNA ORC4: ona • Asociácia s membránami neurónov, úloha v dendritickom rastu Otca ORC6: • Štruktúrne odlišná od ostatných ORC podjednotiek 0ra> • Medzidruhovo velmi málo konzervovaná • Lokalizácia u kinetochóroch, úloha v cytokynéze {H.s., D.m.) WH doména a AT hook - väzba k DNA AAA+ doména - ATPázová doména BAH doména - protein-proteinové interakcie AAA- Orcl Ona BAH ORC/Cdc6 WA WB Si S2 AAA + I I ~| I QRC/OJG6 AT hook AAA+ WA WB S1 S2 ♦ WH + ORC/Cdce 620 6"6 WA WB S1 S2 ._AAA+ ORC/Cdce -.21 WA WB Si S2 AAA-i- ORC/CdC6 WA WB S1 S2 AAA+ Cdc6 WH Wh 479 BAH domain Disordered region O RC/CdcS domain Motifs ORC/Cdc6 513 WA WB S1 S2 WH (Dunckeret. al., 2009) Štruktúra ORC Ord • Orc2 Orc3 Orc4 Orc5 Orc6 ORC core AAA+ ~x WH y I _ _ —( AAA+ - like y. WH - —U. AAA+ - like )-(lnsertiö7T)-( WH > -( AAA+ X WH > ■C AAA+ central channel protuberance body (AAA+ and WH) 12 Štruktúra ORC - 5V8F 13 Iniciácia Origin - post mitotic Pre-rephcation complex ♦ CDK modiated cyclo signaling Activation of Pre initiation complex PO'i: ONA synthesis 16 MCM2-7 komplex • Minichromosome maintenance 2-7 U archaea 6 identických podjednotiek Podjednotky: 5-3-7-4-6-2 ring Rodina AAA+ATPáz • 3-5 helikáza Sama o sebe nemá helikázovú aktivitu • potrebuje cdc45 a GINS • Iniciácia (preRC) + elongácia (CMG) • Postupuje s replikačnou vidlicou • Loading: • Pomocou ORC-CDC6 komplexu a Cdt1 v G1 • Po loadingu je MCM komplex SUMOylovaný (až do S fáze) -zabráni skorej aktivácii • Aktivácia počas S faze • Tvorba dvojitého hexameru • Fosforylácia pomocou CDK a DDK protein kináz • MCM už nie je sumoylovaný ale fosforylovaný • Aktivácia nie naraz, nie všetky • Záloha v prípade pozastavených replikačních vidlíc • Stochastické 17 MCM2-7 complex - štruktúra pod jednotiek N-koncová doména • interakcia medzi MCM podjednotkami Zinc-binding motif • stabilizácia N-koncov a tím aj komplexu Allosteric communication loop • komunikácia medzi podjednotkami N-koncový (5-hairpin • Interakcia s DNA AAA+ ATPázová doména • Cis-acting: WalkerA, WalkerB a Senzorl motív • Trans acting: argininový prst, Senzor2 motív Degenerovaná Winged Helix Posttranslačné modifikácie na N a C koncoch Zn Zn ACL NBH EXT-HP H2I PS1BH 100 amino adds 1 1 1 1 I Ti Á E 1 +2 S1 F F S2 Amino-terminal domains AAA* domain wH cřs-residues EXT-HP frans-residues (Bell and Botchan, 2013) 18 MCM2-7 complex - štruktúra pod jednotiek N-koncová doména • interakcia medzi MCM podjednotkami Zinc-binding motif • stabilizácia N-koncov a tím aj komplexu Allosteric communication loop • komunikácia medzi podjednotkami N-koncový (5-hairpin • Interakcia s DNA AAA+ ATPázová doména • Cis-acting: WalkerA, WalkerB a Senzorl motív • Trans acting: argininový prst, Senzor2 motív Degenerovaná Winged Helix Posttranslačné modifikácie na N a C koncoch 1 1 1 1 TlÄ E Amino-terminal domains AAA* 1Í2 S1 F domain F Ú2 wH AAA* Amino- terminal (Bell and Botchan, 2013) 19 20 ATPázová aktivita MCM komplexu AAA+ ATPázy Aktivně miesta medzi podjednotkami • Jedna podjednotka: Walker A a Walker B motívy • Druhá podjednotka: Arginin finger V jednom hexamere MCM 6 aktívnych miest Loading komplexu: 2-6 ATPáza Loading druhého hexameru ^ a tvorba dvojitého hexameru MCM komplexov: 4-7, 6-4, 5-2 a 3-5 ATPázy m7«m3 m; (Bell and Botchan, 2013, Li et. al. 2015) 21 Mcm - dvojitý hexamer Dva hexamery sa spoja až po väzbe na DNA • U archaea sa dva hexamery môžu spojiť už mimo DNA • ORC rekrutuje MCM komplexy po jednom • Dva MCM komplexy sa potom spoja pomocou N-terminálnych domén • Zinkové prsty stabilizujú interakciu medzi dvomi MCM komplexmi • Loading aj dimerizácia MCM komplexov vyžaduje ATP Centrálni pór MCM komplexu • 23Ä - vojde sa ss aj dsDNA • Pozitívny náboj • Väzba na DNA pomocou bázických AMK v OB fold • KinkDNA M4' m 1 CTD ^JNTD NTD CTD (Li et. al., 2015) 22 23 CMG CMG obsahuje: • MCM hexamer • GINS komplex • Cdc45 Zloženie a aktiváciu CMG komplexu iniciujú dve kinázy, CDK a DDK v S-fázi Cdc45 a GINS sa viaže na MCM komplex na N-terminálnu doménu Helikázová aktivita na dsDNA Cdc45 a GINS spôsobuje: • Remodeláciu MCM dvojitého hexamru • Vyššiu affinitu MCM dvojitého hexameru k DNA CMG ostáva naviazaná na DNA až po termináciu replikácie Pri terminácii replikácie je CMG komplex ubikvitinylovaný M za 10 minút od začiatku replikácie sa dva replikačné vidlice stretnú a dojde k terminácii replikácie • RFB(replication fork barrier): • Špecifické miesta genomu, ktoré dokážu zastaviť replikačnú vidlicu • Pri replikácii rDNA • ORC sa na konci S-fáze disociuje z komplexu (okrem S.cerevisiae) • Odstránenie CMG: • Mcm7 je polyubikvitylovaný na K48. • Cdc48 rozpozná polyubikvitinylovaný CMG komplex a oddelí ho od chromatinu • PCNAje z chromozómu odstránený na začiatku G2 fáze pomocou ELGI-Rf-C Ďakujem za pozornosť