I. Vývoj představ o povaze hmoty
1.1 Vývoj představ o povaze světla
1.1.1 Newtonovy představy
Isaac Newton (obr. 1) objevil zákon gravitace. Podle tohoto zákona jsou tělesa
přitahována silou, která je úměrná hmotnostem těles a nepřímo úměrná čtverci vzdálenosti
(obr.2). Dále jsou známy Newtonovy zákony o síle: Podle prvního zákona (zákon o
setrvačnosti) těleso setrvává v klidu nebo v rovnoměrném
přímočarém
pohybu dokud není
tento stav nuceno
změnit působením
vnější síly. Podle
druhého (zákon o
síle) je zrychlení
jež uvádí těleso do
pohybu úměrné
působící síle a
nepřímo úměrné
hmotnosti tělesa. Podle třetího (zákon
akce a reakce) je každá akce (působení
síly) provázena reakcí, která má stejnou velikost ale opačný směr. Tyto zákony jsou
předmětem klasické mechaniky a nebudeme je tedy rozebírat.
Obr. 2. Zákon gravitace
Obr. 1. Isaac Newton
Méně je známo, že Newton se také zabýval studiem světla. Používal k tomu různé
hranoly a již ve svých 23 létech zjistil, že světlo se dá rozložit na barevné spektrum (obr.
3). Dále zjistil, že světelné spektrum se
dá zase spojit použitím druhého hranolu.
Vymezením se dá získat světlo určité
barvy. Newton si představoval světlo
jako proud částic různé velikosti. Jestliže
narážejí v hranolu na částice stejné
hmotnosti, pak nejméně se budou
odrážet částice s největší hmotnosti.
1.1.2 Světlo jako vlnění
Vlnové vlastnosti světla studoval
Thomas Young na
začátku 19. století
(obr. 4). Popíšeme
jeho klasický experiment, v němž světlo prochází dvěma štěrbinami
(obr. 5). Průchod světla dvěma štěrbinami by měl dát na stínítku součet
osvětlení od jednotlivých štěrbin (vpravo); místo toho se však pozoruje
interferenční obrazec (obr. 6). Tento obrazec lze vysvětlit za
předpokladu, že se světlo šíří ve formě vlnoploch (jako vlny na hladině
rybníka), tj. v každém bodě kde světlo vnikne dochází ke vzniku
nové vlnoplochy.
Obr. 3. Isaac Newton se zabýval také studiem světla
Obr. 4. Thomas Young
1
Amplituda vlny v prostoru a
čase se pak dá popsat
goniometrickou funkcí (stejně
jako šíření vln po hladině
v určitém směru), kdy
amplitudu označíme A, její
maximální hodnotu Ao,
ω označíme úhlovou frekvenci,
která je 6.28 x větší než
kmitočet, t je čas:
Obr. 5. Průchod světla dvěma štěrbinami by měl dát na stínítku součet
osvětlení od jednotlivých štěrbin (vpravo)
A=Ao sin(ω.t+∆x),
∆x je fázový posun, který souvisí s počátkem
měření a může být nenulový. Pro dvě štěrbiny se
dá výsledná amplituda v určitém bodě stínítka
spočítat jakou součet takových funkcí pro jednu i
druhou štěrbinu (fázový posun vyjadřuje zpoždění
vln z jedné štěrbiny oproti druhé):
A=Ao.( sin(ω.t) + sin(ω.t+∆α) ) =
2.Ao sin(ω.t+ ∆α/2).cos(∆α/2)
Obr. 6 Interference světla ze dvou štěrbin
Tento výraz bude nulový pro ∆α=(2.n+1). π. Zde ∆α = 2.π.∆x / λ , kde λ je vlnová délka
a ∆x je délkový posun. Jestliže je tedy délkový posun roven polovině vlnové délky (nebo
lichým násobkům), dojde k vyrušení amplitudy. Pozorovaná intenzita bude také nulová.
Průběh intenzity bude tedy záviset na vzdálenosti stínítka od štěrbin a nulová intenzita
může být pozorována i ve středu – mezi oběma štěrbinami, kde by dle prvního obrázku
(obr.5) mělo být maximum.
1.1.3 Maxwellovy rovnice
Ve druhé polovině 19. století je už známá řada zákonů, jež se týkají elektřiny a
magnetismu. Je to např. Coulombův zákon:
F =
oπε4
1
2
.
r
Qq
,
vyjadřující sílu F, působící na nabitou částici s nábojem q, nacházející se ve vzdálenosti r
od jiné částice s nábojem Q.
Biot-Savartův zákon udává intenzitu magnetického pole vodiče, kterým protéká proud
(obr.7) a Faradayův zákon magnetické indukce udává závislost elektromotorické síly
indukované ve vodivé smyčce na časové změně magnetické indukce (obr. 8).
Obr. 7. Biot-Savartův zákon - I je intenzita proudu, ds je
element vodiče ve směru proudu, r je průvodič (vektor od
elementu ds k bodu, v němž intenzitu magnetického pole B
určujeme)
2
Obr. 8 Faradayův zákon – elektromotorická síla vytvořená podél
smyčky se rovná časové změně magnetické indukce∫∫ ⋅=⋅ dA
dt
d
ld nBE
r
Tyto zákony se Maxwellovi podařilo brilantně zobecnit a dospěl k soustavě rovnic, které
popisovaly elektromagnetické jevy (obr. 9). Předpověděl, že nejen elektrický náboj může
při pohybu indukovat magnetické pole, ale také naopak že změna
magnetického pole může indukovat pole elektrické. Z uvedených
rovnic vyšla jako řešení funkce popisující elektromagnetickou vlnu
(střídání elektrického a magnetického pole) a její časová závislost.
Z této funkce bylo možné spočítat rychlost šíření této vlny jako:
oo µε .
1
= c
Rychlost šíření vyšla velmi přesně rovna rychlosti světla ve vakuu.
Z toho Maxwell vyvodil, že světlo je elektromagnetické vlnění
(obr. 9). V současné době víme, že existuje celá řada druhů
elektromagnetického vlnění (obr.10).
Obr. 9 Soustava Maxwellových rovnic - ∇x znamená
operátor rotace a ∇. znamená operátor divergence
Obr. 10 Druhy elektromagnetického vlnění,
vlevo je uvedena vlnová délka
1.1.4 Záření absolutně černého tělesa
Koncem 19. století bylo známo, že zahřáté
těleso vyzařuje elektromagnetické záření. Aby
bylo možné změřit emitované záření přesněji,
bylo požito uzavřené nádoby s úzkým hrdlem
takovým, aby nepropouštělo vnější záření
dovnitř. Takové těleso bylo označeno jako
černé, tj. neodrážející. Byly stanoveny spektra
pro různé teploty (obr. 11) a bylo zjištěno, že
Obr. 11 Spektra záření černého tělesa pro 3 různé
teploty
3
maximum intenzity závisí na teplotě a to nepřímo úměrně – tento posouvací zákon byl
objeven Wienem. Existovaly také empirické formule pro popis spekter při malých vlnových
délkách (exponenciální formule) a velkých vlnových délkách (lineární závislost). Planck si
s těmito rovnicemi pohrál a nalezl jejich zobecnění.
Exponenciální člen ve jmenovateli lze skutečně pro velké a malé vlnové délky upravit na
exponenciální a lineární závislosti.
Dalším krokem bylo hledání vhodné interpretace takové rovnice. To bylo obtížné,
neboť podle klasických představ měly být uprostřed tělesa malé oscilátory, které měly se
zvyšující se teplotou kmitat více a více. Planckovu rovnici však bylo možné odvodit pouze za
předpokladu, že tyto oscilátory nemohou mít libovolnou energii nýbrž, že ji mění po skocích.
Změna energie se děje po kvantech daných určitou konstantou (Plancková konstanta h):
∆E = h.ν.
Tímto Planck vlastně zavedl kvantovou teorii. Planck presentoval svoji teorii Berlínské
fyzikální společnosti v prosinci 1900. Ačkoliv měl oscilátory kvantované aby odvodil svoji
rovnici, emitované světlo už považoval za elektromagnetickou vlnu. Jak byl blízko pojmu
kvanta světla! Pojem foton však jím zaveden nebyl – to se stalo o něco později v teorii
fotoefektu.
1.1.5 Einsteinová teorie fotoefektu
Světlo dopadající na kovovou folii vyráží z této folie elektrony (obr.12). Umístíme-li
do blízkosti folie druhou elektrodu, bude obvodem
na obr. 12 proudit elektrický proud.
Experimentálně bylo zjištěno, že velikost proudu
závisí na intenzitě světla (obr. 13) a nezávisí na
napětí; pouze v závěrném směru lze proud
blokovat při V= -Vo. Jestliže měníme vlnovou délku (barvu světla), mění se velikost
závěrného napětí, ale proud zůstává při dané intenzitě přibližně stejný (obr. 14).
elektrony
měří se proud I
A
světlo
napětí V
Obr.12. Fotoefekt – modře elektrony nad
folií, na kterou dopadá světlo. Měří se proud
mezi folií a druhou elektrodou při určitém
napětí.
Obr. 13. Závislost
proudu fotoefektu na
napětí pro různé
intenzity světla
Obr. 14 Závislost
proudu fotoefektu na
napětí pro různé
vlnové délky světla
4
Tyto jevy neodpovídaly klasickým představám, neboť si vědci představovali elektrony
ve folii jako oscilátory, které je nutno rozkmitat aby se utrhly a oddělily se od povrchu. Pak
by k tomuto rozkmitání měla pomoci větší intenzita světla, tj. energie by měla být tím větší,
čím je větší intenzita. Elektrony by měly být emitovány s určitým zpožděním – až po
rozkmitání – a proud by měl narůstat s časem. Elektrony by měly být emitovány pro
libovolnou vlnovou délku. To se ovšem nepozorovalo. Souvislost energie elektronů
s frekvencí světla vysvětlil Einstein kvantovou povahou světla a zavedl pojem foton. Foton
má energii hc/λ, která se spotřebovává na výstupní práci elektronů (φ) a jejich kinetickou
energii:
Ek = hc/λ - φ
Tím se vysvětluje závislost energie elektronů na barvě světla a také existence prahu pro malé
frekvence; neexistuje žádné časové zpoždění mezi osvitem a objevením se elektronů. Za
vysvětlení fotoefektu obdržel Einstein v roce 1921 Nobelovu cenu.
1.6 De Brogliova teorie
Podobně jako se fotonu přisuzují korpuskulární vlastnosti a určité vlnové délce se přisuzuje
energie E=h.c/λ a impuls p=h/λ lze částici s energií E a hybností p přisoudit určitou vlnovou
délku podle vzorce: λ=h/mv. Této vlnové délce se říká de Brogliová vlnová délka.
1.2 Teorie relativity
Začátkem 20. století se vedly diskuse o šíření světla, o kterém se vědělo jakou má
rychlost z Maxwellových rovnic. Předpokládalo se, že podobně jako vlny na vodě nebo zvuk
ve vzduchu se světlo šíří v tzv. éteru, který je v klidu vůči určité jedné soustavě souřadnic. To
by znamenalo, že lze určit absolutní klid a také např. absolutní rychlost Země vůči této
soustavě klidu. Byly činěny pokusy o určení rychlosti světla ve vakuu ve směru pohybu Země
a proti směru tohoto pohybu (Michelsonův interferometrický pokus). Výsledek byl ovšem
negativní – neexistuje éter ani absolutně klidná soustava. Světlo má vůči všem soustavám
rychlost danou Maxwellovými rovnicemi. Einstein ukázal, že rovnocennost všech inerciálních
soustav (těch, které se vůči sobě pohybují rovnoměrně) a stálost rychlosti světa vede
k Lorenzově transformaci pro souřadnice a čas, tj. že čas se transformuje v závislosti na
souřadnicích a naopak souřadnice v závislosti na čase. Platí vzorec pro tzv. dilataci času:
ott =
2
2
1
1
c
v
−
,
kde t je čas v soustavě pohybující se vůči vztažné soustavě rychlostí v. Pro rychlost tělesa, jež
se pohybuje v pohybující se soustavě platí vzorec pro skládání rychlostí:
vA =
2
.
1
c
vv
vv
B
B
+
+
,
kde v je rychlost soustav vůči sobě, vB je rychlost tělesa vůči soustavě B a vA je rychlost
tělesa vůči soustavě A. Tento vzorec lze použít pro výpočet hybnosti v dynamice těles při
pružných nebo nepružných srážkách. Uvažováním pružné srážky dvou stejných těles
dospějeme k závěru, že hmotnost tělesa nemůže být konstantní, ale že závisí na rychlosti:
m =
2
2
1
c
v
mo
−
,
5
kde mo je klidová hmotnost tělesa. Tento vzorec je široce používaný v radiační fyzice i
technice. Z této rovnice pro celkovou hmotnost tělesa lze dospět k obecně známé rovnici mezi
energii a hmotností částice:
E = m.c2
,
kde ovšem m je celková hmotnost částice. Klidová hmotnost je mo a „klidová energie“ je tedy
rovná: Eo=mo.c2
.
1.3. Atom
1.3.1 Primitivní představy o atomu
Pojem atom zavedl Demokritos, představitel jedné řecké filosofické školy, zhruba
400 let př.n.l. Existenci atomu měl zdůvodněnou tím, že není možné neustále dělit látku do
nekonečna na menší a menší částečky. Proto musí existovat nějaká nejmenší částice. Atomy
různých látek se podle Demokrita liší tvarem a velikostí.
Teprve počátkem 19.stol. se tuto primitivní představu podařilo lépe zdůvodnit. Dalton
kombinoval poměry chemických látek při vzájemných chemických reakcích a zjistil, že aby
látky zreagovaly, musí být v určitém poměru. Dalton vysvětluje svá pozorování existencí
atomů a dospívá k závěru, že:
1)Všechny látky jsou tvořeny atomy
2) Atomy nevznikají ani nezanikají chem. reakcí
3) Atomy se vážou v poměru celých čísel
4) Různé atomy mají různé hmotnosti
Při formulaci těchto pravidel mu bezpochyby pomohl zákon zachování hmoty formulovaný
již v roce 1785 Antoinem Lavoisierem.
1.3.2 Thomsonův model atomu.
Představa atomu jako chemicky dále nedělitelné entity tím byla vlastně zformulována a platí
doposud. Koncem 19. století došlo k řadě důležitých objevů. Bylo objeveno roentgenovo
záření (Röntgen, 1885), byla objevena přírodní radioaktivita (Becquerel, 1886), byly objeveny
další prvky – radium a polonium. Intenzivně pokračovalo studium elektromagnetických jevů.
V roce 1897 studoval Thomson katodové záření v plynech. Toto záření bylo možné ovlivnit
jak elektrickým, tak magnetickým polem a bylo možné pro nositele tohoto záření vypočítat
poměrně přesně poměr náboje a hmotnosti (e/m). Thomson ze svých experimentů usoudil, že
se jedná o nový druh částic, nazval je elektrony a vyjádřil hypotézu, že elektrony vznikají
z atomů – tedy že jsou původně jejich součástí. Představoval si, že atomy jsou tvořené kladně
nabitým jádrem a záporným oblakem elektronů. Odhadl rozměr atomů na 10-11
m.
Náboj elektronu určil o několik let později Millikan v experimentech, v nichž sledoval
pod mikroskopem pohyb nabitých olejových kapek v elektrickém poli kondenzátoru. Napětí
mohl měnit a tím se měnila rychlost a směr pohybu kapek (obr. 15). Náboj kapek měnil tím,
že je ozařoval. Zjistil, že pohyb kapek se mění nespojitě - vždy o určitou hodnotu, která
odpovídal změně náboje o 1.6 10-19
C. Tento náboj
označil jako elementární – dále nedělitelný.
1.3.3. Rutherfordův model atomu.
V roce 1911 zkoumal Rutherford průlet částic α
tenkou zlatou folií. O těchto částicích již věděl jakou
mají hmotnost i náboj a dokázal si spočítat na
základě Coulombova zákona, jak by měly tyto
částice interagovat s jádry atomů, o kterých se
domníval, že tvoří vnitřní část atomů (dle
Obr. 15 Millikanův experiment
6
Thomsonova modelu). Částice by se měly vychylovat ze své dráhy. Frakce vychýlených
částic by měla odpovídat geometrickému průřezu jádra jehož poloměr odhadoval na 10-11
m.
Závěry jeho pokusů však byly ohromující – téměř žádné částice se nevychylovaly, avšak ty,
které se vychýlily, byly rozptyleny na velké úhly – jako by narážely na něco malého ale
těžkého. Rutherford z tohoto pozorování učinil závěr, že atomy obsahují malé (10-15
m) jádro,
které obsahuje prakticky všechnu hmotu atomu. Vznikl „planetární model atomu“, v němž je
ve středu kladně nabité jádro a kolem obíhají elektrony. V jádře je koncentrována téměř
veškerá hmota atomu (obr.16).
Tento model ovšem odporoval tehdy
již známé skutečnosti, že totiž elektron
pohybující se po zakřivené dráze vyzařuje a
ztrácí energii. Představa planetárního atomu
byla proto neudržitelná.
1.3.4. Bohrův model atomu.
Bohr využívá kvantového přístupu, který už
dříve zavedli Planck a Einstein a vnáší do
teorie atomu předpoklad, že elektron se
nemůže pohybovat po libovolné dráze kolem jádra (jako planety) a mít libovolnou energii, ale
že může mít jen určité hotnoty energie. Existují stacionární stavy elektronu, kdy energii
neztrácí ani nepřijímá a při přechodu mezi těmito stavy (s energií E1 a E2) může energii
přijmout nebo ztratit. Tato energie se vyzáří (nebo absorbuje) ve formě elektromagnetického
záření.
Obr.16 Rutherfordův model atomu
21 EEhv −=
kde h je Plancková konstanta a ν je frekvence vyzářeného světla. V Bohrově modelu atomu
se předpokládá, že moment hybnosti elektronu (L) může nabývat pouze celočíselných
násobků Planckovy kostanty:
π2
nh
L =
Tento předpoklad je v souladu s de Brogliovou teorií, v níž se přisuzuje elektronu také vlnová
délka, jež se rovná h/mv. Pak jsou celočíselné násobky L vlastně dány požadavkem, aby byl
obvod dráhy elektronu celočíselným násobkem jeho vlnové délky:
π2
nh
mvr =
Z rovnosti odstředivé síly a přitažlivé síly plyne:
2
2
mv
kZe
r =
a tudíž:
mkZe
hn
r 22
22
4π
=
kde Zmnr /10x529,0 210−
=
a pro rychlost platí:
16
2
10x19,2
2 −
== ms
n
Z
nh
kZe
v
π
22
4222
2 2
2
1
KE
hn
meZk
mv
π
==Kinetická energie se rovná:
7
neboli 22
4222
2
hn
meZk
En
π
−=
eVnZ
JnZEn
22
218
/6,13
,/10x18,2 2
−=
= −
Energetické hladiny jsou závislé na hlavním kvantovém čísle n a atomovém čísle Z. První
hladina v atomu vodíku má tedy úroveň -13.6 eV.
1.4. Jádro atomu
Existenci jádra atomu postuloval už Thomson a jeho velikost ukázal Rutherford (1911).
Kromě protonů jsou v jádře přítomny též neutrony, které byly objeveny Chadwickem v roce
1932 (objev popsán v další kapitole). Jádro atomu je soustava částic protonů a neutronů, která
je popisována vhodnými modely. Isotop je charakterizován určitým atomovým číslem Z
(počtem protonů v jádře nebo též protonovým číslem) a hmotnostním číslem A (počtem
nukleonů v jádře, též někdy nukleonovým číslem nebo relativní atomovou hmotností). Prvek
je charakterizován pouze hodnotou Z. Jádra se stejným Z ale různým hmotnostním číslem A
se nazývají izotopy; při stejném N=A-Z jsou to izotony; při stejném A, ale různém Z jsou to
izochory.
1.4.1 Kapkový model jádra.
Když si představíme jádro jak kapku tekutiny, můžeme z této představy odvodit poměrně
přesnou formuli pro hmotnost (a tedy i hmotnostní defekt) jádra. Hmotnostní defekt je rozdíl
mezi očekávanou hmotností jádra (1.67*10-27
A, kde A je atomové číslo) a skutečnou
hmotností. Hmotnostní defekt bude zřejmě záviset
na počtu částic, tj. bude obsahovat člen úměrný A,
dále na povrchu kapky je nutno počítat
s povrchovým napětím a nutno proto korigovat
výsledek o člen úměrný A2/3
(je-li poloměr úměrný
A1/3
). Dále bude v jádře působit Coulombická
repulse, kdy interakce bude existovat mezi všemi
dvojicemi protonů (tj. Coulombický člen bude
úměrný Z2
), vzdálenost mezi nimi odhadneme dle
poloměru jádra na A1/3
. Coulombický člen bude dán
potenciální energií jednoho protonu v poli
(potenciálu) druhého protonu a bude tudíž úměrný
1/A1/3
. Celkově pro Coulombický člen platí, že je
úměrný Z2
/A1/3
. Poslední člen, který se uvažuje je
tzv. Pauliho člen, který představuje korekci na
rozdílný počet protonů a neutronů. V úvahu se zde bere skutečnost, že nejstabilnější jsou jádra
se stejným počtem obou. Tento člen je tedy úměrný (A-2Z) a vzhledem ke zvětšující se
disproporci mezi počtem protonů a neutronů pro rostoucí A, se poslední člen předpokládá
nepřímo úměrný A. Takto jsme dospěli k semiempirické Weizsaeckerově formuli:
Obr. 17. Vazebná energie jádra (odpovídá
hmotnostnímu defektu)
8
V této rovnici jsou uvedeny číselné hodnoty pro jednotlivé členy. Vzhledem k tomu, že se
energie dále liší pro lichá a sudá jádra, předpovídá tato rovnice spíše průměrnou hodnotu pro
sudé a sousední liché jádro.
Z průběhu vazebné energie (viz. obr. 17) je vidět, že největší hodnoty nabývá vazebná
energie uprostřed periodické soustavy. Je tedy možný rozpad jader těžších za zisku energie
(např. 235
U), ale také syntéza jader lehčích (např. d+t).
1.4.2 Slupkový model jádra.
Tento model vychází ze skutečnosti, že některá jádra jsou
mimořádně stabilní (mají velkou vazebnou energii). Tak
např. velmi stabilní je jádro helia při Z=2 a A=2, jádro
kyslíku při Z=8 a A=16, vápníku při Z=20 a A=20. Tzv.
magickými čísly jsou tato: 2, 8, 20, 28, 50, 82. Stabilitu je
vidět např. u vápníku, kdy při přechodu od Z=20, A=20
přidáváním neutronů vidíme, že vazebná energie nejprve
klesá a posléze vzroste při N=28, kde se jádro stává opět
stabilní (obr. 18).
Výpočtem lze získat jednotlivé stavy jádra pro daný
počet částic (obr. 19). Jádro v základním stavu může být
stabilní a při přechodu mezi energetickými stavy pak
vyzařuje patřičnou energii. Na obrázku (obr. 20) vidíme
systém stavů v jádře niklu, které vznikne rozpadem 60
Co.
Obr. 18. Závislost vazebné energie na
hmotnostním čísle pro jádro vápníku.
Obr. 20. Systém vzbuzených stavů
v jádře niklu po rozpadu 60
Co.
Obr. 19. Slupkový model jádra při 74 protonech a 110 neutronech
(Wolfram).
Jádra se mohou přeměňovat při tzv. jaderných reakcích, které mohou být vyvolány buď
přírodními zdroji záření nebo umělými svazky částic. První takovou reakci uskutečnil
Rutherford (1919) když zkoumal dolet částic α v různých plynech. Nedovedl si vysvětlit, proč
v dusíku je dolet 4x větší. Nakonec to vysvětlil vznikem jiných částic – protonů, které jsou 4x
lehčí. Reakci lze zapsat takto: 14
N + α → 17
O + p. Částice α umožnily objev dalších reakcí,
které vedly k objevu neutronu a také k objevu umělé radioaktivity. Byly to tyto reakce:
9
Be + α → 12
C + n (objev neutronu – Chadwick 1932)
27
Al + α → 30
P + n (P je radioaktivní – Joliotovi 1934, umělá radiace)
30
P → 30
Si + e+
Působení záření γ může rovněž docházet k jaderným reakcím. Tak např. pro energii vyšší než
2.2 MeV dochází k fotodesintegraci: 2
H + γ → 1
H + n
9
II. Přírodní zdroje ionizujícího záření
V této kapitole se budeme zabývat zdroji a vlastnostmi záření. Předpokládá se znalost základních
vlastností hmoty jako je stavba atomů, atomového jádra a molekul. Tyto základní informace lze
nalézt ve skriptech (Hrazdira a Mornstein, 1999). Pro doplnění poznatků lze doporučit knihu
Klener V., 2000.
2. 1. Objev radioaktivního záření
V listopadu 1895, na Universitě ve
Wurzburgu, zkoumal Wilhelm Roentgen
světélkující fluorescenční stínítko.
Fluorescence v něm byla indukovaná katodovými
paprsky, jež vznikaly po dopadu
elektronů na antikatodu ve vakuové
trubici (obr. 21). Zjistil, že fluorescence
nemizí ani při zaclonění trubice černým
papírem a usoudil, že se jedná o
neviditelné záření nazvané později paprsky
X (Roentgenovy paprsky). Když vložil
Roentgen mezi lampu a stínítko ruku,
uviděl ke svému velkému překvapení kosti
prstů. Během dvou měsíců publikoval
pečlivý popis výsledků svého výzkumu.
Roentgen obdržel za svůj objev v roce
1901 Nobelovu cenu. Katodové trubice
byly vlastně prvními jednoduchými
urychlovači elektronů (viz urychlovače
částic v kap. 1.3.1.).
Přirozenou radioaktivitu objevil v
roce 1896 francouzský fyzik Antoine
Henri Becquerel. Becquerel znal práce
Roentgena, což vedlo k tomu, že v
prosinci 1895 “vyfotil” ruku své ženy tak,
že ji umístil do svazku paprsků X. Na
fotografické desce se objevil
nezapomenutelný obraz kostí s prstýnkem
(obr.22). Becquerel se zabýval zkoumáním
solí uranu, které nejprve exponoval na
slunci, poté zabalil do černého papíru a na
fotografických deskách pak obdržel obraz
krystalků uranu. Domníval se, že sluneční
paprsky indukují v uranu záření. Koncem
února 1896 bylo nad
Paříži zataženo, Becqurel
nemohl své krystalky osvítit a po zabalení do černého papíru očekával pouze slabý
obraz. Jaké však bylo jeho překvapení, když obrazy krystalků byly jasné. To
znamenalo, že uran emituje záření bez vnějšího zdroje energie. Becquerel takto
objevil přirozenou radioaktivitu. Přirozenou radioaktivitu začali intenzívně
studovat Pierre a Marie Curie (obr. 23). Po chemické extrakci uranu z uranové
rudy, Marie zjistila, že zbytek rudy je více radioaktivní než samotný uran. Dospěla
Obr. 21. Roentgenovo záření vzniká v rentgence při dopadu
elektronů na anodu nebo antikatodu. Většinou anoda slouží
pro vytvoření elektrického pole a do lampy se vkládá další
elektroda – antikatoda pro dopad elektronů, kde se tvoří
záření. Dole je anoda, nahoře katoda, uprostřed antikatoda
odkud vychází záření. Schéma lampy je zobrazeno na horním
obrázku, dole je reálná Roentgenová lampa (historický
exemplář).
Obr. 22.
10
tak k závěru, že ruda obsahuje další prvek - také radioaktivní. To vedlo k objevům
prvků polonia a radia. Manželé Curie obdrželi v roce 1903 Nobelovu cenu za jejich
práce o radioaktivitě. Na počest Marie Curiovi byl název “curie” zvolen za jednotku
aktivity. Marie Curie získala jako první na světě další Nobelovu cenu v roce 1911.
Zbytek života věnovala studiu radia a jeho použití při léčbě rakoviny.
Záření vždy bylo a je součástí životního prostředí člověka. Existuje celá
řada zd
a urychlovače
přírodě se setkáváme se 3 druhy radioaktivního rozpadu: rozpadem alfa, beta a gama.
Rozpad
K přírodnímu pozadí dále podstatně přispívá kosmické záření, které se dále dělí na
galakti
.2. α-záření
zek rychle letících jader helia, tj. částic,
ho odstínění
stačí li
rní ozáření, ale spíše možnost vnitřní
rojů radioaktivního záření a lze je dělit z různých hledisek. Nejčastěji se
používá dělení na přírodní a antropogenní zdroje. Mezi přírodní zdroje patří
zejména terestriální záření, které vzniká většinou z rozpadových řad a kosmické
záření. Člověk vytvořil mnoho zdrojů záření: od Roentgenovy lampy, přes reaktory
až po terapeutické ozařovače. V praxi se záření používá v řadě oblastí lidské činnosti jako např. v
energetice, výzkumu, medicíně, apod. Popíšeme stručně nejčastější zdroje ionizujícího záření.
Obr. 23.
eMarie Curi
V
em se rozumí přeměna prvků na jiné prvky a s ní spojená emise záření. Budeme hovořit o
α-, β- a γ-záření. Na přírodní radioaktivitě pocházející ze zemských hornin se nejvíce podílejí
isotopy rozpadových řad - uranové a thoriové. Atomová hmotnost isotopu v řadě se dá vyjádřit
vztahem 4n+2, kde n je kladné číslo. Podobně pro thoriovou řadu platí, že atomová hmotnost je
dána jako 4n; pro aktiniovou 4n+3. Atomovou hmotnost 4n+1 mají isotopy v umělé neptuniové
řadě.
cké a sluneční. Oba tyto typy záření mají pro člověka význam, proto se o nich zmíníme.
Existují také radionuklidy, které jsou součástí lidského těla a ozařují organismus zevnitř. Patří mezi
ně např. draslík 40
K a 14
C. Jejich příspěvek k celkovému ozáření člověka je však malý (<10%).
2
α-záření je sva
které obsahují 4 nukleony (2 protony a 2 neutrony).
Jádro emitující α-částici sníží tedy své atomové číslo
o 2 a nukleonové číslo o 4 jednotky. Hmotnost jedné
částice je 4x1.67x10-27
kg. Energie částic α-záření
nabývá pouze určitých diskrétních hodnot, jež jsou pro
různé α-zářiče v rozmezí 4-7 MeV (mluvíme o tzv.
čárovém spektru). Čárové spektrum je dáno kvantovým
charakterem přechodů jader.
α-záření je málo pronikavé a k je
st papíru. Ve tkáni má doběh několik desítek
mikrometrů. Ztráty energie α-částice při průchodu
hmotou lze popsat v závislosti na energii pomocí
Bethe-Blochovy formule (obr. 24). Částice α ztrácej
energii v prostředí ionizacemi a excitacemi. Dolet částic
je dobře definován a závisí na jejich počáteční energii a
materiálu. U tohoto druhu záření není nebezpečné exte
kontaminace, kdy se radioaktivní izotop může zabudovat do organismu a ozařovat jej po celý život.
Poločas rozpadu souvisí s energií - čím je větší energie α-částic, tím je kratší poločas. Tak např.
pro
í
Obr. 24. Ionizační ztráty energie částice
v závislosti na její energii (vypočteno dle
Bethe-Blochovy formule)
239
Pu je energie 5.1 MeV a poločas 24 tis. let, pro 241
Am je energie 5.5 MeV a poločas rozpadu
je 433 let.
11
Důležitým isotopem emitujícím α-záření je radon
(226
Ra). Tento prvek vzniká při rozpadu radia v rámci tzv.
uran-radiové rozpadové řady a sám dále emituje
α−záření, stejně jako jeho dceřiné produkty (viz obr. 25).
Radon je za normálních podmínek v plynném stavu a
často se s ním setkáváme v uranových dolech, nevhodně
postavených domcích, jeskyních a také ve vodě, která
protéká uranovými rudami. Záření radonu působí při
vdechování na plícní buňky a způsobuje s určitou
pravděpodobností rakovinu. Vznik rakoviny plic byl
prokázán jak u horníků pracujících v uranových dolech,
tak u osob žijících v domcích se zvýšenou koncentrací
radonu. Příspěvek radonu k celkovému radiačnímu
pozadí závisí silně na lokalitě. V průměru se uvádí hodnota přibližně 2mSv/rok.
Obr. 25. Rozpad radia na radon a částici
alfa.
2.3. β-záření
β-záření je tvořeno rychlými elektrony (β-) nebo pozitrony (β+). Hmotnost elektronů nebo
pozitronů je asi 2000x menší ve srovnání s hmotností nukleonu. Energetické spektrum β-záření je
spojité vzhledem k tomu, že při β-rozpadu vznikají 3 částice (např. neutron se rozpadá βrozpadem
na proton, elektron a antineutrino). Přestože je celková uvolněná energie přesně určená
energetickými hladinami v jádře, rozdělí se neutron na 3 částice a každá z nich pak může odnášet
libovolnou energii. Maximální energie elektronů se může pohybovat v rozsahu od desítek keV
(např. 3
H má energii elektronů 19 keV) až po MeV (např. 32
P má energii 1.7 MeV).
β-záření je pronikavější než α-částice. K jeho odstínění je zapotřebí tlustší vrstva např. z
plexiskla (8-10 mm). β-záření ztrácí energii v prostředí rovněž prostřednictvím ionizací a excitací
atomů a molekul a pro výpočet ionizačních ztrát lze přibližně rovněž použít Bethe-Blochovu
rovnici. Elektrony jsou však značně lehčí v porovnání s α-částicem a ztrácejí tak méně energie na
jednotku dráhy. Proto mají také podstatně větší dolet. Při průchodu elektronů hmotným prostředím
dochází často k rozptylu elektronů a jejich dráha je proto značně klikatá. Elektrony mohou ztrácet
svou energii také emisí tzv. brzdného záření, jehož výtěžek závisí na energii elektronu a na
atomovém čísle prostředí. Pro přírodní zdroje β-záření činí ztráty brzdným zářením pouze malou
část celkových ztrát. Kladně nabité pozitrony jsou antičástice k elektronům a po zabrždění v
látkovém prostředí dochází proto k anihilaci pozitronu s elektronem.
Vzniklé záření se nazývá anihilační a má energii 511 keV (rovnou
klidové hmotnosti
elektronu).
Positron formuje v
přítomnosti elektronu
exotický atom zvaný
positronium (obr. 26). Atom
positronia je podobný atomu
vodíku, ale má 1000x menší
hmotnost. Jeho zvláštností
je, že s určitou
pravděpodobností dochází k jeho anihilaci, kdy se celá klidová
hmotnost obou částic mění na energii fotonů. Doba života je v oblasti
nanosekund, 1 gram uvolní energii rovnou 25 kilotunám TNT.
Positronium lze využít ke studiu materiálů, kdy se využívá tzv. předčasné anihilace positronu, který
je součástí positronia při kolisi s elektronem (obr.27). Je-li positronium uvězněno v určitém
materiálu, pravd. předčasné anihilace závisí na velikosti póru (pro větší je menší).
Obr. 26. Positronium ve srovnání s atomem
vodíku (proton a elektron)
Obr. 27. Studium materiálů pomocí
positronia. Dopadem positronia
na povrch dutiny může
dojít k předčasné anihilaci.
12
2.4. γ-záření
γ-záření je vlastně elektromagnetické záření o velmi krátké vlnové délce. Vzniká v důsledku
přechodu vzbuzeného stavu jádra na nižší energetickou hladinu. Vzbuzené jádro může vzniknout
po některém jiném rozpadu. Tak např. 60
Co se rozpadá na 60
Ni β-rozpadem, přičemž uvolněná
energie činí 0.3 MeV. Jádro niklu však zůstane ve vzbuzeném stavu a vyzařuje dva kvanta γ s
energiemi 1.17 a 1.33 MeV. Jak vidíme, spektrum γ-záření je čárové, jeho energie se pohybuje od
zlomku keV do několika MeV.
Pohlcování γ-záření hmotou se děje prostřednictvím třech hlavních jevů: fotoefektu,
Comptonova jevu a materializace fotonů. Při fotoefektu je předána veškerá energie fotonu na
elektron, který je nejenom uvolněn z atomu či molekuly, ale má také určitou kinetickou energii.
Comptonův jev je vlastně rozptyl, při kterém se sníží energie fotonu a rozdíl energií počátečního a
výsledného kvanta se předá elektronu (obr. 28). Při materializaci dochází ke vzniku elektronpozitronového
páru. Při tomto procesu musí být energie fotonu dostatečně velká (>1 MeV) a
dochází k němu pouze v blízkosti jádra atomu, neboť to vyžadují zákony zachování energie a
hybnosti. Absorpci fotonů hmotou lze popsat pomocí exponenciálního zákona, tj. na jednotku délky
je pravděpodobnost absorpce konstantní a závisí na energii fotonů a na vlastnostech látky. Platí
tedy, že
Obr. 29. Exponenciální zákon absorpce pro
gamma-záření (na rozdíl od určitého doletu pro
těžké částice).
Obr. 28. Comptonův jev na molekule vody. Energie
počátečního fotonu E se spočte jako součin Planckovy
konstanty a frekvence daného záření: E=h.ν .
I/Io=exp(-x/L),
kde I a Io jsou konečná a počáteční intenzita γ-záření, x je tloušťka látky a L je polovrstva absorpce
(obr. 29). Vidíme, že γ-záření vlastně nelze zcela odstínit. V rámci radiační ochrany je však
důležité snížit intenzitu pod úroveň přírodního pozadí. Při energiích do 1 MeV je vhodným
absorpčním materiálem olovo nebo uran. Je tomu tak proto, že absorpce γ-záření fotoefektem je
silnější pro větší Z prostředí. Vzhledem k vysoké pronikavosti γ-záření je u γ-zářičů velké
nebezpečí vnějšího ozáření. Přírodní pozadí od terestriálního γ-záření závisí na přítomnosti
radioaktivních hornin a činí přibližně 0.3-1 mSv/rok.
Energie emise i absorpce je kvantována – stejný prvek by měl γ-záření také pohlcovat tak
jak to je u atomů. To nebylo pozorováno vzhledem k posunu čar způsobenému odrazem jádra. V
krystalové mřížce při nízké teplotě se však možné kmity kvantují a energie se pak může předat celé
mřížce – posun je pak zanedbatelný. Rozladění zdroje a detektoru lze pozorovat při různých jevech
– např. Dopplerův jev (posun čár v důsledku pohybu zdroje) lze detekovat už při cm/s. Lze
detekovat gravitační posun čar způsobený rozdílem potenciálů pro rozdíl výšek 21 m.
13
2.5. Kosmické záření
Existují dva podstatně odlišné druhy kosmického záření a sice sluneční a galaktické.
2.5.1 Sluneční záření má směrový charakter a je tvořeno elektromagnetickým zářením a protony.
Jeho intenzita je závislá na sluneční aktivitě a může prudce a nečekaně narůstat v okamžiku
slunečních erupcí (obr. 30). Slunce prochází určitými
cykly s periodou 11 let, v jejichž průběhu se mění řada
parametrů. Při tzv. “solárním maximu” je na slunečním
povrchu pozorováno nejvíce skvrn, množství erupcí a
výronů hmoty do prostoru. Sluneční erupce vedou k
emisi rychlých protonů, které zesilují tzv. sluneční vítr a
způsobují záři na severní polokouli. Tato záře se ze
Země jeví jako závěs na nebi jenž světelkuje červeně a
zeleně. (obr. 31). Částice slunečního záření mohou
přerušit komunikaci prostřednictvím rádia, mohou vést k
ozáření posádky letadla dávkou srovnatelnou s
lékařským vyšetřením a mohou způsobit smrtelné ozáření
posádky kosmické lodi. Země je chráněná před tímto
zářením atmosférou. Pro předpověď slunečních erupcí
existují modely, které však nejsou zcela spolehlivé. Aktivita Slunce je monitorována družicemi.
Obr. 30. Jedna z největších slunečních erupcí
zachycená Skylabem v roce 1973.
2.5.2 Galaktické záření
Z hlubin vesmíru k nám přichází galaktické záření a to
ze všech stran. Obsahuje částice celého spektra
periodické soustavy prvků, přičemž existují maxima
výskytu pro některé prvky. Částice dosahují velmi
vysokých energií (až 1017
eV), které doposud nebyly
dosaženy v pozemských urychlovačích. Při dopadu do
zemské atmosféry interagují částice galaktického záření s
atomy a vzniká velký počet sekundárních částic.
Galaktické záření má také své maximum a minimum,
které souvisí se slunečním cyklem. To proto, poněvadž
sluneční záření vyvolává magnetické pole ve Sluneční soustavě, které potom ovlivňuje galaktické
záření. Toto pole má maximální účinnost ve slunečním maximu, kdy je tedy nejslabší příspěvek od
galaktického záření. Galaktické záření přispívá k radiační zátěži cestujících a zejména pak posádek
v letadlech. Tak např. ve výšce 10,000 m je dávková rychlost přibližně 50 mSv/rok; na povrchu
Země činí pouze 1-3 mSv/rok. Sluneční záření neohrožuje cestující v letadlech, protože má malou
energii. Pouze při velkých erupcích může být jeho příspěvek na vysokých letových hladinách v
řádu 0.1 mSv/hod.
Obr. 31. Polární záře nad Severní Dakotou
21.listopadu 2002
Kosmické záření produkuje při dopadu do zemské atmosféry sekundární částice, z nichž
některé doletí až na povrch Země. Jak primární, tak sekundární záření je pohlcováno atmosférou, a
proto má jeho intenzita maximum v určité výšce (zhruba 20 km), která však závisí na zeměpisné
šířce. Na zemském povrchu činí příspěvek tzv. tvrdé složky sekundárního kosmického záření k
radiačnímu pozadí zruba 0.5 mSv/rok. Je tvořena převážně miony, které mají poločas rozpadu
2.10-6
s a mohou tak při své rychlosti urazit v atmosféře dráhu i několika desítek kilometrů. Miony
dosahují rychlosti blízké rychlosti světla a doba letu se pro ně prodlužuje v důsledku dilatace času.
Rozpadem mionů vznikají záporné i kladné elektrony, které tvoří tzv. měkkou složku kosmického
záření. Lze ji odstínit vrstvou olova o tloušťce 10 cm. Tvrdá složka kosmického záření může
proniknout i metrovou vrstvou olova a lze ji pozorovat i pod zemí a pod hladinou moře.
14
III. Zdroje záření vytvořené člověkem
Člověk vytvořil mohutné zdroje záření, které mohou být použity pro účely radiobiologického
výzkumu. Z druhé strany je však třeba se před těmito zdroji chránit. Ve výzkumu se používají
urychlovače - největší přístroje, které kdy člověk stvořil; v průmyslu se zdroje záření používají pro
řadu účelů, např. pro defektoskopii; v energetice zaujímají významné místo jaderné elektrárny; v
medicíně se zářením provádí diagnostika a léčí se zhoubné nádory. Podáme jenom stručný přehled
těchto zdrojů záření a jejich základních vlastností důležitých z radiobiologického hlediska.
3.1. Urychlovače
Urychlovače jsou zařízení, která udělují vysokou rychlost subatomovým částicím jako jsou
protony, elektrony a další elementární částice nebo také ionty, tj. jádra různých atomů. Tyto částice
získají urychlením vysokou energii a jsou vyvedeny na terčík, kde kolidují s jádry atomů, jež jsou v
terčíku obsaženy. Z interakcí vznikají další částice, které jsou zachyceny v detektorech. Z
informace poskytnuté detektory fyzikové vyvozují vlastnosti hmoty. Čím je větší energie částic, tím
detailnější informace o hmotě lze získat. Proto je snaha stále zvyšovat energii urychlovačů a stavět
větší a větší zařízení. Urychlovače se používají také v průmyslu např. pro implantaci iontů
(povrchovou úpravu materiálů), ve výzkumu jiném než fyzikálním (např. radiobiologickém nebo
biologickém), pro radioterapii a produkci isotopů vhodných pro diagnostiku.
Urychlovače se dělí na dvě velké kategorie: lineární a kruhové. U lineárních urychlovačů
vzrůstá energie částic na výstupu s jejich délkou. V kruhových urychlovačích se částice pohybují
po kruhové dráze a mnohokrát oběhnou urychlovač než získají potřebnou energii a dopadnou na
terčík.
3.1.1. Lineární urychlovače
Tyto urychlovače jsou tvořeny dlouhou trubicí s dostatečně vysokým vakuem, v nichž je na jedné
straně zdroj částic a na straně druhé se nachází terčík. Nedílnou součástí urychlovače je zdroj
vysokého napětí (např. Van de Graaffův generátor). Napětí je přivedeno na elektrody urychlovače.
Částice procházejí potenciálovým rozdílem mezi elektrodami a nabývají na rychlosti a energii.
Nejjednoduššími a nejrozšířenějšími urychlovacími zařízeními jsou vlastně obrazovky televizních
přijímačů, monitory počítačů nebo elektronové mikroskopy. Jsou to katodové trubice, v nichž se
urychlují elektrony. Zdrojem elektronů je žhavené vlákno. Přivedením vysokého napětí dochází k
urychlení na energii několika desítek keV. Elektrony jsou vychýleny a rozprostřeny po celé
obrazovce kde po dopadu budí světlo.
První lineární urychlovače s vysokým napětím byly konstruovány ve dvacátých létech
minulého století. Sestávaly ze dvou elektrod
umístěných do vakuové trubice, mezi kterými byl
potenciálový rozdíl 100 kV. Tyto urychlovače byly
nazvány podle svých autorů Cockcroft-Waltonovy
generátory. V současné době se nejčastěji
setkáváme s van de Graaffovým lineárním
urychlovačem. V tomto urychlovači se náboj
nanáší pomocí výboje na izolační pás, kterým je
přenášen na terminál s vysokým napětím.
Potenciál na terminálu se zvyšuje dokud se proud
přenášený pásem nevyrovná se zpětným proudem z
terminálu. Kvůli úniku náboje se obvykle terminál i
trubice vkládají do nádrže s izolujícím plynem.
Napětí se do urychlovací trubice přivádí po
částech, na několik elektrod. Jako zdroj iontů se
Obr. 32. Princip tandemového urychlovače. Záporně
nabité ionty z uzemněného iontového zdroje jsou
urychovány směrem ke středu, kde se nachází terminál
s vysokým napětím. Tam se změní náboj iontů
průchodem přes tenkou folii. Elektrický náboj se
přenáší na páse. Vysoké napětí (5 MV) je izolováno
od země izolujícím plynem, který je navíc pod tlakem.
15
používá vhodný plyn umístěný do elektrického výboje. Velikost proudu ve van de Graaffově
generátoru může činit několik mikroamper.
Moderní van de Graaffův generátor je znázorněn na obr. 32, kde je napětí přiváděno
doprostřed generátoru, zatímco oba konce jsou uzemněny. Záporně nabité ionty jsou urychlovány
od zdroje směrem ke středu trubice. Tam je tenká folie nebo tenká vrstva plynu v níž se ionty zbaví
několika elektronů a jejich náboj se změní ze záporného na kladný. To umožní další urychlení iontu
v druhé polovině trubice. Tento tzv. tandemový urychlovač může udělit iontům dvojnásobnou
energii ve srovnání s jednostupňovým zařízením. Van de Graaffovy urychlovače jsou v současné
době dostupné komerční přístroje, u nichž se napětí pohybuje v rozmezí 1-25 MV. Používají se při
analýze materiálu, hmotové spektrometrii apod. Jeden z největších van de Graaffových generátorů
se používá již mnoho let v Daresbury (Velká Británie). Jeho urychlovací trubice je dlouhá 42 m a
jeho terminál ve středu trubice udrží potenciál až 20 MV (obr. 33).
Lineární urychlovače s opakovaným
urychlením. Urychlení v lineárním
urychlovači se může uskutečnit v jednom
kroku nebo opakovaně tak, že se v trubici
nachází více cylindrických elektrod, na které
je přiváděno vhodné časově závislé napětí.
Tento urychlovač zkonstruoval norský fyzik
Rolf Wideröe. Jestliže použijeme
vysokofrekvenční zdroj napětí o stálé
frekvenci a přivedeme toto napětí na sérii
elektrod umístěných podél lineárního
urychlovače, můžeme dosáhnout opakovaného
urychlení ve štěrbinách mezi elektrodami.
Elektrody se však musí postupně prodlužovat, protože částice letí čím dál, tím rychleji (mluvíme o
lineárním vysokofrekvenčním urychlovači). Poněkud odlišnou konstrukci použil později Luis
Walter Alvarez, který vytvořil uvnitř cylindrických dutin stojatou vlnu nesoucí urychlované částice.
Vývoj radarových systémů v průběhu druhé světové války vedl ke zdokonalení konstrukce
vlnovodičů, které byly použity pro konstrukci urychlovačů.
V těchto urychlovačích se elektromagnetické vlny šíří
rychlostí světla, což umožňuje urychlování elektronů, jež se
také pohybují takto rychle. Elektrony jsou neseny
elektromagnetickou vlnou jako surfař na vlně v moři. V
současné době existuje pro vědecké účely zhruba 130
lineárních urychlovačů pro elektrony a positrony a 50 pro
ionty včetně protonů. Největší energie dosahují elektrony ve
SLACu (Stanford Linear Accelerator Centre) (obr. 34). V
Los Alamos je protonový lineární urychlovač na jehož
výstupu mají protony energii 800 MeV. Tento 800 m
dlouhý urychlovač je jádrem LAMPFu (Los Alamos Meson
Physics Facility). Lineární urychlovače se často používají
jako injektory pro kruhové urychlovače. Tisíce lineárních
urychlovačů se používá v nemocnicích pro radioterapii
nádorů.
Obr. 33. Tandemový urychlovač v Daresbury (Velká
Británie).
Obr. 34. Lineární urychlovač ve
Stanfordu byl zkonstruován Burtonem
Richterem a je 3 km dlouhý. Energie
elektronů zde dosáhla v roce 1976
20 GeV.
3.1.2. Kruhové urychlovače
Kruhové urychlovače využívají magnetické pole pro zakřivení dráhy částice. První kruhový
urychlovač sestrojil r. 1931 Lawrence a nazval jej cyklotronem. V Evropě byl první cyklotron
16
sestrojen v Paříži v roce 1938. Cyklotron má poměrně jednoduchou konstrukci. Je tvořen vakuovou
komorou cylindrického tvaru, v jejímž středu se nachází iontový zdroj, z něhož jsou emitovány
částice pro urychlení. Schéma je znázorněno na obr. 35. Částice se pohybují po spirálovité dráze
(černá čára uvnitř červených duant) a jejich rychlost se
zvyšuje průletem mezi duantami (červeně), což jsou
elektrody s vysokofrekvenčním napětím (červená krabice),
které je ovšem uvnitř duantu odstíněno a nepůsobí nijak na
částice. Používá se konstantní magnetické pole o indukci B,
jež směřuje kolmo na dráhu částice (nástavce magnetu jsou
znázorněny šedě). Po dosažení okraje urychlovací komory
je rychlost částice největší a její dráha je odkloněná tzv.
deflektorem do výstupního kanálu, který vede k terčíku. Pro
cyklotron lze napsat jednoduché rovnice, které vysvětlí jeho
funkci. Částice jsou přitahovány střídavě k jedné a druhé
elektrodě, na níž se pravidelně mění napětí. Aby stále
docházelo k urychlování, musí částice se Z elementárními
náboji obíhat se stejnou úhlovou rychlostí ve všech fázích
urychlovacího procesu. Síla (F), která na částici působí je
rovna F=e.(v × B), (1)
kde v je vektor rychlosti částice, B je vektor magnetické
indukce a e je elementární náboj. Tato síla se musí rovnat
odstředivé síle F = m.a, (2)
kde m je hmotnost částice a a je vektor zrychlení a lze je
napsat jako součin poloměru r
Obr. 35. Schéma cyklotronu. Uvnitř
cylindrické komory (není znázorněna) se
nachází iontový zdroj, který produkuje
částice, a půlkruhové elektrody - duanty
(červeně), na které je přivedeno
vysokofrekvenční urychlovací napětí
(červená krabice).
, čtverce úhlové rychlosti ω2
a jednotkového vektoru v radiálním
směru. V cyklotronech je magnetické pole kolmé na pohyb částice a lze tedy psát: m.v.ω=e.v.B,
protože v=r.ω. Po zkrácení v dostaneme:
ω = eB/m. (3)
Vidíme, že úhlová rychlost je tedy konstantní a nezávisí na poloměru nebo na rychlosti částice. Pro
maximální rychlost dostaneme při poloměru urychlovače R:
vmax=R.e.B/m. (4)
Výstupní rychlost a tedy i energie roste s poloměrem urychlovače a s intenzitou magnetického pole.
3.1.2.1. Synchrocyklotron
Funkce cyklotronu má své omezení zejména v tom, že
hmotnost částice závisí na její rychlosti dle relativistického
vztahu m=mo√1/(1-β2
), kde β=v/c a c je rychlost světla ve
vakuu. Pro v→c dostaneme m→∞. Proto rovnice (3) platí
pouze pro nižší rychlosti. Tento problém lze řešit snížením
frekvence elektrického pole přiváděného na duanty v
průběhu každého urychlovacího cyklu (V.I. Veksler a
E.M.McMillan, 1944). Takovému urychlovači se pak říká
synchrocyklotron. Pro ilustraci je na obr. 36 uveden
synchrocyklotron v Upsale (Švédsko). Je zřejmé, že takový
přístroj nemůže pracovat spojitě, neboť snižováním
frekvence lze vyhovět podmínce (3) jen pro ionty, které
vstoupily do komory současně. Proto dostáváme na
výstupu synchrocyklotronu shluky iontů s maximální
energií. Přitom nezáleží příliš na tom, jak rychle se
frekvence mění. Platí zde totiž princip fázové stability,
který vede k tomu, že opožděné ionty dohánějí urychlovaný shluk a ionty s předstihem se urychlují
Obr. 36. Cyklotron v Upsale (Švédsko) byl
postaven po válce (1950) a urychluje protony
na energii 185 MeV. Vakuová komora je
vidět pod magnetem (žlutý) vážícím 600 tun.
Výstupní kanály směřují dopředu.
Urychlovač byl v roce 1986 přestavěn na
cyklotron se sektorovou fokusací.
17
méně. Největší synchrocyklotron se nachází v Gatčině nedaleko Petrohradu a urychluje protony na
1 GeV. Železné póly magnetu mají v průměru 6 m, celý urychlovač váží 10 000 tun. Používá se pro
experimenty v oblasti jaderné fyziky a pro medicínské aplikace.
3.1.2.2. Isochronní cyklotron
Druhá možnost jak kompensovat přírůstek hmotnosti při rostoucí rychlosti je zesílení intenzity
magnetického pole pro větší poloměr dráhy. To však vede k rozostření (defokusaci) svazku v
horizontálním směru. V roce 1960 se objevil nový princip fokusace částic, který spočívá v
modulaci magnetického pole v úhlovém směru vložením železných sektorů do mezery v nástavcích
magnetu. Tento druh cyklotronu se nazývá isochronní cyklotron, protože frekvence urychlovacího
pole je zde konstantní. V současné době je v provozu řada těchto zařízení, která nahradila
synchrocyklotrony a mohou urychlovat prakticky libovolný typ iontů (např. cyklotron v
Bloomingtonu, Indiana; v Faure, Jižní Afrika; v Osace, Japonsko; ve Vancoovru, Kanada).
Cyklotrony se používají pro výzkum v oblasti jaderné fyziky, pro výrobu radionuklidů v medicíně i
průmyslu. Jedním způsobem využití izotopů je positronová emisní tomografie (PET).
3.1.2.3. Mikrotron a betatron
Cyklotron může v principu urychlovat také elektrony, avšak relativistický nárůst jejich hmotnosti
vede k tomu, že podmínka (3) přestává být splněná už pro malé energie. Variantou cyklotronu
určenou pro elektrony je mikrotron, v němž je urychlovací štěrbina umístěná na okraj dráhy
elektronů. Urychlení elektronů při jednom průchodu štěrbinou se volí tak, aby se doba oběhu v
kolmém magnetickém poli prodloužila o celý násobek urychlovací frekvence.
Pro dosažení energie elektronů v řádu desítek až stovek MeV se používá betatron. V
betatronu jsou elektrony urychlovány změnou toku magnetické indukce podle Faradayova zákona.
Elektrony obíhají ve vakuové kruhové trubici a jejich dráha se zakřivuje stejným magnetickým
polem, kterým jsou i urychlovány. Pro dosažení stability je nutné, aby magnetická indukce uvnitř
dráhy byla silnější než na jejím obvodu. V betatronech lze dosáhnout energie elektronů až stovek
MeV. Při vyšších energiích dochází ke ztrátám způsobeným brzdným zářením.
3.1.2.4. Synchrotrony se slabou fokusací
V principu neexistuje limit pro maximální energii isochronního cyklotronu. Konstrukce velkého
magnetu je však velmi nákladná. Proto se pro nejvyšší energie používá trubice s rovnými úseky,
které jsou sestaveny do kruhu a v jejichž spojích se svazek ohýbá ze směru jednoho úseku do směru
dalšího úseku pomocí elektromagnetu v němž se v průběhu urychlovacího cyklu zvětšuje intenzita
magnetického pole. Problémem kruhových urychlovačů jsou značné příčné kmity částic. Proto je
nutné potlačit tyto kmity. První synchrotrony řešily tento problém tzv. slabou fokusací, tj.
vytvořením gradientu pole směrem od středu k okraji. Takovým přístrojem byl Cosmotron v
Brookhavenu postavený v roce 1952 (urychloval protony na 3 GeV), Bevatron v Lawrence
Berkeley Laboratory, USA (6 GeV), synchrofazotron v Dubně, Rusko (10 GeV). V těchto
urychlovačích se pole mění z 0.02 T (tesla) až do 1.5 T pro maximální energii. Doba cyklu činí
méně než sekundu a počet částic v pulsu je 1011
. Synchrotrony se slabou fokusací musely mít
dostatečně velkou trubici s ohledem na kmity částic. Synchrotron v Dubně je poslední ještě
fungující s poloměrem 28 m a váhou magnetu 36 tis. tun.
3.1.2.5. Synchrotrony se silnou fokusací
V roce 1952 E.D.Courant, M.S.Livingston a H.S.Snyder navrhli princip silné fokusace. V
magnetech, které ohýbají svazek se střídá orientace radiálního gradientu, což vede při vhodné
konstrukci k zaostření svazku do další trubice. Díky silné fokusaci lze použít při stejných
výstupních energiích a intenzitách podstatně menší trubice i magnety. První synchrotron se silnou
fokusací byl postaven v roce 1954 na Cornelově universitě, Ithaca, USA. Pro počáteční urychlení
18
byl použit van de Graaffův urychlovač na 2 MeV. Po vstřiknutí částic do synchrotronu byla síla
pole 0.002 T, urychlení probíhalo za 0.01 sekundy a výsledná intenzita pole byla 1.35 T. V roce
1958 byl v Bonnu uveden do provozu první elektronový synchrotron na energii 500 MeV. Další
elektronové synchrotrony byly postaveny v Hamburgu (6 GeV), Cambridge (6 GeV) a v Tokiu (1.3
GeV). Doposud se používají protonové synchrotrony v Ženevě (CERN - evropská organizace pro
jaderný výzkum, 28 GeV) a v Brookhavenu (33 GeV), které byly postaveny záhy po objevení
principu silné fokusace.
V dalším vývoji došlo k oddělení magnetů
ohýbajících svazek a magnetů (kvadrupolových
čoček) určených pro fokusaci svazku obr. 37. Tyto
čočky "zaostří" svazek částic do středu urychlovací
trubice nehledě na energii částic (obr. 38). Jeden
z největších urychlovacích komplexů na světě se
nachází ve Švýcarsku, blízko Ženevy (obr. 39), kde
má laboratoř CERN. Tato laboratoř je příkladem
mezinárodní spolupráce, na které se účastní 20
členských zemí. Zkoumá se zde stavba hmoty a její
silové působení.
Zvýšení intensity magnetického pole lze dosáhnout
použitím supravodivé technologie. Supravodivé
magnety byly použity v několika malých "kompaktních" cyklotronech (East Lansing, USA). Pole
těchto urychlovačů činí 5 T a poloměr magnetů 1.5-2 m.
Maximální energie iontů činí 160 MeV. Pro velké
urychlovače byly supravodivé magnety použity poprvé ve
Fermiho laboratoři (Fermilab) u Chicaga. Tevatron - jak se
urychlovač nazývá - urychluje protony na 1 TeV.
Supravodívé magnety produkují pole až 5 T (obr. 40).
Obr. 39 Schéma urychlovacího komplexu v CERNu
(Ženeva). Prvním urychlovačem byl synchrocyklotron
postavený v roce 1954, paralelně s protonovým
synchrotronem (PS). Tento urychlovač v současné době
zásobuje ostatní zařízení částicemi.
Obr. 38 Kvadrupolové čočky slouží k udržení
svazku uvnitř urychlovací trubice (žlutě).
Obr. 37. Protonový synchrotron v CERNu urychluje
částice na 450 GeV. Ohýbající magnety jsou
červené, fokusující modré.
Obr. 40. Tevatron ve Fermilabu. Injektor je vpředu (3.2 km obvod) a
produkuje částice s energii 150 GeV. Tyto částice jsou injikovány do
Tevatronu - supravodivého protonového synchrotronu, který je
schopen urychlovat protony a v opačném směru antiprotony (tzv.
collider).
19
Komplex urychlovačů v CERNu
zahrnuje tzv. protonový
supersynchrotron, který je kruhovým
zařízením o průměru 6 km a je
umístěn pod zemí (obr. 41). Toto
zařízení urychluje protony a
v poslední době také antiprotony
v opačném směru. Slouží tak jako
roton-antiproton „collider“. Na tomto
n
s
pro zak y
p
urychlovači byly objeveny částice W
a Z, které jsou nositeli slabé interakce.
Lze zde rovněž urychlovat ionty olova
na energii 170 GeV/nukleon. To je
největší energie dosažená ve světě.
Pro urychlování elektronů slouží LEP
s tunelem dlouhým 27 km. Vnitřek
tunelu je na obr. 42. Tento urychlovač
v
částic (obr. 43) a
nazvaným LHC (large
hadron collider).
však bude nahrazen
ovým zařízením
yvinutým na bázi
upravodivých magnetů
řivení dráh
Obr. 42 Největším
urychlovačem je LEP (large
electron-positron collider),
jenž má obvod 27 km a jeho
komora je umístěna 100 m
pod zemí. Na obrázku je
Obr. 41. V roce 1970 byla
započata konstrukce protonového
supersynchrotronu s poloměrem
6 km. Za výsledky získané na
tomto urychlovači byla udělena
Nobelova cena.
vnitřek komory.
Obr. 43 LHC (large hadron collider)
– umožní sledovat kolise protonproton
při energiích 7 TeV. Pole
supravodivých magnetů bude mít
intensitu 8.3 T při teplotě 1.9 K.
hlazení bude zajištěno supratekutýmC
héliem pro 30 tis tun materiálu na
vzdálenost 27 km. Provoz má být
zahájen v roce 2006.
20
3.2. Jaderná energie
3.2.1.Jaderné zbraně
Koncem 30-tých let minulého století si mnozí vědci uvědomovali možnost řetězové jaderné
reakce, při které se uvolní obrovská energie. V této době byl v Německu u moci Hitler a
vědělo se, že němečtí vědci provádějí experimenty s cílem vyrobit jadernou bombu. Na popud
maďarského fyzika E. Tellera napsal proto A. Einstein dopis F.D. Roosveltovi, americkému
presidentovi, v němž ho upozorňuje na možnost vývoje mimořádně silné zbraně. Rozhodnutí
o projektu „Manhattan“ bylo přijato v prosinci 1941, kdy pod vedením R. Oppenheimera
začal v Los Alamos vývoj atomové bomby. Za účelem konstrukce bomby byly postaveny
továrny na výrobu uranu 235
U (Oak Ridge) a uvedeny do provozu v září 1944. Cílem projektu
Manhattan bylo vyrobit atomovou bombu dříve než Němci. Že byl tento projekt úspěšný bylo
prodemonstrováno 16. čevence 1945 v poušti Nového Mexika s názvem Trinity,
jihovýchodně od Los Alamos (obr. 44). President Truman se právě účastnil konference
v Postupimi. Večer druhého dne konference mu byla telegraficky zaslána zpráva o úspěšném
testu. Atomová bomba byla ke konci 2. světové války použita dvakrát, v Hirošimě (6.8.1945)
a v Nagasaki (9.8.1945).
Obr. 44 Pozemní atomový výbuch je provázen
vznikem typického hřibu. Obr. 45. Při podzemním
hlouben kráter o průměru
3.2.2. Termojaderné zbraně
Po válce došlo k rozpoutání „studené války“, tj závodů ve zbrojení. Rusové vyzkoušeli
atomovou bombu již v roce 1949. Informace pro její konstrukci získali od špiona K. Fuchse.
To vedlo vládu USA k pevnému rozhodnutí vyvinout silnější vodíkovou bombu, tzv. Hbombu.
Ta byla poprvé vyzkoušena v říjnu 1952 na Marshalových ostrovech.
Po válce začal také výzkum možností mírového využití atomové energie. Mluvilo se o
dolování, přetváření Země, budování přístavů, „kopání“ kanálů nebo tunelů, atd. V Nevadě
byl proveden test s podzemním výbuchem v hloubce kolem 200 m. Bomba měla sílu 100
ktun, byla odpálena 6. července 1962 a v důsledku jejího výbuchu vznikl kráter průměrem
400 m a hluboký 100 m (obr. 45). V té době vznikaly plány na rozšíření Panamského
průplavu. S časem se však ukázalo, že problémy s kontaminací jsou nepřekonatelné.
3.2.3. Jaderné reaktory a jaderné elektrárny
Využití atomové energie pro výrobu elektřiny začalo také hned po válce. Už v roce 1951 byl
v Idahu sestrojen experimentální reaktor, který zásoboval elektřinou 4 žárovky o výkonu
21
150 W. První reaktor, který produkoval dostatek energie pro celé město (BORAX III) byl
vyvinut v Aragonské národní laboratoři v Chicagu a spuštěn do provozu v roce 1955.
3.2.3.1. Palivový cyklus
Palivový cyklus je obecně známý pojem pro kroky potřebné k tomu, aby se přeměnila syrová
uranová ruda na jaderné palivo. Uran je poměrně hojný prvek v zemské kůře. Existuje několik
typů uranové rudy: uranit, gummit, carnotit, uranofan (USA, ČR, Zaire). Obsah uranu se liší
dosti podstatně od 0.05% až do 12%. V těchto rudách tedy uran není koncentrován, a proto je
potřeba těžit dosti velký objem horniny. Ten činil v roce 1997 celkově 35 tis. tun, z toho
nejvíce v Kanadě (12 tis. tun). Uran se těží několika způsoby podle uložení (povrchová těžba,
doly). Po vytěžení se uranová ruda mele, přidá se louh, který rozpustí uran. Výsledná kapalina
se dále zpracovává tak, aby se uran koncentroval a extrahoval. Přírodní uran sestává z 99.28%
238
U a pouze 0.71% 235
U. Vzhledem k tomu, že se 238
U jednoduše neštěpí, je nutné přírodní
uran obohatit o 235
U. Obohacení lze provést např. tak, že se nechá plyn UF6 difundovat přes
membrány s malými otvory, kde těžší isotop uranu difunduje trochu pomaleji. Obohacený
uran se konvertuje na UO2, který se vkládá do zirkoniových trubic.
ís
3.2.3.2. Štěpná reakce
Je to jaderná reakce, při které je
neutron absorbován jádrem 235
U,
233
U nebo 239
Pu načež dojede
spontánně k rozštěpení vzniklého
jádra na dva fragmenty a uvolní se
několik dalších neutronů (obr. 46).
U uvedených isotopů je vazebná
energie jádra tak malá, že po
zachycení neutronu jádro není
stabilní a rozpadá se. Štěpení zde
probíhá nezávisle na kinetické
energii neutronu a má velkou
pravděpodobnost ve srovnání
s absorpcí. U isotopu 238
U schází pro
rozštěpení energie zhruba 1 MeV, a
proto lze štěpení dosáhnout při
energii neutronu nad 1 MeV. Štěpení
je statistický proces, při kterém jak
atomové č lo, tak hmotnost nabývají
různých hodnot kolem střední
hodnoty, která činí zhruba 95 pro
lehčí fragment a 135 pro těžší. Také
počet neutronů se může lišit od nuly
do 6 i více a jejich kinetická energie
se pohybuje od 0.5 MeV do více než
4 MeV (nejpravděpodobnější je
energie 0.75 MeV, průměr činí 2
MeV). Uvolněná energie činí zhruba
180 MeV a dělí se mezi fragmenty
(165 MeV), γ-záření (7 MeV),
energii neutronů (5 MeV) a dále
Obr. 46 Štěpení jádra uranu na dva fragmenty a několik
dalších neutronů.
Obr. 47. Principiální schéma jaderné elektrárny.
„Kontejnment“ je nádoba, v níž se nachází reaktor s parními
generátory. V reaktoru se nachází palivo, moderátor a
regulační tyče. Teplo vznikající při štěpení paliva ohřívá
vodu, která pohání turbíny.
22
α-částice, neutrina atd. Neutrony vzniklé po štěpení je potřeba zpomalit, aby se zvýšil účinný
průřez pro další štěpení. Pro vyvolání řetězové reakce musí z uvolněných neutronů více než
jeden způsobit další štěpení. Toho lze dosáhnout při dostatečně hmotnosti (kritické hmotnosti)
štěpného materiálu. Ta činí 16 kg pro 233
U, 52 kg pro 235
U a 10 kg pro 239
Pu.
3.2.3.3. Jaderný reaktor
Jaderný reaktor sestává z reaktorové nádoby, v níž jsou umístěny palivové tyče s uranem
obohaceným o 235
U tak, aby vytvářely nadkritickou soustavu (obr. 47). Mezi nimi je umístěn
moderátor, který zpomaluje neutrony a regulační tyče, které nedovolují rozběhnutí řetězové
reakce. Regulační tyče obsahují materiál, který dobře absorbuje neutrony jako je kadmium
nebo bór. Materiálem vhodným pro zpomalování neutronů může být grafit, lehká nebo těžká
voda. Voda může zároveň sloužit pro chlazení reaktoru. Povytažením tyčí dojde ke spuštění
reakce a voda se začne ohřívat. Nádoba je většinou pod tlakem a přehřátá kapalina je vedena
k turbínám, kde se tepelná energie mění na elektrickou. To je ve zkratce princip jaderné
elektrárny. Existují jaderné elektrárny různých typů. Nejčastěji se setkáváme s tzv.
lehkovodním reaktorem, tj. reaktorem chlazeným vodou a to buď vodou zahřátou na bod varu
(tzv. BWR neboli boiling water reactor čili varný reaktor) nebo párou pod vysokým tlakem
(PWR neboli pressurized water reactor čili tlakovodní reaktor). Voda slouží zároveň jako
moderátor neutronů. První druh reaktoru je levnější, neboť je často jednookruhový, tj. voda
přímo žene turbíny, ale nákladnější za provozu, protože voda na turbínách je kontaminovaná.
Druhý systém vyžaduje tlakové potrubí, jehož problémem je těsnost a to za poměrně
nepříznivých podmínek. Časem mohou vznikat
praskliny potrubí na čemž má podíl silná
radiace. Dále existují tzv. rychlé reaktory, ve
kterých jsou neutrony produkované při jaderné
reakci využity pro vytváření dalšího paliva a to
zejména reakcí s 238
U, kdy transmutací vzniká
239
Pu. U těchto reaktorů je jádro tvořeno 235
U a
kolem tohoto jádra je rozmístěn 238
U; nepoužívá
se moderátor.
Jaderná energie se v současné době ve
světě široce využívá. Celkový podíl na světové
produkci energie je znázorněn v grafu (obr. 48).
Nejvíce jaderné energie je vyrobeno v USA.
Největší podíl má jaderná energie na celkové
energetické produkci ve Francii (obr. 48).
3.2.3.4. Jaderná energetika v České republice
V České republice existují dvě jaderné
elektrárny: Dukovany nedaleko Brna a
Temelín. Uspořádání jaderné elektrárny
v Temelíně (JETE) je následující. Jaderná
elektrárna je rozdělena do tří oddělených
okruhů. Primárního, to je jaderný reaktor,
hlavní cirkulační čerpadla, potrubí primárního
okruhu, parogenerátory, systémy chlazení a čištění, systémy transportu a manipulace s
jaderným palivem. Patří zde všechna zařízení, ve kterých se mohou vyskytovat radioaktivní
látky a kde poškození těsnosti by mohlo vést k úniku těchto látek do okolí. Většina těchto
zařízení je umístěna uvnitř hermetické obálky (kontejmentu), který je vyroben z předpjatého
betonu s vnitřní ocelovou výstelkou, která má tloušťku 8 mm a má dvě základní funkce:
Obr. 48. Podíl některých zemí na celosvětové
produkci jaderné energie. Je zřejmé, že nejvíce
jaderné energie vyprodukují USA, pak Francie a na
třetím místě je Japonsko. V histogramu dole je vidět
jaké procento celkové produkce energie činí v dané
zemi jaderná energie.
23
chránit okolí elektrárny před následky případné provozní havárie a naopak zase chránit vnitřní
zařízení před vnějšími vlivy (pád letadla). Této úloze odpovídá mohutná železobetonová
konstrukce kontejmentu, vysoká 56 m o vnitřním průměru 45 m. Shora vše uzavírá kulový
vrchlík. Stěny jsou silné 1,2 m a jsou vyplněny potrubím z umělé hmoty, kterým jsou
protažena ocelová lana, předepnuta na 1000 tun. Sekundární okruh tvoří systémy parního
potrubí přivádějící páru z parogenerátoru o teplotě 278,5 °C a tlaku 6,3 MPa, systémy úpravy
napájecí vody, turbosoustrojí a systémy přepouštěcích stanic. Třetím okruhem se chladí
kondenzátory turbín. Z tohoto systému jsou nejviditelnější, a tím i nejkontroverznější, 155 m
vysoké chladící věže, které, ať chceme, či ne, tvoří dominantu elektrárny a z estetického
hlediska nejsou zrovna přínosem pro vzhled krajiny. Pro upřesnění: k jednomu výrobnímu
bloku (reaktorovna + strojovna s turbínou) přináležejí dvě věže. Každá má patní průměr
130,7 m (fotbalové hřiště má asi 120 m), průměr v koruně 82,6 m, tloušťka stěny je 18 -
90 cm.
3.2.3.5.Problematika vyhořelého paliva
Jaderné elektrárny nemají za normálního provozu podstatný vliv na životní prostředí v jejich
okolí a produkují velmi čistou energii. Negativní stránkou těchto elektráren je možnost
nehody, a také problém s ukládáním vyhořelého paliva. Zhruba každých 18 měsíců je nutno
obnovit 1/3 jaderného paliva, které se již částečně vyčerpalo a jaderná reakce se udrží pouze
při hodně zvednutých regulačních tyčích. Palivové články se v jaderném reaktoru stanou
horké a silně radioaktivní. Pobyt po dobu 10 s ve vzdálenosti 1 m od článku by byl smrtelný.
Každá výměna paliva rektoru s výkonem 1000 MW vede k odpadu, jehož váha zhruba činí 30
tun a aktivita 5 mil Ci. Kromě toho, tento odpad produkuje 1.5 MW tepla. Vyhořelé palivo je
ukládáno do bazénů, kde zůstává několik měsíců až desítky let. Pak se pravděpodobně bude
ukládat do hlubinných úložišť. Množství tohoto odpadu je v současné době jenom v USA 42
tis. tun a doba potřebná na to, aby se jeho aktivita dostala na úroveň původní uranové rudy (tj.
přírodního pozadí) bude činit 3 mil. let.
V ČR se řeší problematika jaderného paliva následujícím způsobem. Vláda schválila
dne 15. 5. 2002 dokument nazvaný Koncepce nakládání s radioaktivními odpady a vyhořelým
jaderným palivem v ČR. Koncepce navrhuje dlouhodobou strategii státu v uvedené oblasti.
Koncepce doporučuje pokračovat v dosavadní praxi ukládání nízko a středně aktivních
odpadů do stávajících přípovrchových úložišť (Richard u Litoměřic, Bratrství u Jáchymova a
Dukovany) provozovaných SÚRAO. Pro vysoceaktivní odpady a vyhořelé jaderné palivo
bude podle tohoto vládního dokumentu připravováno hlubinné úložiště, jehož zprovoznění se
předpokládá kolem roku 2065. Až do té doby bude vyhořelé palivo z jaderných elektráren
skladováno v transportně-skladovacích kontejnerech umístěných v samostatných skladech
vybudovaných přímo v areálech obou jaderných elektráren. Koncepce dále říká, že bude dále
sledován a podporován rozvoj nových technologií, které by v budoucnosti mohly umožnit
využití vyhořelého jaderného paliva například v novém typu jaderných reaktorů. Koncepce
připomíná, že veškeré náklady na vyřazování jaderných zařízení a ukládání radioaktivních
odpadů nesou provozovatelé těchto zařízení a původci radioaktivních odpadů. Stát
prostřednictvím SÚRAO kontroluje a řídí tvorbu zdrojů vytvářených na specielních vázaných
účtech u bank či na jaderném účtu tak, aby byl zajištěn dostatek finančních prostředků na výše
uvedené činnosti.
24
IV. Rozdělení energie deponované zářením na mikroskopické úrovni
4.1. Mikrodosimetrie
4.1.1 Vydělování energie jako diskrétní a nahodilý proces Maximum 22 eV
Elektron s počáteční energií 20 keV ztrácí v první srážce
nejčastěji 22 eV, střední ztráta energie je 60 eV. Na obrázku
je rozdělení energie při jednom aktu předání energie hmotě
(při průchodu tenkou folií).
Depozice energie se může uskutečňovat ve formě
jednotlivých ionizací a excitací, které jsou však často
korelovány – vznikají shluky neboli klastry ionizací a excitací
(anglicky spurs nebo blobs). Střední hodnota 60 eV eV
Při ozáření buněčné kultury dávkou D nejsou všechny
buňky postiženy stejně, neboť dochází ke
fluktuacím absorbované energie. Tyto
fluktuace vyplývají z kvantové povahy
depozice energie. Uvažujme tedy malý
objemový element a průchod částic tímto
elementem (obr. 49). Nechť n je střední
počet částic prošedších tímto elementem.
Pak pravděpodobnost, že jím projde právě
m částic bude:
. .. .. .. .
. událostí předání
energie o velikosti εο...
.
... ...
.
m částic
P(m)=nm
exp(-n) /m!
dle Poissonova rozdělení. Hodnota m bude
tedy náhodná veličina. délka l
Pro jednu částici bude počet událostí
předání energie rovněž náhodnou veličinou.
Při určité hodnotě LPE bude střední počet
události
Obr. 49. Elementární objem, přes který prochází
částice, v expandované části je znázorněna struktura
stopy částice.
ν=LPE*l/εο ,
avšak přesný počet bude opět fluktuovat kolem střední hodnoty.
4.1.2 Sdělená energie
Při ozáření určitého objemového elementu lze definovat řadu fyzikálních veličin. Probereme
nejdůležitější. Sdělená energie: ε = Σεin – Σεex + ΣQ, kde první člen je součet energií všech
částic na vstupu, druhý člen je součet energií částic na výstupu a poslední člen je rozdíl součtů
všech energií uvolněných a všech energií spotřebovaných v přeměnách jader (podle
Einsteinovy formule).
Jednotlivé lokální události předání energie se označují jako „energy deposition
events“, česky budeme říkat události (akty) předání energie. Každá taková událost však může
sestávat z více interakcí, tj z více ionizací nebo excitací. Ionizace a excitace jsou v aktech
předání energie korelovány, tj vznikají blízko sebe v klastrech. Po ozáření pracujeme tedy v
mikroobjemech s počáteční distribucí ionizací a excitací – u každé máme souřadnice a
velikost předané energie. Pro jednu částici se tato distribuce označuje stopa částice (angl.
„track“).
25
4.1.3 Lineální energie
Je definována jako y = ε/lav, kde ε je energie sdělená v jednom průchodu částice
mikroobjemu ∆V, lav je střední délka tohoto mikroobjemu. Tato
veličina je mikroskopickým analogem LPE – je to energie na jednotku
délky. Pokud je LPE konstantní podél mikroobjemu, pak bude platit, že
ε=LPE . l
délkabude pro všechny události stejná. Pokud ovšem bude mít mikroobjem
nepravidelný tvar, pak dostaneme distribuci hodnot ε, která bude
odpovídat distribuci délek tzv. chord. Pro sféru dostaneme tuto
distribuci ve tvaru: f(l) = l/ (2.r2).
r
4.1.4 Distribuce lineální energie v kouli pro hustě ionizující částice
Distribuce chord pro kouli je tedy popsána trojúhleníkem: Distribuce délek je: f(l)= l/(2.r2),
kde platí že y=ε/lav=LPE.l/lav . Dosazením dostaneme: f(l).dl= y/LPE.lav/(2r2).dl=f(y).dy,
kde pro kouli platí lav=4/3.r a dy=LPE.dl/lav . Z toho plyne:
f(y)= 8/9.y/LPE2
f=1/r
l=2.r je max.
hodnota
f
Toto je frekvenční distribuce y; dávková
distribuce udávající rozdělení dávky na
frakce s lineální energii y bude:
d(y)= y.f(y)/yF
délka chordy
Na obr.50 a 51 jsou zobrazeny distribuce
lineální energie v kouli pro těžké částice (α-záření) a pro řídce ionizující záření (γ-záření).
Obr. 50. Experimentální distribuce lineální energie v
kouli pro hustě ionizující částice. Tato distribuce byla
změřena pro částice alfa s energií 5,3 MeV. Čárkovaně
je znázorněna teoretická trojúhelníková distribuce.
Experimentální body jsou vyznačeny tečkami. Plná čára
znázorňuje vliv stragglingu.
Obr. 51. Dávková
distribuce lineální
energie v kouli pro γ
záření. Distribuce d(y)
pro záření γ-60
Co pro
sféru s průměrem 1 µm,
resp. 8 µm (vyšší
křivka).
26
4.1.5 Specifická energie
Definice: z=ε/m, kde ε je sdělená energie a m je
hmotnost mikroobjemu. Jednotkou je J/kg, název
Gray. Pro specifickou energii platí, že (1) z je
definována pouze pro konečné oblasti
(mikroobjemy), hodnoty se mění nespojitě v čase a prostoru, nelze ji tedy připsat rychlost
změny, (2) z nelze předpovědět, pravděpodobnost určité hodnoty však určit lze. Zatímco
lineální energie se vztahuje k jednomu průchodu částice, specifická energie se vztahuje k
dávce D. Pro některé účely je však vhodné zavést také specifickou energii pro jeden průchod
částice. Pak bude platit:
z=lav.y/m
Pro kouli dostaneme: z=a.y/(2r)2 , kde a=0.2 pro keV, µm a Gy.
4.1.5.1. Frekvenční a dávková distribuce specifické energie při jednom průchodu částice
mikroobjemem
Uvažujme nejprve jeden průchod částice mikroobjemem V. Pak rozdělení spec. energie z
budeme označovat f1(z). Pro kouli platí, že f1(z)=2.z/a2, kde a je maximální z pro průchod
částice středem koule, tj. a=LPE.2r. Známe-li funkci f1(z), můžeme spočítat střední hodnotu z
jako:
zF=∫z.f1(z).dz
Pro distribuci frakce dávky d1(z) s jednoprůchodovou spec. energii z platí:
d1(z)=z.f1(z)/zF
a střední hodnota:
zD=∫z.d1(z).dz = 1/zF. ∫z2f1(z).dz
Střední hodnoty jsou pro některé druhy záření uveden v Tabulce 1.
Tabulka 1. Střední hodnoty spekter specifické (měrné) energie pro jeden průchod částice a
pro různé sféry a různé druhy záření
27
4.1.5.2. Distribuce specifické energie f(z,D)
Funcke f(z,D) popisuje fluktuace energie v mikroobjemech při dávce D. Tyto fluktuace budou
tím větší, čím:
a) bude menší dávka - pro malé dávky bude f(z,D) blízká f1(z); s rostoucí dávkou
nabývají distribuce f(z,D) Gaussova rozdělení se střední hodnotou blízkou dávce D
b) pro velké LPE jsou fluktuace větší a naopak
c) s rostoucím průměrem mikroobjemu se f(z,D) přibližuje normálnímu rozdělení se
střední hodnotou D
Vztah mezi f1(z) a f(z,D)
Nechť fn(z) je rozdělení spec. energie z při n-aktech (průchodech částice) přes mikroobjem.
Pak lze psát:
f(z,D) = Σ h(n).fn(z),
kde h(n) je Poissonovo rozdělení (vzhledem k nezávislosti částic na sobě).
Poissonovo rozdělení při střední hodnotě počtu částic m=σ.F, (průřez krát fluence) lze psát ve
tvaru:
h(n) = exp(-m) mn/n!.
Funkce fn(z) lze vypočítat z funkce f1(z) pomocí konvolučních integrálů:
fn(z)=∫f1(w).fn-1(z-w).dw
Zapisuje se také: fn(z)=f1(z)*fn-1(z).
Pro velmi malou dávku bude:
f(z,D)=exp(-m).(f0(z) + m/1!.f1(z) + m2/2!.f2(z) + ...)
= (1-m).fo(z)+m.f1(z)
Z tohoto vztahu je zřejmé, co nutno dosadit za funkci:
fo(z)=δ(z),
je Diraková delta funkce: δ=0 pro z≠0 a integrál ∫δ(z).dz=1.
Pro výpočet fm(z) se použije Laplaceovy transformace. Nalezněme nejprve obraz
funkce f1(z):
Tato funkce se dá pro sféru napsat jako:
kde p=x+i.y je komplexní proměnná. Podle Laplaceovy teorie se m-násobná konvoluce dá
zapsat jako m-tá mocnina Laplaceova obrazu, tj.:
28
Abychom nalezli funkci fm(z), musíme tedy spočítat zpětnou transf ormaci m-té mocniny
funkce F1(p):
Tento integrál lze upravit na:
w
0
kde w a x lze vybrat tak, aby byl výpočet dostatečně přesný: w=20/(m-1), x=1/m.
Lze ukázat, že funkce f(z,D) má důležitou vlastnost:
která umožňuje tabelovat funkce fm(z) pro a=√2. V paměti počítače lze např. uchovat
hodnoty fm(z) pro zi=z1,z2,…z30 při m=2, 3,.. 500 v rozmezí hodnot zmin až zmax, kde
zmin=(0.57-0.74/m).m. √2, zmax= (0.75+0.5/√2).m. √2 (empiricky zjištěné hodnoty). Takto
spočtená funkce f(z,D) dává:
∫f(z,D)=1 s přesností 1%
Příklady výpočtu f(z,D) následují na obr. 52-53.
Obr. 52. Funkce fm(z) pro m=1, 2, 3, 4, 8, 16 při
střední hodnotě absorbované energie a=√2. Pro
výpočet funkcí pro konkrétní částice lze použít výše
zmíněné transformační rovnice. Je vidět, že pro
m=1 je funkce trojúhelníková, pro vyšší hodnoty m
se rozdělení rozšiřuje a posouvá doprava.
Obr. 53. Závislost tvaru f(z,D) na hodnotách
dávky, LPE=LET a poloměru koule (čísla v
závorkách). Pro větší dávku se rozdělení rozšiřuje a
posouvá k vyšším z (šířka se však zvětší méně, tj
rozdělení se blíží Dirakově delta funkci pro vysoké
hodnoty dávky. Pro větší LET se rozdělení rozšíří,
tj. fluktuace energie narostou.
29
4.2. Struktura stopy částice
4.2.1. Vizualizace stopy částice.
Výpočty podle funkce f(z,D) předpokládají, že stopa
částice je nekonečně tenká a LPE se předává rovnoměrně
podél ní. Ve skutečnosti má stopa určitou strukturu. Na
obr. 54 je vidět stopy částic uhlíku s energiemi 400 a 0.7
nohem tlustší
stopu.
Jednotlivé
akty předání
pozorovat a
MeV/u. Je vidět, že pomalejší částice má m
energie lze
t
všechny procesy jako
4.2.2.Distribuce lokální dávky ve stopě částice
Pokud budeme uvažovat malý objem v určité zdálenosti od osy
topy částice, můžeme v tomto objemu změřit průměrnou
řes řadu částic,
Obr. 54. Iont uhlíku ve
speciálním plynu, který umožňuje
vizualizaci. Energie 400 MeV/n
vlevo, 0.7 MeV/n vpravo
o například
v bublinové nebo mlžné komoře – ve formě
malých bublinek, které se hromadí podél stopy.
V bublinové komoře, která je plněná tekutým
vodíkem, vznikají bubliny tam, kde se iont nebo
elektron-iontový pár stane kondenzačním
centrem přehřáté kapaliny. Bublinky lemují
dráhy částic, které jsou takto vizualizovány.
Podobně lze stopy částic pozorovat v jaderných
emulzích, kde průchod částice způsobuje
zčernání zrnek emulze. I zde můžeme pozorovat
rozdíly mezi tenkými a tlustými stopami částic.
Kromě toho lze stopy částic modelovat
MC výpočty, při nichž se
pružné a nepružné rozptyly, interakce částic
modelují tak, že je jim přiřazená určitá
pravděpodobnost. Počítá se distribuce bodů
v prostoru v nichž vznikají sekundární částice,
přiřazují se jim směr a rychlost (energie).Obr. 55. Vypočtené stopy protonů a iontů
uhlíku s energiemi 0.2, 1 a 10 MeV/u ve vodě.
Energie sekundárních částic je odlišena barevně
– od 10 do 1000 eV.
v
s
dávku. V praxi to musíme provést integrací p
jímž vymezíme dráhu v malém válcovém prostoru a kolem
tohoto válce „roztáhneme prostor“ snížením tlaku tkáňekvivalentního
plynu, ve kterém umístíme měřící komůrku (ta
bude představovat mikroobjem).
Obr. 56. Závislost střední lokální dávky na příčné vzdálenosti od osy stop
modely, které závislost popisují (Katz, Chatterjee), a také výsledek MC výpoč
y částice. Křivky představují různé
tu.
30
Závislost dávky na vzdálenosti od osy stopy částice lze
popsat více modely (obr. 56). Popis zde dále uvedený
má výhodu v tom, že lokální dávku lze integrovat přes
průřez stopy a jako výsledek dostaneme hodnotu LPE
částice. Střední lokální dávku popíšeme odlišnými
funkcemi pro jádro stopy (oblast několika nanometrů) a
polostín (penumbra) tvořený δ-elektrony (obr. 57):
Obr. 57
D(x) = 8.2x104.(1-k).LPE pro x<rmin
D(x) = 5.0x106.(1/E).(Ze/x)2 pro x>rmin Jádro stopy Polostín
kde D(x) je v cGy, x je vzdálenost od středu stopy částice v nm, k je frakce LPE předávané
δ−elektrony (pro rmin=1 nm to činí 0.45), E je energie na nukleon částice v MeV/nukleon,
Ze je efektivní náboj částice:
Ze = Zo(1-exp(-125.β.Zo
2/3))
(korigovaný na záchyt elektronů při letu částice), Zo je náboj částice, rmin je rozměr jádra
stopy částice: rmin ≈ 1 nm, rmax je maximální dolet δ-elektronů (rozměr stopy částice) v nm:
Obr. 58r
rmax = 40.E1.75.
Integrál této funkce přes průřez stopy musí dát LPE:
∫ D(x) . ρ . 2πx.dx = LPE.
Jádro stopy se výrazně liší od δ-elektronů hustotou ionizace a tím i biologickým účinkem.
Rozlišujeme proto energii vydělenou stopou částice z1 a energii vydělenou δ-elektrony – z2.
Platí, že
z1=(1-k)*z,
z2=k.z
Část z této energie se předává ve srážkách, kterých se neúčastní jádro stopy. Označme tuto
část předávané energie Fg a zkusme ji určit (viz obr. 58).
Frakce energie (nebo dávky) δ-elektronů, která se přenese cylindrickému objemu
velikosti r z celkové energie (dávky) těmito elektrony přenášené bude zhruba rovna (obr. 59) :
r rmax
∫1/x2.2πx.dx / ∫1/x2.2πx.dx = ln(r/rmin)/ln(rmax/rmin)
rmin rmin
a frakce komplementární bude ln(rmax/r)/ln(rmax/rmin).
31
Přesnější výpočet dává hodnotu zhruba poloviční; zároveň kvůli asymptotickým vlastnostem
je vhodnější přičíst r do čitatele prvního zlomku (pak bude pro velké objemy Fg=0):
Fg=0.5 ln((rmax+r)/r)/ln(rmax/rmin)
Obr. 59
r
Část dávky předávaná stopou čistě ve formě jen δ-elektronů bude
zg = z2.Fg
a komplementární část dávky bude:
zd = z1+z2.(1-Fg).
Tato frakce dávky bude fluktuovat zhruba stejně jako jádro stopy (viz obr.59), zatímco první
části dávky bude velmi podobná co do vlastností γ-záření.
Funkce f(z,D) pak bude mít první člen sestávající z pravděpodobnosti, že přes objem neprojde
ani jedna částice (exp(-n)) a Dirakovy delta funkce:
∞
f(z,D) = e-n.δ(z-zg) + Σ P(m).fm(zd)
1
Dosazením za P(m) a fm z dříve uvedených rovnic dostaneme algoritmus pro výpočet f(z, D)
funkce. Tento algoritmus lze uplatnit v řadě případů při výpočtech radiobiologických účinků.
32
V.Radiační chemie
Energie vydělená částicemi hmotě se většinou mění na kinetickou energii elektronů, které
vytvářejí klastry ionizací a excitací (obr. 60, 61). Energie na jeden akt je nejčastěji 22 eV, v
průměru pak 60 eV. To je tzv. fyzikální
stadium účinku záření. Po předání
energie se začínají odvíjet fyzikálněchemické
procesy spočívající v
interakcích radikálů a jejich další
přeměně. Vzhledem k tomu, že buňky a
tkáně, kterými se budeme zabývat,
obsahují z velké části vodu, budeme se
věnovat radiační chemii vody a dále se
zastavíme u působení radikálů na
organické molekuly, zejména DNA,
které představuje hlavní terč pro účinek
záření v buňce.
Obr. 60. Řídce ionizující záření vytváří různě veliké shluky
ionizací a excitací (spurs, blobs), krátké stopy.
5.1. Radiolýza vody
Radiolýza vody vede ke vzniku radikálů, které jsou dále
reaktivní a produkují další silně reaktivní produkty
schopné vyvolávat oxidační poškození.
Radiolýza vody byla studována už velmi dávno –
od objevu radioaktivity. Výzkumníci, kteří se první
zabývali účinkem záření na vodu (včetně Becqerela)
zjistili, že radiová emenace (radon) rozkládá vodu na
vodík a kyslík. To bylo vysvětlováno disociací molekul
vody na jednotlivé atomy.
Další studie s vodou bez kyslíku vedly ke
stanovení produkce H2 a H2O2, který byl přisuzován
reakci primárních radikálů H•
a OH•
. Rozklad peroxidu pak vysvětluje vznik kyslíku. Účinek
záření na biologické molekuly umístěné ve vodním prostředí je obvykle podstatně vyšší v
přítomnosti kyslíku než v anaerobních podmínkách. To bylo přisuzováno vzniku
hydroperoxyradikálů HO2
•
, jež vznikají v reakci atomů vodíku s molekulárním kyslíkem.
Obr. 61. Hustě ionizující záření
vytváří stopy ionizací a excitací s
postranními stopami pocházejícími
od d-elektronů.
5.1.1. První představy o radiolýze vody
Na základě výše uvedeného máme tedy následující rovnice pro radiolýzu:
1) Excitovaná molekula vody se štěpí na vodíkový a hydroxylový radikál
H2O* → H• + OH•
2) Interakce radikálů vedou ke vzniku peroxidu vodíku a vodíku
OH• + OH• → H2O2
H• + H• → H2
3) Rozklad peroxidu objasňuje vznik kyslíku
2.H2O2 → 2.H2O + O2
4) Interakce vodíkového radikálu s molekulárním kyslíkem objasňuje vyšší účinek v
přítomnosti kyslíku, protože hydroperoxyradikál je velmi reaktivní
H• + O2 → HO2
•
33
Tato přímočará teorie radiolýzy vody setrvala pak až do počátku 60-tých let 20. století, kdy se
objevily nové zdroje záření (LINAC) a při vysokých dávkových rychlostech bylo možné
měřit konstanty produkce radikálů. Bylo zjištěno, že tyto konstanty neodpovídají uvedeným
rovnicím.
5.1.2. Objev hydratovaného elektronu
V roce 1962 Hart a Boag objevili při pulsní
radiolýze vody hydratovaný elektron (e-
aq).
Ozařování čisté vody krátkými pulsy elektronů z
LINACu generovalo velmi silný a široký
absorpční pás s maximem na 720 nm, který byl
přisouzen (eaq)
(obr. 62).
Možnost vzniku stabilizovaného
elektronu ve vodě postuloval v roce 1950
Platzmann na základě teoretických studií.
Poprvé byl experimentálně pozorován při studiu
radiolýzy halogenových iontů UV světlem.
Volný elektron (tzv. suchý) existuje ve vodě
pouze velmi krátkou dobu (ps)
Obr. 62. Absorpční spektra produktů radiolýzy
vody – vlevo jsou to radikály HO2
•
a OH•
, vpravo
je to hydratovaný elektron (e-
aq).
5.1.3. Vlastnosti hydratovaného elektronu
Interakce hydratovaného elektronu: Existenci
hydratovaného elektronu lze prokázat jeho
reakcemi. Tak např. zánik hydratovaných elektronů je urychlován přítomností produktů jež
reagují s elektrony jako je H+, O2, N2O. Reakce s N2O je důkazem přítomnosti elektronů,
neboť jiné produkty s N2O tak intenzivně nereagují (hydratované elektrony se dají
kvantitativně stanovit podle N2):
N2O + e- + H+ → N2 + OH•
Podle soudobých představ rychlé sekundární elektrony ztrácejí energii sérií interakcí
dokud se nestanou termálními elektrony, tj. jejich energie je srovnatelná s tepelným pohybem.
To nastane za zhruba 10-11
s. Tyto tepelné elektrony interagují se
sousedními molekulami vody dielektricky. Hydratovaný elektron
si představujeme jako elektron uprostřed malé dutinky ve vodě
obklopen vrstvou orientovaných vodních molekul (dipólů) s
kladným nábojem uvnitř (obr. 63). Tato struktura má vzbuzené
stavy; není přesně definovaná – má široké maximum absorpce. - + -
-
+
++
-
+++
Z chemického pohledu je hydratovaný elektron aniontem
k H atomu:
e- + H+ → H•
eaq
je nejsilnější redukční činidlo s redukčním potenciálem -
2.9 V při pH 7.0, eaq
je konvertován na O2
- za přítomnosti O2
Obr. 63. Hydratovaný elektron
34
Struktura vytvořená kolem hydratovaného elektronu vytváří kladný elektrický
potenciál v místě elektronu. To znamená (z hlediska kvantové mechaniky), že elektron může
v tomto potenciálu nabývat pouze určitých energetických stavů – podobně jako v atomu
vodíku. Může být také excitován a může pohlcovat světlo. To je pozorováno při pulsní
radiolýze. Výsledné spektrum je dosti široké což lze vysvětlit rychle se měnícím okolím
elektronu – molekuly vody se rychle v hydratačním obalu zaměňují. Vlastnosti hydratovaného
elektronu jsou shrnuty v následující tabulce:
Absorpční maximum: 715 nm
Extinkční koeficient při 715 nm: 18 500 mol-1
dm3
cm-1
Difúzní konstanta: 4.9 10-9
m2
s-1
Redukční potenciál: -2.9 V
Poločas života v čisté neutrální vodě: 2.1 10-4
s
G-hodnota: 2.7
5.1.4. Soudobé představy o radiolýze vody
Primární interakce záření s vodou vedou ke vzniku ionizované vody (H2O+), excitovaných
molekul vody (H2O*) a rychlých elektronů :
1) H2O (excitace) → H2O*
2) H2O (ionizace) → H2O+ + e-
3) Zpomalující se elektrony
Další osud těchto produktů během přibližně 10-11s je následující:
Obr. 64. Schéma radiolýzy vody
Elektrony
Elektrony jsou zpomalovány a mohou následně interagovat:
1) interakce s vodou: e- + H2O → H2O- → H• + OH-
2) interakce s vodou za vzniku hydratovaného elektronu
3) interakce s H+ za vzniku H
Hydratovaný elektron je relativně stabilní a jeho interakce s vodou je málo pravděpodobná
(střední doba života je 2.10-4s)
H2O+ iont
je nestabilní a rozpadá se za 10-13 s na OH• a proton H+, který interaguje s molekulou okolní
vody a vzniká OH• radikál a H3O+
H2O+ + H2O → OH· + H3O+
35
Následná sekundární reakce je
e + H3O+ → H· + H2O
Excitovaná molekula H2O*
se rozpadá a vzniká nevelké množství radikálů H•
H2O* → H· + OH·
kromě toho může H2O* disociovat za vzniku p, eaq
a OH•
5.1.5. Radiolýza vody v přítomnosti kyslíku
Za přítomnosti kyslíku musíme přidat tyto reakce:
eaq
+ O2 → O2
H•
+ O2 → HO2
•
Kyslík nereaguje s OH• radikály. Výše uvedené rovnice jsou vázané, neboť dochází k
disociaci
HO2
• ↔ O2
- + H+
Vzniklé primární produkty jsou nestabilní a mění se na molekuly:
2HO2
• + 2H2O → 3H2O2 + O2
O2
- + O2
-+ 2H+ → H2O2 + O2
V roztocích obsahujících kyslík je zvýšená produkce peroxidu vodíku a kyslík se částečně
regeneruje.
Peroxid vodíku může reakcí s hydratovaným elektronem zvyšovat produkci reaktivních OH•
radikálů: eaq
+ H2O2 → OH• + OHTabulka
2 Nejdůležitější sekundární reakce při radiolýze vody (i s kyslíkem) s reakčními konstantami.
36
5.1.6. Rekombinace v klastrech a stopách
Vznik sekundárních produktů se kvantitativně daří vysvětlit za předpokladu rychlých reakcí,
které probíhají v klastrech nebo stopách, kde je dostatečně vysoká koncentrace primárních
produktů. V klastru je zhruba 2-5 ionizovaných nebo excitovaných
vodních molekul a jeho rozměr je několik nm. Během 10-11
-10-10
s
aktivní produkty reagují tak jak bylo popsáno, ztratí svou energii a
difundují do okolí. Uvnitř klastru nebo stopy částice dochází k
rekombinaci:
1-5 nm
Obr. 65.
H• + H• → H2
H· + OH· → H2O
OH· + OH· → H2O2
OH· + H2O2 → HO2
· + H2O
Na obr. 65 jsou zeleně molekuly prostředí, červeně a modře jsou
znázorněny různé typy radikálů. Shluk může dosahovat 1-5 nm.
5.1.7. Pravděpodobnost vzniku produktů radiolýzy ihned po ozáření: G [počet/100 eV]
Pravděpodobnosti vzniku jednotlivých produktů radiolýzy vody před reakcemi v klastrech.
Typické hodnoty jsou uvedeny v tabulce 3a. Kromě těchto produktů vzniká ještě H+
a OH-
,
což však nemá velký význam, neboť tyto ionty jsou ve vodě přítomny ve velkém množství.
Hodnoty G po proběhnutí reakcí v klastrech jsou uvedeny v tabulce 3b.
Tabulka 3a Produkce prvotních radikálů (G hodnoty)
Radiation G(H2+H2O2) G(e-aq) G(H) G(OH)
x-rays, electrons 0.1-20 MeV 0 4.78 0.62 5.6
Tabulka 3b Hodnoty G po proběhnutí reakcí v klastrech
Radiation G(-H2O) G(H2+H2O2) G(e-aq) G(H) G(OH)
x-rays,
electrons 0.1-
20 MeV
4.08
pH 3-13
1.13 2.63 0.55 2.72
12 MeV alpha
2.84
pH 7
2.19 0.42 0.27 0.54
Polonium
alpha, 3 MeV
3.62
pH 0.46
3.02 0 0.60 0.50
Jak je z tabulky vidět, pravděpodobnosti vzniku jednotlivých produktů radiolýzy vody závisí
na pH a na LET záření.
5.1.8. Výsledek radiolýzy vody
V čisté vodě ozářené řídce ionizujícím zářením prakticky nenastává dekompozice, neboť
radikály reagují s molekulárními produkty za vzniku vody:
H2O2 + H•
→ H2O + OH•
H2 + OH•
→ H2O + H•
37
V přítomnosti kyslíku vzniká určité množství peroxidu.
Pro vysoké LET – je více molekulárních produktů a termální dekompozice peroxidu
dává kyslík. Proto může např. v reaktorech, kde vzniká velká hustota toku neutronů a tím i
odražených protonů a těžších fragmentů, docházet k produkci směsi vodík + kyslík, což je
nebezpečné. Aby se předešlo nebezpečí, je vodík katalyticky vázán.
5.1.9. Teorie reakcí ve sférických shlucích radikálů
Prvotní ionizace a excitace vznikají v klastrech (řídce ionizující záření) nebo ve stopách
(těžké částice). Vzhledem ke krátké době vzniku prvotních radikálů 10-11
s budou také tyto
radikály na počátku v klastrech a stopách.
Základní vlastnosti těchto klastrů lze získat řešením klasické časově závislé
difúzní rovnice pro izolovaný klastr s předpokladem kompetice mezi 3 reakcemi:
1) bimolekulární reakce primárních radikálů vzniklých radiolýzou
2) reakce radikálů s vychytávači
3) difúze primárních radikálů do vnějšího media, kde mohou rekombinovat a reagovat s
různými dalšími molekulami
Předpokládá se dále gaussovské (zvonkovité) rozdělení
radikálů v radiálním směru (v difúzní teorii se tato geometrie
nazývá „bodovým zdrojem“). Určitá frakce radikálů reaguje
mezi sebou v klastru a vytvoří se tak molekuly; ostatní uniknou
do okolního prostředí, kde už probíhají homogenní reakce.
Na obr. 66 jsou různou barvou zobrazeny různé typy radikálů
ve shluku (klastru). S časem radikály vzájemně reagují a mizí a také se rozplývají do okolí.
Obr. 66. Klastr radikálů
5.1.10. Ve stopách po částicích vznikají cylindrické shluky radikálů
Hustě ionizující záření se modeluje jako „cylindrický klastr“ (obr. 67). Tato geometrie
odpovídá cylindrickému zdroji radikálů. Analýza vede k závěru, že produkce molekul
rekombinací radikálů bude vyšší než pro řídce ionizující záření. To
souvisí s hustotou prvotních radikálu ve stopě, které mají malou šanci ze
stopy difundovat bez interakce s jiným radikálem. Ve stopách částic je
vyšší také produkce peroxidu vodíku, který se uvolňuje kyslík. Reálná
situace je komplikovanější vzhledem k překryvu klastrů a stop vzhledem
k různým interakčním konstantám primárních reakcí. Proto jsou
používány počítače pro realistickou simulaci celého procesu.
5.1.11. Reakce vodních radikálů s dalšími látkami
Po termalizaci počátečních produktů vytvořených v prvotních
reakcích za přibližně 10-11s začíná další – chemické stádium účinku
záření. Chemické reakce probíhají v blízkosti klastrů nebo stop
částic a jsou tedy nehomogenní, tj. koncentrace nejsou uniformni.
Podle přítomnosti další látek ve vodním roztoku nastává velký počet reakcí, z nichž většina
nemá velký význam.
Obr. 67. Cylindr s radikály
S časem se radikály rozplynou
do okolí (vpravo).
1. Hydratovaný elektron reaguje s: ionty kovů (Cd2+, Cu+, Fe2+), nenasycenými
alifatickými sloučeninami (acetylén, acetaldehyd, tetranitrometan), halogenovanými
uhlovodíky (chloroform), aromatickými sloučeninami (benzofenon, nitrobenzen),
sloučeninami jež obsahují síru (cysteine, cystamine) a s bázemi nukleových kyselin
(purin, thymin, uracil);
2. OH• reaguje rychle s oxidovatelnými ionty (Br-, CNS-, I-. Fe(CN)6
4-) a organickými
sloučeninami s různou strukturou (alkoholy, akrylamide, formiát, etylacetát, nitrometan,
38
pyridin, benzen, anilin, fenol), sloučeninami obsahujícími síru (cystin, cysteamin),
aromatickými aminokyselinami (fenylalanin, tyrosin, tryptofan) a různými dalšími
biologickými molekulami (ribósa, thymin, uracil, glukóza).
3. Reakce H· a HO2
· jsou podobné jako u OH• ale obvykle pomalejší.
5.1.12. Frickeho dosimetrie
Radiolytická oxidace iontů Fe2+ na Fe3+ se používala od roku 1930 pro měření
absorbované dávky (tzv. Frickeho dosimetrie). Frickeho dosimetr sestává z roztoku 1mM
Fe2+ při pH 0.46. Konverze iontů Fe2+ na Fe3+ se měří spektrofotometricky. Konverzní
faktor je G=15.5 pro záření s nízkým LET.
Vzhledem k závislosti G na LET záření má tento druh dosimetrie omezené použití. Je
to však důležitý nástroj pro zkoumání kinetiky vychytávání radikálů (scavengers).
Konverze Fe2+ → Fe3+ může nastat působením radikálů HO2
•, OH•, a H2O2. Lze
ukázat, že v přítomnosti kyslíku každý vzniklý radikál
H•
vede k přeměně 3 iontů Fe2+,
OH•
radikále vede k přeměně 1 Fe2+ a
H2O2 vede k přeměně 2 iontů Fe2+.
V anaerobních podmínkách se mění počet přeměněných iontů Fe2+ u
H•
radikálů ze 3 na 1.
Takto lze spočítat ze známé produkce radikálů hodnotu G Frickeho dosimetru. Pomocí
oxidace iontů železa lze studovat vychytávání radikálů, tj roli tzv. nepřímého účinku záření,
roli kyslíku, kompetici vychytávání apod.
5.1.13. Reakce produktů radiolýzy vody s biologickými molekulami
Existuje řada reakcí produktů radiolýzy vody s biologicky důležitými molekulami:
1) Oddělení vodíku:
R-H + H•→ R• +H2
R-H + OH•→ R• +H2O
2) Disociace:
R-NH3
+ + eaq
- → R• + NH3
R-NH2 + H• → R• + NH3
3) Sloučení radikálu s molekulou:
R1-CH=CH-R2 + OH•→ R1CHOH-CH•-R2
5.1.14. Osud radikálů biomolekul
Radikály biologických molekul mohou rekombinovat nebo mohou být fixovány na nevratná
poškození (bude probráno podrobně později):
1) Restituční procesy (probíhají za účasti endogenních sloučenin obsahující S-H skupinu, tzv.
thiolů):
R• + H • → RH
R+ + e- → RH
2) Fixace radikálu kyslíkem:
R• + O2 → RO2
•
Takto fixovaný radikál se už neúčastní restitučních procesů.
3) Vznik poškození biomolekuly způsobeného radikálem (R• nebo RO2
•)
39
5.1.15. Reakce s vychytávači radikálů
Důležité jsou reakce s vychytávači radikálů (látkami, které zmenšují účinek záření
zneškodňováním radikálů). Jsou to:
1) Alkoholy:
OH• + CH3CH2OH → CH3C•HOH + H2O,
kde vzniknuvší alkoholový radikál je daleko méně reaktivní.
2) Cystein a cysteamin: obsahují sulfidivý můstek ve skupině -CH2SH, který reaguje s OH
radikálem podobně jako u alkoholů:
OH• + -CH2SH → -C•HSH + H2O,
Tyto látky jsou v radiobiologii velmi dobře známy jako protektivní činidla.
5.1.16 Přímý a nepřímý účinek záření
Produkty radiolýzy jsou velmi reaktivní radikály. Proto je zřejmé, že u látek rozpuštěných ve
vodě bude působení záření dvojí (obr. 68):
1) přímý účinek poškozením molekuly dané látky
nepřímý účinek
přímý účinek
Nin/No2) nepřímý účinek působením vodního radikálu
U přímého účinku je frakce inaktivovaných molekul v
roztoku dána dávkou a nezávisí na koncentraci (každá
molekula má určitou pravděpodobnost zásahu). Naopak
při nepřímém účinku záření se radikály vychytávají na
přítomné látce a čím bude její koncentrace nižší, tím více
jich připadne na jednu molekulu a účinek bude větší.
Proto frakce inaktivovaných molekul látky v důsledku
nepřímého účinku záření roste s klesající koncentrací látky.
koncentrace
Obr. 68. Přímý a nepřímý účinek
v závislosti na koncentraci
ozařované látky
5.2. Radiolýza biologických molekul
Radiolýza biologických molekul je často velmi komplexní proces. Např. ozáření vodního
roztoku glycinu (nejjednodušší aminokyselina) vede ke vzniku mnoha produktů včetně NH3,
H2, CO2, CHOCO2H, HCHO, CH2NH2. Informace o produktech nám poskytují zejména
dvě metodiky:
1) Pulsní radiolýza při pokojové teplotě dává informaci o prvotních i sekundárních
produktech
2) Elektronová paramagnetická resonance (EPR) ozařovaných krystalů, prášků a
zmražených roztoků dává informaci o časných stádiích
První metoda vede k optickým spektrům a kinetice, která pomáhá identifikovat
přechodné produkty. Reakce OH• radikálů se zkoumá přidáním N2O tak, aby roztok byl
saturován – tím se eaq
- mění na OH• . Naopak hydratované elektrony jsou preferovány
přidáním t-butanolu, který konvertuje OH• na relativně nereaktivní alkoholové radikály.
5.3. Radiační efekty v plynech
Radiolýza plynů může vést ke vzniku iontů, excitovaných molekul a volných radikálů.
Existuje řada technik pro jejich měření včetně měření toku iontů, hmotnostní spektrometrie,
pulsní radiolýzy, izotopové značení apod. Často pozorujeme vznik excitovaných molekul:
M → M*
a nepřímou excitaci neutralizací iontového páru:
M → M+ + e- → M*
40
Excitační energie může být přenesena na jinou molekulu:
M* + m → M+ m*
což se nazývá „kolisí druhého řádu“. Alternativně může být excitační energie emitována jako
optická fluorescence
M → M + světlo
nebo může být ztracena kolisí s jinou molekulou.
Excitované molekuly se mohou rozpadat na radikály:
M* → A• + B•
nebo na molekulární produkty: M* → C + D
5.3.1. Radiolýza kyslíku
Molekulární kyslík byl vždy středem zájmu vzhledem k jeho důležitosti v radiobiologii a
vzhledem k reakcím v atmosféře. Byly identifikovány následující primární reakce:
O2 → O2
+ + eO2
→ O+ + O· + eO2
→ 2 O·
O2 → O2*
Rekombinace elektronů s ionty vede ke vzniku kyslíkových atomů
O2
+ + e- → 2O·
O+ + e- → O·
Záchyt elektronu generuje ionty O2
- :
O2 + e- → O2
-
Reakcí
O· + O2 + M → O3 + M
vzniká ozon. Zde M je jiná molekula kyslíku nebo stěny nádoby, která funguje jako třetí
těleso, aby byla zachována energie a hybnost.
5.4. Radiolýza alkoholů a některých sacharidů
Radiolýza alifatických alkoholů vede k oddělení
vodíkového atomu z hydroxylové skupiny. Např.
radiolýzou glukózy vznikají produkty znázorněné na obr.
69. Odtržení vodíku může nastat pro CH(OH) a CH2OH
místa.
Řada reakcí nastává u polysacharidů. Praktickými
následky jsou křehnutí papíru, celulosová vlákna a plasty
ztrácejí pevnost ovoce a zelenina měknou kvůli degradaci
pektinu.
5.5. Radiolýza proteinů
Proteiny obsahují mnoho reaktivních míst pro radiolýzu.
1) eaq
- reaguje s histidinem, cystinem, asparaginem,
argininem a aromatickými minokyselinami, tryptofanem tyrosinem a fenylalaninem.
Obr. 69. Radiolýza glukózy. Radikály
vznikají na různých pozicích uhlíku.
2) OH• radikál reaguje se všemi aminokyselinami v místě peptidové vazby a s některými
dalšími funkčními skupinami, např. indolovou skupinou tryptofanu; velmi reaktivní jsou
také SH a SS skupiny v aminokyselinách obsahujících síru.
41
3) H• radikál reaguje s alifatickými aminokyselinami mnohem pomaleji než OH• , výjimku
představují aromatické aminokyseliny a ty, které obsahují síru.
Interakce záření s proteiny není z hlediska osudu ozářené buňky důležitá, neboť v buňce je
velký počet molekul proteinů a mohou být v případě potřeby syntetizovány. Daleko
důležitější je osud unikátních molekul – takovou molekulou je DNA.
5.6. Radiolýza DNA
DNA je z hlediska biologického účinku záření zdaleka nejdůležitější molekula.
Ionizující záření deponuje svou energii jednak v samotné molekule DNA (přímý účinek), ale
také v rozpouštědle (vodě) a dalších rozpuštěných molekulách (nepřímý účinek), což velmi
komplikuje situaci i v dobře definovaných roztocích. V buňce to představuje velmi těžko
řešitelný problém. Reakční konstanty pro jednotlivé báze jsou uvedeny v tabulce 4.
Tabulka 4. Pro jednotlivé báze jsou reakční konstanty vodních radikálů následující
Z tabulky je vidět, že reakční konstanty jsou poměrně velké pro OH radikály a pro
hydratované elektrony.
Nepřímý účinek záření na DNA, tj působení radikálů se projevuje až do vysokých
koncentrací DNA. Reaktivitu jednotlivých radikálů lze celkem snadno určit tak, že necháme
vychytávat jinou látkou ostatní radikály. Bylo zjištěno, že oproti očekávání založeného na
reakčních konstantách z předchozí tabulky je nejúčinnější OH•
radikál, následuje (eaq)
a na
posledním místě je H•
. Konstanty reakčních rychlostí jsou:
OH•
+ DNA ...... 3.108
mols-1
H•
+ DNA ...... 8.107
eaq+
DNA .... 1,4.108
OH radikál se při své difúzní konstantě může pohybovat jen velmi omezeně – střední
vzdálenost difúze lze odhadnout na 3,5 nm (pro porovnání má DNA příčný rozměr 2.2 nm a
vzdálenost bazí je 0.34 nm).
Oproti očekávání je role hydratovaných elektronů při poškození DNA zářením
podstatně menší. To lze ukázat přidáním N2O k roztoku DNA. Molekuly N2O kvantitativně
transformují hydratované elektrony na OH• radikály a počet poškozených DNA molekul ve
stejném poměru vzroste.
Ačkoli je produkce a reaktivita H• radikálů nízká, nelze ji zanedbat. To ukazuje
následující experiment: Je-li anoxický roztok DNA saturován vodíkem, poškození DNA
zářením se nemění (i když lze předpokládat interakci OH• radikálů s vodíkem a měly by
vznikat H• radikály). Lze soudit, že účinek H• radikálů je stejný jako účinek OH• radikálů.
42
Je-li však použitá směs vodíku a kyslíku v poměru 1:10, poškození je redukováno 10x.
To lze vysvětlit tak, že H2 reaguje s OH• radikály a vznikají H• radikály – v nepřítomnosti
kyslíku zřejmě způsobují stejné poškození jako OH•. Kyslík z druhé strany chrání před H•
radikály, takže poškození vzniká pouze působením OH• radikálů.
5.6.1.Radiolýza DNA – typy poškození
Rozlišujeme následující typy poškození DNA
(obr. 70):
1) jednoduché zlomy DNA (SSB)
2) dvojité zlomy DNA (DSB)
3) poškození báze
4) ztráta báze
5) lokální denaturace
6) intramolekulární crosslinky
7) intermolekulární crosslinky
Tyto typy poškození se vzájemně
nevylučují a často vznikají společně (např.
zlomy mohou být doprovázeny poškozením
bazí, oblastmi lokální denaturace apod.).
Četnost vzniku těchto poškození závisí na
podmínkách experimentu; velmi zhruba
vzniká v buňce 1 SSB na 100 eV (tj. G= 1),
produkce DSB je o řád nižší (1 DSB na 1000-
2000 eV, G=0.05). Poškozených bazí je více než SSB. V roztoku
vše závisí na koncentraci. Dávkové závislosti mohou být často nelineární a nelze tedy
hodnotu G vůbec udat. Za nejdůležitější jsou považovány zlomy DNA.
lokální denaturace
ztráta báze
poškození báze
jednoduchý zlom
dvojitý zlom
intramolekulární
crosslink
intermolekulární
crosslink
Obr. 70. Poškození DNA
1) jednoduché zlomy DNA – jsou zlomy mezi cukrem a fosfátovou skupinou v
jednom etězci. Mechanismus vzniku SSB: zřejm
interagují z 20% přímo s cukrem v DNA a z
80% s bázemi, kde rozrušují dvojné vazby a
způsobují vznik radikálů bazí. Tyto radikály se
často přenášejí do 4-té polohy na pentoze, což
uvolní fosfátovou skupinu.
2) dvojité zlomy DN
ř ě existuje více mechanismů; OH radikály
A – dva SSB proti
sobě, m
5.6.2. Zlomy DNA
nikají z radikálů pentózy.
echanismus může být různý. V roztoku
to mohou být dva náhodně vzniklé SSB proti
sobě; v buňce to je spíše důsledek přímého
průchodu částice v blízkosti obou řetězců DNA,
kdy v okolí stopy vzniká řada radikálů, které
zasáhnou oba řetězce.
Zlomy DNA vz
V principu může radikál vznikat na libovolném
atomu uhlíku avšak radikály na prvním a
druhém uhlíku vznikají málo vzhledem k tomu,
že tyto pozice jsou ukryty v malém žlábku
DNA. Jednoduché zlomy DNA vznikají většinou z
které tam můžou vzniknout buď přímo nebo přenesením radikálu báze do 4-té pozice pentózy.
Obr. 71. OH•
radikál interaguje s poly(U) a dojde
k jeho zachycení na uracilu, kde se zruší dvojná
vazba a vznikne radikál. Ten se přenese na 4-tou
pozici pentózy v jiném místě řetězce a vzápětí
vzniká zlom
radikálů na 4-té nebo 5-té pozici pentózy,
43
Na obr. 71 je znázorněna interakce OH• radikálu s molekulou DNA a vznik radikálu. Radikál
posléze interaguje uvnitř poly(U) řetězce a přenese se na pentózu na 4-tý uhlík. Tato pozice je
nejcitlivější z hlediska vzniku zlomu DNA. Zlomy DNA jsou velmi důležité pro biologický
účinek záření.
5.6.3. Měření zlomů DNA
prokázat sedimentačními technikami.SSB a DSB se dají snadno Tato jednoduchá metoda
ým prostředím, což ovšem způsobuje
není bez komplikací, neboť velká molekula DNA je velmi fragilní a zlomy lze nadělat
manipulací. To vymezuje použitelnost této technologie na větší dávky záření – takové, které
jsou při ozařování buňky mimo fyziologickou oblast.
Pro měření SSB se DNA denaturuje alkalick
vznik dodatečných zlomů, které nejsou detekovány, jestliže se denaturuje např. teplem. Tyto
dodatečné zlomy, které vznikají z některých typů poškození bazí se nazývají „alkali labile
sites“ (als), tj. místa nestálá v zásaditém prostředí. Počet těchto zlomů je asi 30% z celkového
počtu SSB. Prakticky lze měření provést v gradientu sacharózy (5-20% gradient), kde na jeho
povrch se umístí DNA značená izotopem v alkalickém prostředí. Po centrifugaci rozkapeme
gradient na frakce a změříme aktivitu v jednotlivých frakcích např. v β-spektrometru. Tím
dostaneme rozdělení aktivity podél gradientu. Kalibrací stanovíme pro danou molekulární
hmotnost DNA polohu v gradientu. Z rozdělení pak můžeme spočítat střední molekulární
hmotnost. Lze snadno prokázat, že střední molekulární hmotnost klesá s rostoucí dávkou
záření jak pro roztoky tak v buňkách.
Další metodou měření SSB a DSB je
elektroforéza. Jednoduché je použít kruhovou
DNA, která má velkou pohyblivost v elektrickém
poli. Vznikem SSB dojde k relaxaci a pohyblivost
se podstatně zmenší. Vnesení DSB do kruhové
molekuly vede ke vzniku molekuly lineární a k
další změně pohyblivosti. Tyto tři formy DNA se
dají snadno oddělit sedimentací nebo
elektroforézou (viz obr. 72).
Další metodou je „unwinding technika“,
lední metodou pro měření
která využívá řízené denaturace DNA v zásaditém
prostředí, kdy při přesně stanoveném pH a
změřené době dojde k oddělení určitého úseku
dvoušroubovice. Čím více bude zlomů v DNA,
tím rychleji dojde k úplné denaturaci všech molek
DNA použitím vhodné barvičky. Tato metoda je citlivější než sedimentační technika a
umožňuje pracovat s dávkami blízkými „fyziologickým“. Metoda vyžaduje pečlivou
kalibraci.
Pos
ul. Měří se nakonec frakce dvojřetězové
DSB, o které se zmíníme, je pulsní
elektroforéza, do které byly
vkládány velké naděje. U pulsní
elektroforézy se střídá elektrické
pole pod určitým tupým úhlem a lze
programově řídit jak velikost pole,
tak úhel a dobu pulsů napětí.
Molekuly DNA se v gelu nejprve
orientují a teprve poté se začnou
pohybovat. Při změně orientace
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
--
Směr pole se
mění
Molekula DNA se proplétá
v pórech, kde je tažená
Při reorientaci se část
nábo
silou
je nevyužije
Obr. 72. Tři formy původně kruhové DNA po
Obr. 73. Princip pulsní elektroforézy
ozáření
44
napětí dochází k re-orientaci, která zabere určitý čas, jenž je větší pro větší molekuly.
Rozhodující pro výsledek, tj. polohu molekuly na gelu, je proto rychlost reorientace a nikoliv
pohyblivost. Tímto způsobem lze oddělit šetrně velké molekuly až několik Mbp (celý genom
E. coli).
Na obr. 73 je zobrazen princip pulsní elektroforézy – měnící se elektrické pole, ve
kterém dochází opakovaně k reorientaci molekul DNA. Doba reorientace je větší pro delší
molekulu.
5.6.4. Výsledky měření zlomů DNA pulsní elektroforézou a jejich interpretace.
Byly měřeny např. zlomy indukované zářením u E. coli nebo B. subtilis na celých genomech,
kterými jsou kruhové molekuly DNA. Výsledek elektroforézy vypadal takto – určitá linie
odpovídala původní DNA (zůstala na původním místě vzhledem k ukotvení na buněčné
struktury), další maximum odpovídalo jednořetězové DNA. Třetí maximum bylo široké a
odpovídalo molekulám rozbitým na drobnější kousky.
Jednoduše lze odvodit, že při náhodném vzniku DSB v molekule DNA musí mezi
množstvím DNA v jednotlivých oblastech elektroforeogramu platit určité vztahy.
Pro řídce ionizující záření bude při středním počtu zlomů
Experimentální rozdělení
Teoretické rozdělení
vzdálenost ve směru pole
Obr. 74. Výsledek pulsní
elektroforézy ozářených
baktérií
M1
M2
M3
M3
M2
M1
n=a.D
pravděpodobnost, že k žádnému nedošlo
exp(-n)
a pravděpodobnost že došlo právě k jednomu bude
n exp(-n)
Zbytek do 1 bude připadat na spojitou část rozdělení v pravé
části obr. 74.
Množství DNA pod maximy lze určit integrací a porovnat
s rovnicemi. Pro hustě ionizující záření lze použít f(z, D) funkci a
pro dané z deponované v molekule vypočítat počet zlomů.
Velikosti maxim a tvar spojitého spektra vpravo pro hustě
ionizující záření by se měly lišit. Experimentální výsledky však
příliš neodpovídají teoretickým předpovědím, což odráží celou
řadu problému při vyhodnocování těchto experimentů.
5.6.5. Radiolýza DNA – vliv kyslíku
OER=D2/D1
=4.2/1.2=
=3.5
D1 D2
Kyslík obvykle zvětšuje účinek záření a to jak na úrovni molekulární, tak
na úrovni buněk a tkání. Mluví se o tzv. kyslíkovém efektu, který je
jedním z nejlépe prozkoumaných a nejuniversálnějších radiobiologických
fenoménů. Pro hodnocení účinku v přítomnosti kyslíku v porovnání
s anoxickými podmínkami se zavádí se poměr dávek v kyslíku a v anoxii
pro stejné poškození DNA – tzv. kyslíkový poměr (KP) anglicky oxygen
enhancement ratio (OER). Hodnota OER pro SSB při γ-ozáření byla
odhadnuta na 5.4, pro DSB 3.5 (viz obr.75).
Obr. 75. Definice kyslíkového poměru – červeně jsou znázorněny dávky pro určitý
efekt (10 zlomů). Poměr dávek je hodnota OER.
45
Jak již bylo uvedeno, kyslík může zvyšovat produkci OH•
radikálů avšak tento příspěvek je malý. Nejdůležitější je role
kyslíku při fixaci radikálů DNA. Vzhledem k vysokému
obsahu kyslíku ve vodě a vzhledem k vysoké reakční rychlosti
s těmito radikály je i velmi malá koncentrace kyslíku
dostatečná pro 100% účinek záření. Proto se musí experimenty,
v nichž se zkoumá anoxie velmi pečlivě provádět – tak, aby
byla koncentrace kyslíku skutečně nulová.
Dvojité zlomy DNA vznikají odlišným mechanismem v
roztoku a v buňkách (obr. 76). V roztoku dochází k formování
DSB jako dvou SSB s odstupem 6-8 nukleotidů. To
předpokládá dostatečně velkou produkci SSB, aby takový jev
byl dostatečně pravděpodobný a důsledkem pak je kvadratická
závislost počtu zlomů na dávce. V buňkách je vznik DSB
1000x méně pravděpodobný jednak proto, poněvadž příspěvek
nepřímého účinku záření je menší, jsou zde také přítomné látky
vychytávající radikály a konformace DNA v chromatinu je jiná.
Dávkové závislosti počtu DSB v buňkách jsou většinou lineární.
Obr. 76. Kyslíkový poměr
v roztoku. Dávkové závislosti
vzniku DSB jsou kvadratické,
neboť DSB vznikají ze dvou
SSB. Hodnota OER je zde
menší než 2.
5.6.6. Radiolýza DNA – vliv LPE
Jak vidíme z obr. 77, produkce SSB, DSB a i dalších poškození DNA se mění v závislosti na
tom, jaký druh záření použijeme. Proto není možné vysvětlit účinek záření na buňku pouze
úvahami o energii deponované v citlivém
objemu (jádře) buňky. Pro větší hodnoty LPE
záření se mění distribuce specifické energie
z v jádrech buněk a část buněk bude proto
pociťovat větší než průměrnou hodnotu z. Co
je však důležité, že s růstem LPE produkce
DSB nejprve roste a posléze klesá. Tyto závislosti
lze objasnit jestliže zvážíme charakter vydělení
energie (mikrodosimetrické aspekty a strukturu
stopy částice). Pro jednoduché zlomy není třeba
tolik energie jako pro dvojité, a proto jejich
produkce padá s růstem LPE. U dvojitých zlomů
se pravděpodobnost vydělení dostatečné energie
v rozmezí molekuly (2 nm) nejprve zvětšuje až do
několika set keV/µm. Na obr. 78 jsou znázorněny
teoretické křivky spočtené na základě teoretických
představ o vydělení energie v molekule DNA.
K jejich interpretaci se vrátíme později.
Obr.78. Teoretické křivky:
1 –produkce SSB,
2 – produkce přímých DSB
3 – produkce poškození bazí
4–produkce tzv.komplexních poškození
Obr. 77. Experimentální závislosti produkce
SSB a DSB v závislosti na LET záření
46
5.6.7. Ostatní poškození DNA
Poškození bazí a ztráta bazí se
ané oblasti
pozoruje jako úbytek absorbance
při 265nm, což je poněkud hrubá
metoda. Byly popsány určité typy
poškození bazí (např. u thyminu 30
druhů změn) (obr. 79); jejich
biologické následky však nejsou
známy a nepřičítá se jím velký
význam. Poškození bazí se v buňce
reparuje excizní reparací, čímž se
tato poškození mění na SSB. Proto
lze po určité době pozorovat nárůst
počtu SSB po ozáření.
Denaturov způsobují
aopak při malých dávkách určitý
í, a proto
n
nárůst absorbance při 265 nm.
Tyto oblasti lze prokázat na
denaturačních křivkách nebo
pomocí enzymů specifických pro
single-strandovou DNA.
Denaturace provází většinu z
uvedených typů poškozen
je hodnota G poměrné velká.
Crosslinky – nejsou dobře prokoumány.
Intramolekulární
ěnám v denaturačních křivkách a zvyšují rychlost
.6.8. Výpočet produkce zlomů DNA po ozáření
DNA,
Obr. 80 Povrchy molekuly – van der
na DNA. Modeluje se pohyb radikálů v 3D prostoru
Obr. 79. Typy poškození bazí OH• radikálem. Jsou znázorněna
místa citlivá k OH• radikálům a změny, které nastávají.
z
crossliky vedou k podstatným zm
sedimentace. Crosslinky s proteiny způsobují obtížnou extrakci z buněk – toho lze využít při
fixaci DNA.
5
Modelování DNA – existují modely struktury
které umožňují stanovit přístupná místa. Je několik
přístupů – lze určit tzv. Van der Waalsův povrch a
„dostupný povrch“ (nemusí být shodné) (obr. 80).
Waalsův a „dostupný povrch“.
Obr. 81. Modelování působení OH radikálu
(převzato z práce M. Běgusové) a jejich interakce s DNA (obr. 81).
47
5.6.8.1. Závislost pravděpodobnosti vzniku zlomu na složení DNA
Byl ozařován fragment DNA a analyzována produkce zlomů v daném místě. Analýza byla
provedena na akrylamidovém gelu podobně jako sekvenování.
Podle délky řetězce DNA bylo možné přesně stanovit, ve
kterém místě (na kterém nukleotidu) došlo ke vzniku zlomu. Na
obr. 82 vidíme experimentální a teoretickou pravd. vzniku SSB
Obr. 82. Pravděpodobnosti vzniku zlomu závisí na složení DNA– v blízkosti
TTG, TTC jsou minima. Křivka představuje teoretický výpočet. (práce M.
Běgusové)
5.6.8.2. Vznik zlomů DNA v komplexu s proteinem
K modelování byl použit komplex DNA s lac represorem
(odpovídající vazebná sekvence). Na obr. 83 je část řetězce
DNA v komplexu s lac represorem (modře), jsou zde
znázorněny atomy vodíku v polohách H4 a H5 (zelenou a
fialovou barvou). Je zřejmé, že pouze část atomů je
přístupná pro interakci s OH radikály (obr. 84)
Obr. 83. Struktura fragmentu DNA se lacI
represorem. (práce M. Běgusové)
Obr. 84. Vznik zlomů DNA v komplexu s proteinem –
vznik zlomů pro DNA s represorem. Je vidět, že model
docela dobře popisuje experimentální výsledky. (práce
M. Běgusové)
5.6.9. Poškození DNA působením UV-záření
UV záření se dělí na A, B a C. UV-A záření
způsobuje vznik SSB zlomů DNA, které – jak
uvidíme později se rychle reparují, a proto UVA
záření nezpůsobuje přímo závažná poškození
buněk. UV-B a UV-C záření způsobují vznik
dimerů a 6-4 fotoproduktů (obr. 85).
Kovalentní vazba vzniká mezi sousedními
pyrimidiny, nejčastěji jsou to thyminy.
Oba typy poškození mohou způsobovat
špatné párování při replikaci nebo zastavení
replikace. Protože na Zemi žijeme v přítomnosti
UV-záření, vyvinula se řada systémů pro
reparaci poškození způsobených tímto zářením.
Obr. 85. Vznik pyrimidinového dimeru a 6-4
fotoproduktu působením UV-záření.
48
VI. Reparace DNA po ozáření
DNA je na rozdíl od proteinů, lipidů a sacharidů unikátní molekula v buňce. Molekuly,
kterých je mnoho se mohou při poškození prostě zaměnit. Udržet DNA v originálním stavu je
pro buňku jedna z hlavních úloh. Proto existuje řada reparačních systémů DNA. DNA je
relativně stabilní sloučenina, je však vystavena mnoha poškozujícím vlivům:
1) Teplota – denaturace, deaminace bazí, ztráta bazí glykosylickou hydrolýzou
2) UV záření – vznikají pyrimidinové dimery, 6-4 fotoprodukty
3) Ionizující záření – poškození bazí, jejich fragmentace, zlomy
4) Chemické modifikace – velký počet
Reparace byla první prozkoumána u E.coli s různými mutacemi při působení UV záření. Proto
probereme první UV-poškození a související reparační procesy u baktérií.
6.1. Základní systémy reparace
6.1.1. Fotoreaktivace – prokaryotní i eukaryotní buňky
První systém reparace se nazývá fotoreaktivace.
Uskutečňuje se působením jednoho enzymu, DNAfotoliázy
(obr. 86). Tento enzym štěpí dimery.
Energie pro štěpení kovalentní vazby cyklobutanového
kruhu se čerpá pohlcením světla (370 nm)
chromofory. Vlastnosti fotoliázy E. coli: (1) phr gen,
54 kd, monomer, (2) izolován – modrá barva,
absorbuje při 380 nm, (3) obsahuje chromofory
FADH2 a pterin, (4) reparuje pyrimidinové dimery
rychlostí 25/min/molekulu, (5) stimuluje ABC
nukleázu. Vazba PL (fotoliázy) na DNA je (1) velmi
selektivní – váže se na dimery, (2) nezávislá na formě
DNA (relaxovaná supercoiled, ssDNA apod),
(3) rozpoznává cyklobutanový kruh (2 kovalentní
vazby), jiné dimery nepozná, (4) PL asociuje s 6-7
páry bazí v okolí dimeru, zapadá do menšího žlábku
DNA. Mechanismus reparace je následující:
(1) aktivuje se enzym přes pohlcení světla oběma chromofory, (2) FADH2 (flavin) je
excitován a předává elektron dimeru, čímž zruší příčnou vazbu, (3) role druhého chromoforu
je pravděpodobně zaplnění místa po odevzdaném elektronu v molekule flavinu
Obr. 86. Fotoreaktivace thyminových
dimerů
Fotoreaktivace byla nalezena u mnoha organismů včetně ryb, plazů ale nebyla
nalezena u savců. U člověka existuje gen CRY, jenž je sekvenčně podobný fotoliáze, není
však schopen fotoreaktivace (uplatnění při nastavení denních rytmů).
6.1.2. Nukleotidová excisní reparace (NER)
V 60. létech se podařilo vydělit mutanty
E.coli citlivé k UV-záření. Nyní víme, že u
těchto kmenů byla zablokována reparace
DNA nukleotidovou excisní cestou
(obr. 87). Excisní reparace dimerů se
uskutečňuje působením uvrABC systému.
Při nalezení dimeru uvrAAB proteinem
dochází k odpojení uvrA proteinu a k
připojení uvrC. Tento kompex štípne páteř
DNA v blízkosti dimeru. Část řetězce je
odstraněna uvrD proteinem – helikázou II
Obr. 87. Citlivost uvrkmenů
E. coli k UV-záření
a různým mutagenům
49
(obr. 88). UvrA protein má 2810 bp, je to ATPaza, funguje v dimeru a disponuje vazebnou
aktivitou k DNA. Poznání
substrátu souvisí s deformací
helikální struktury DNA. Dimer
odtáčí helix o 19-20 stupňů a
vytváří přehyb o velikosti 27 st.,
který zasahuje do velkého
žlábku do vzdále-nosti přibližně
0.26 nm.
Uvr B protein má 2019 bp,
neváže se k DNA samostatně,
pouze spolu s uvrA, nemá
ATPázovou aktivitu. UvrC
protein má 1764 bp, váže se k
uvrB na DNA (1 i více molekul)
a způsobuje excisi. Naštípnutí je
současné na obou místech,
nikoliv postupné. Štěpí 8-mou
fosfodiesterickou vazbu ve
směru 5‘ od poškození a 4-tou
nebo 5-tou ve směru 3‘, což
dává 12-13. mer Genu uvrC
odpovídá u člověka ERCC1
gen, u kvasinek RAD10 gen,
uvrD genu (helikáze) odpovídá ERCC2 u člověka a RAD3 u kvasinek. U člověka je excizní
reparační systém složitější – 4 geny (XPC, DDB, XPA, RPA) se mohou vázat k DNA. Genu
uvrB odpovídají dva geny XPB a XPD, které jsou oba potřebné pro vznik pre-incizního stavu.
Pro incisi jsou potřebné dva geny XPG a XPF – pro každou zvlášť – místo uvrC u E.coli.
Celý kompex disociuje s 24-32 oligonukleotidem, mezeru zaplní pol δ nebo ε a ligáza LIG1
Obr. 88. Excisní reparace dimerů se uskutečňuje působením
uvrABC systému. Komplex uvrAuvrB skenuje DNA a vyhledává
dimery. Při jejich nalezení dochází k odpojení uvrA proteinu (ATP
závislá reakce) a k připojení uvrC. Tento kompex (urvBuvrC)
štípne páteř DNA v blízkosti dimeru. Část řetězce je odstraněna
uvrD proteinem – helikázou II za dodání energie z ATP. Další
proces se uskuteční jako prostá syntéza polymerázou a ligázou.
6.1.3. Excisní reparace poškozených bazí (BER)
Dochází k odstranění poškozených bazí (nikoliv
nukleotidů), kdy se nejprve hydrolyzuje N-glykosylická
vazba mezi deoxyribozou a cukrem a pak se odstraní
báze DNA glykosylázou (obr.89). Vzniká AP místo
(apurinové nebo apyrimidinové), které se opraví
endonukleázou (štípe páteř DNA v blízkosti AP místa)
a dRpázou (deoxyribofosfodiesterazou). Vloží se
nukleotid polymerázou a páteř se spojí ligázou.
DNA glykosylázy: (1) malé molekuly 20-30 kD,
velmi specifické (např. uracil, hypoxantin, 3metyladenin,
hydroxymetyluracil apod), záření
vyvolává např. 4,6-diamino-5-FAPY (formamidopyrimidin),
který odstraňuje enzym genu fpg (30 KD).
Hydroxymethyluracil vzniká rovněž působením záření
nebo jiných oxidačních činidel
AP endonukleázy:(1) štípou fosfodiesterickou
vazbu 3‘ nebo 5‘ od AP místa (podle toho existují 4 druhy endonukleáz a štípou buď na 3‘
straně nebo 5‘ straně od AP a vzniká 3‘OH + 5‘PO4, 3‘PO4 + 5‘OH).
Obr. 89. Excizní reparace bazí (standardní
schéma).
50
(2) jsou různé druhy endonukleáz, např. endo IV – mutanti citliví k alkylujícím činidlům
(mitomycin C, bleomycin), endo V – degraduje DNA s uracilem, u člověka existují také AP
endonukleázy
6.1.4. Excisní reparace poškozených bazí u člověka (obr.90)
U člověka existují 3 odlišné glykosylázy pro oxidativní poškození a čtvrtá pro alkylované
puriny. Další 4 mohou odstranit uracil z DNA (např. UNG
glykosyláza je homologická
Ung enzymu E.coli,
asociuje se s replikační
vidlicí a odstraňuje
chybně vložený uracil
naproti adeninu). SMUG1
je unikátní pro vyšší
eukaryoty a odstraňuje
uracil vzniklý po
deaminaci cytosinu v
DNA). Byla nalezena
pouze 1 endonukleáza pro
AP místa (APE1). Delece
tohoto genu způsobuje
embryonální letalitu u
myší. Na obr. 91 je
znázorněna reparace
residua po deaminaci 5methylcytosinu–
thyminu.
Obr. 90. Excizní reparace bazí u
člověka. Nejprve se hydrolyzuje Nglykosylická
vazba mezi deoxyribozou a
cukrem a pak se odstraní báze DNA
glykosylazou. Endonukleáza štípe páteř
DNA v blízkosti AP místa. Vloží se
nukleotid polymerázou a páteř se spojí
ligázou.
Obr. 91. Reparace residua po deaminaci 5-methylcytosinu – thyminu. TDG gylkosyláza odstraní thymin a
přivolá APE1 nukleázu, ta očistí okraj a přivolá POL β, ta vsadí cytosin a přivolá LIG3-XRCC1 komplex.
6.1.5. SOS reparace
V 60-tých létech byli izolováni mutanti E. coli citliví k UV-světlu. Nejzajímavější byli
mutanti uvrA a recA, u nich u obou byla citlivost k UV podstatně větší než u buněk
standardního (divokého) kmene. Ukázalo se, že existuje dvojitý mutant uvrA recA, jehož
citlivost je ještě daleko vyšší, u kterého existuje pouze fotoreaktivace, tj.
reparace závislá na světle. Existence dvou typů mutovaných buněk se
zvýšenou citlivostí k UV záření nezávislých na sobě svědčila o existenci
dvou reparačních systémů. Skutečně bylo zjištěno, že existuje NER
reparace, kterou jsme již probrali a SOS
reparace, o které se nyní zmíníme. Oba tyto
reparační systémy jsou velmi efektivní při
reparaci UV poškození, ale i zlomů DNA po
působení ionizujícího záření.
S
uvrA recA
Wild type
uvr
rec
Dávka
Obr. 92. Přežití
fágových částic po
ozáření nositele
(baktérií)
6.1.5.1.W-reaktivace fágových částic
Při ozáření bakteriofága dochází kú jeho poškození a ztrátě funkce.
Čím je větší dávka, tím méně fágových částic přežívá (je schopno
infikovat bakterii). Jestliže však bakterie předtím ozáříme, přežije
více fágových částic – tomu se říká W-reaktivace (Weigle) (obr. 92).
Tento jev byl první, který svědčil o existenci jistého inducibilního
reparačního systému u baktérií.
51
6.1.5.2.SOS systém u E. coli
SOS systém u E. coli je
inducibilní enzymatický systém,
který je odpovědný za reparaci,
mutagenezi a další funkce.
Základ regulace spočívá na
lexA a recA proteinech.
Za normálních okolností
je v buňkách určitá bazální
úroveň těchto proteinů, kdy
lexA represor ve formě dimerů
nasedá na operátory řady genů
včetně recA a sebe sama a
blokuje syntézu těchto genů
(obr.93 nahoře). Koncensuální
sekvence pro vazbu lexA
proteinu je sekvence 5‘-CTGN10-CAG-3‘,
tzv. „SOS box“.
Vznikem poškození
DNA dochází k vazbě recA
proteinu na ssDNA a dále k
asociaci s lexA proteinem, který
se tímto štěpí (často se mluví o
, včetně recA, který pak má ještě
další funkce – nasedá na DNA a chrání jí v průběhu reparace, způsobuje rekombinaci (obr. 93
dole). Jakmile je poškození reparováno, klesne úroveň proteázy, lexA protein nasedne na
operátorová místa a zablokuje syntézu.
Obr. 93.
recA-proteáze), hydrolýza lexA odblokuje syntézu řady genů
.1.5.3. SOS (postreplikativní) reparace
v průběhu replikace – na
e dochází ke zředění a
poškoz
.1.6. Mismatch reparace
loženém nukleotidu oprava děje tzv. „mismatch repair“ s využitím
vyštěpení řetězce za pomocí helikázy (uvrD).
6
SOS systém umožňuje reparaci DNA
poškození se polymeráza zastaví, disociuje od DNA a syntéza je
inicializována ve vzdálenosti 1000 bp dál podél řetězce,
zanechávajíce mezeru s poškozenou bazí (nebo dimerem) (obr. 94).
RecA protein se váže k ssDNA a má schopnost přenést do této
mezery řetězec ze sesterského duplexu (chromatidy), který má
nepoškozený templát. Tento „crossing over“ zanechává malé gapy,
které se uzavřou polymerázou a ligázou.
Poškození se neodstraní – pouz
ení čeká na další reparaci (pokud je možná). Obr. 94. Schéma postreplikativní
reparace.
6
Po replikaci se při chybně v
genů mutHLS (obr. 95). mutH se váže na GATC sekvenci s metylovaným A – tím se pozná
starý řetězec DNA, mutS se váže na nespárované místo. MutL spojí mutH a mutS a dojde k
52
Obr. 95.
pr
Mismatch reparace. V nově syntetizovaném řetězci máme nesprávnou bázi. Starý řetězec pozná mutH
otein podle metylovaného adeninu v sekvence GATC, přitáhne mutL a mutS se váže na nespárované místo.
Řetězec se degraduje a resyntetizuje.
.2. Reparace zlomů DNA
ačních systémů
6
6.2.1. Stručný přehled repar
SSB se většinou reparují velmi rychle s využitím stejných reparačních systémů jak BER nebo
t se reparuje ligázou, část s použitím excizníNER. Existují však různé typy SSB – čás
reparace a zbývající poškození těžšího kalibru indukují SOS-reparaci.
DSB se reparují pomocí rekombinace, což u E.coli při 1 genomu na buňku není
možné. Replikace u bakterií však probíhá synchronně a doba zdvojení může být kratší než je
doba replikace – pak je na buňku více genomů (např. 6-8 kopií). Pak je možná rekombinace.
U savčích buněk se reparují DSB prostým spojením konců. To vyžaduje enzymy, které
konce rozpoznají a dotáhnou je k sobě. Reparace nevyžaduje homologii a nazývá se
nehomologní spojování konců (NHEJ- nonhomologous end-joining). Pro tuto reparaci je
důležitý protein Ku. Je to heterodimer podjednotek Ku70 a Ku80. Defekt této reparace vede
ke vzniku translokací.
Dalším typem reparace DSB u savčích buněk je homologní rekombinační reparace.
Tato reparace probíhá na sesterských chromatidách (G2 fáze cyklu) nebo s pomocí
homolo
EJ reparace)
edná se o proces, při kterém se podrží pohromadě konce vzniklého DSB, očistí se a spojí se
race nepotřebuje homologní DNA, a
ek – spojení konců
XRCC
ý
gního chromosomu – v G1 fázi to předpokládá hledání tohoto homologa v jádře, což
je málo pravděpodobné, proto se předpokládá, že v G1 probíhá pouze NHEJ. Další možnost je
u chromosomů s duplikovanou sekvencí.
6.2.2. Nehomologní spojování konců (NH
J
opět dohromady, byť se ztrátou informace. Tento typ repa
proto může probíhat i v G1 fázi buněčného cyklu. Dá se zdůvodnit tím, že genom u savčích
buněk obsahuje obrovské množství redundantní informace a ztráta této informace v oblastech
nekódující DNA nemusí být pro buňku kritickou. U diferencovaných buněk s omezenou
potřebou replikace se tak může jednat o přiměřený způsob opravy DNA.
Proteiny, které se účastní: (1)DNA ligáza IV – kooperuje s XRCC4 na spojení konců
po jejich patřičném opracováni; (2) XRCC4 - analog LIF1 genu u kvasin
5 – analog HDF2 u kvasinek – označuje se nyní jako Ku80 – spolupracuje s Ku70
nasedá na konce a spojuje je; (3) XRCC6 – analog HDF1, označuje se Ku 70, je velmi hojn
53
tvoří heterodimer s Ku80, nasedá na konce a rozplétá je
částečně; (4) XRCC7 – DNA protein kináza – aktivuje
Artemis; (5) ARTEMIS – nukleáza regulovaná PKcs,
připravuje konce pro ligázu.
Mechanismus reparace: Oba zlomy jsou podrženy
pohromadě v tzv. synapsi následujícím způsobem (obr. 96):
(1) Ku proteiny nasednou na konce zlomů a interagují mezi
sebou
e u savčích buněk
xistují dva dobře dokumentované procesy – SDSA (synthesis dependent strand annealing) a
SA (single-strand annealing). V prvním případě (obr. 97 vlevo) dochází k invazi řetězce
7. vpravo). Zlom vede k obnažení
omolo
logní DNA, tedy i v G1 fázi, kde se ovšem
livosti chromatinu).
Obr. 96. Nehomologní spojování
zlomů DNA (NHEJ) reparace
(tj. drží konce u sebe); (2) Ku přivolají protein
kinázu PKcs, která se asociuje s ARTEMIS endonukleázou
a aktivuje ji, aby očistila konce (ořezala jednořetězcové
zbytky); (3) Po očištění se konce spojí – účastní se DNA
ligáza IV a XRCC4 protein.
6.2.3.Rekombinační reparac
E
S
DNA jednoho konce zlomu do homologní
Obr. 97. Rekombinační reparace
oblasti druhé molekuly DNA a vytvořený Dloop
(odchlípení) se naváže do oblasti zlomu.
Podle tohoto úseku se potom syntetizuje úsek
DNA v místě zlomu. Podobně se ve druhé
molekule syntetizuje chybějící část řetězce.
Poté dojde k oddělení obou molekul. Tento
typ reparace probíhá teoreticky bez ztráty
informace.
Druhý proces (SSA) probíhá tam, kdy
zlom vznikl mezi dvěma homologními úseky
DNA (obr. 9
h gních sekvencí, které se na sebe navážou
a dojde ke spojení DNA, která je o úsek
mezi homologiemi kratší. Rekombinační reparace
může nastat tam, kde je k dispozici homo
těžko hledá homolog (vzhledem k malé pohyb
54
6.3. Hierarchie reparace zlomů u baktérií
6.3.1. Schéma reparace zlomů DNA
Prvotní zlomy DNA (DNA sites) se mohou zčásti
reparovat velmi rychle DNA ligázou (obr. 98). Tato poškození mohou částečně představovat a
částečně z nich vznikají (např. excizní reparací BER z poškozených bazí) jednoduché zlomy
(SSB1). Zlomy jsou převážně reparovány enzymy excizní reparace (polA polymerázou). Část
těchto zlomů se transformuje na SSB2, což jsou dlouhé mezery v DNA(gapy). K této
transformaci dochází působením recBCD nukleázy kvůli poškození konců, nebo z jiných
příčin, jestliže na zlom narazí replikační mechanismus. Tyto gapy pokud nejsou chráněny
recA proteinem, se transformují na DSB (DSB enzymatického původu) a jsou letální u kmene
E. coli recA. Proto je označujeme také jako metastabilní stavy (MS). DSB jsou letální u buněk
standardního kmene (wild type).
Obr. 98. Schéma vzniku a reparace zlomů DNA u baktérií po ozáření
V přítomnosti kyslíku se ve srovnání s anoxii podstatně liší spektrum poškození (obr. 99).
Tento rozdíl je zachycen na dalším schématu. MN a MO jsou radikály DNA, v nepřítomnosti
kyslíku se MO prostě „reparují“ na fyzikálně-chemické úrovni pomocí endogenních molekul
obsahujících SH skupinu (thiolů). Z prvotních zlomů (Nγ) se část reparuje, jak v přítomnosti
kyslíku, tak bez něho (p1) a vznikají zlomy, které jsou reparovány enzymy excizní reparace.
Část těchto zlomů je nereparovatelná excizní reparací (NSSB1ir) a vyžaduje indukci SOS
systému. SOS systém je posledním reparačním systémem, který je indukován SSB1,ir a také
části SSB1,r – pokud se nestihly reparovat rychlým typem polA-závislé reparace.
Obr. 99. Schéma reparačních procesů v anoxii a za
přítomnosti kyslíku
55
6.3.2. Model reparace zlomů u E.coli
Nyní si schéma zjednodušíme a připustíme existenci dvou (hlavních) reparačních systémů –
rychlé (excizní) reparace a pomalé (SOS reparace). Množství zlomů označíme NSSB1,ir - pro
zlomy nereparabilní rychlou (F-fast) reparací, NSSB1,r – reparabilní zlomy v anoxických
podmínkách s indexem N a za přítomnosti kyslíku s indexem O. Existence nereparabilních
zlomů je zřejmá. Hypotézou modelu je nezávislost NSSB1,ir na přítomnosti kyslíku. Takovými
poškozeními mohou být např. komplexní zlomy doprovázené poškozením báze (bazí).
Nechť redukce zlomů a pomalou je S. Pak dostaneme pro
počet zlomů zbylých po reparaci (pom parace je schopna reparovat i Nssb1,ir).
Obr. 100. Zjedno
určitého
dušené schéma reparace, S-switch a F-switch znamená přepínače, které můžeme vypínat
reparačně defektního kmene bakterií. Typy poškození jsou popsány v textu.použitím
reparovaných rychlou reparací je F
alá re
Zkusíme využít experimentálních výsledků, abychom stanovili parametry modelu
(předpokládáme, že 37% buněk hyne jestliže je v populaci v průměru 1 letální událost –
nereparovaný zlom -na buňku):
S
N
SF
N
N
irSSBrSSB
let
11
+
⋅
=
Pro kyslíkový poměr pak dostaneme:
6.3.2.1. Určení parametrů modelu
Zkusíme spočítat parametry podle naměřených údajů pro reparačně defektní buňky. OER pro
mutanty E.coli s defektem excizní reparace, tj. polA1- kmen, je největší ze všech mutantů
(pro polA1 kmen by mělo platit, že F=1):
Střední letální dávka, která odpovídá počtu nereparovaných DSB pro recA kmen je podle tohoto
modelu:
4.60.049pol A
3.40.01Wild type
1.80.062rec A
OERN letKmen
irSSBrSSB
N
irSSBrSSB
NFN
NFN
OER
11
11
/
/0
+
+
=
irSSBrSSB
N
irSSBrSSB
pol
NN
NN
OER
11
11
0
6,4
+
+
==
56
irSSB
rec
rSSBrecAlet NFNN 11
/062,0 0
, +==
Kyslíkový poměr pro recA buňky je pouze 1,8 a platí tedy:
irSSB
rec
rSSB
N
irSSB
rec
rSSB
rec
NFN
NFN
OER
11
11
/
/
8,1
0
+
+
==
Odtud plyne, že počet zlomů nereparovatelných rychlou reparací u buněk recA souvisí
jednoznačně s objemem rychlé reparace:
1
026,01
−
⋅= rec
rec
irSSB
F
F
N
Vzhledem k tomu, že recA buňky mají excizní reparaci v pořádku, je F
rec
»1. Proto bude
produkce zlomu blízká Nssb1,ir=0.026 Gy-1genom-1.
Dále pak pro buňky recA platí:
( )029,030 0
1 −⋅= SSB
rec
NF033,0/0
1
=rec
rSSB FN
Pro polA máme podobně:
( )0
120 SSB
pol
NS ⋅=
Jestliže dosadíme pro N
0
SSB1=2.2 10-12 cGy-1.D-1 = 0.66 Gy-1 genom-1 (ve shodě s mnoha
experimentálními výsledky) pak dostaneme pro
F
rec
=18.9 a S
pol
=13.2.
Pro počet letálních zlomů a OER buněk standardního (divokého) kmene platí (experimentální
hodnoty jsou dosazeny) :
irSSB
wt
rSSB
N
irSSB
wt
rSSB
wt
NFN
NFN
OER
11
11
/
/
4,3
0
+
+
==
wt
rSSB
wtwt
rSSB
wtlet
S
N
SF
N
N 11
0
, 01,0 +
⋅
==
Z těchto rovnic lze vypočítat:
Fwt=3.6 a Swt=21.2
Výsledky výpočtů jsou tedy:
13.21pol A
21.23.6wild type
118.9rec A
SFKmen
57
Je vidět, že rychlá (excizní) reparace je u recA kmene efektivnější, než u standardního kmene
při stejných podmínkách kultivace. Pomalá reparace u polA kmene je naopak méně efektivní
ve srovnání se standardním kmenem.
6.3.2.2. Parametry modelu pro kmeny E. coli defektni v uvr endonukleáze.
Pro buňky uvrA, tj defektní v nukleotidové excizní reparaci budou přispívat k letálnímu
efektu pyrimidinové dimery vzniknuvší po ozáření. Jejich příspěvek při ozáření γ-zářením je
0.042 Gy-1genom-1. PD mají vlastnosti velmi podobné Nssb1,ir, protože jsou nezávislé na
kyslíku. Reparovat se budou pomalou reparací, při které však bude jejich počet zřeďován, ale
nebudou odstraněny. Bude platit:
( )
( )uvrwt
PDirSSB
wt
rSSB
N
uvrwt
PDirSSB
wt
rSSB
wt
QSNNFN
QSNNFN
OER
//
//
11
11
0
⋅++
⋅++
=uvr
PD
wt
irSSB
wtrec
rSSB
uvrlet
Q
N
S
N
SF
N
N ++= ,1
0
,
1
Z hodnoty OER=2 dostaneme Swt/Quvr=2.1 – tedy reparace PD je zhruba 2x méně efektivní
než u ostatních zlomů na vstupu pomalé, tj. SOS reparace. Počet Nlet,uvr pak vychází 0.014,
což je ve shodě s experimentem.
Podobně pro dvojitý mutant recAuvrA máme:
PDirSSB
recN
PDirSSB
recO
ur
NNFN
NNFN
OER
rSSB
rSSB
++
++
=
11
11
/
/
PDirSSBrec
rSSB
urlet NN
F
N
N ++= 1
1
0
,
Tyto hodnoty můžeme spočítat: Nlet,ur=0.1 Gy-1genom-1, OER
ur
=1.35, což je ve shodě s
experimentem.
6.3.2.3. Parametry modelu v závislosti na podmínkách kultivace.
Podobně lze na základě modelu analyzovat i jiné kmeny E. coli. Je však třeba mít na paměti,
že model je jednoduchý a odráží pouze určité aspekty reparace. Zajímavé je porovnat
citlivost a kyslíkový efekt buněk standardního kmene pěstovaných v různých podmínkách
(různě bohatá půda). Pro tyto různé podmínky se bude lišit poměr příspěvků obou hlavních
reparačních systémů (vzhledem k tomu, že SOS reparace je závislá na energii a tedy
podmínkách růstu). Předpokládejme, že hodnoty F a S pro oba reparační systémy jsou ve
vztahu:
(F-1).(S-1)b=K.
Toto je empirická formule, která má tu vlastnost, že pro větší rychlost SOS reparace se
zmenšuje objem polA-závislé reparace a naopak. Pokud se F nebo S blíží 1, objem opačné
reparace se rychlé zvětšuje. Koeficienty b a K lze určit z experimentu a činí: b=0.7 K=21.5.
Čím méně vydatné bude médium, tím větší bude citlivost buněk (více nereparovaných zlomů)
a tím bude menší kyslíkový poměr.
58
VII Cytogenetická úroveň účinku záření na buňku
7.1. Příprava a pozorování preparátů
7.1.1.Fixace a barvení buněk
Buňky se oddělí od média pomocí centrifugy (obr.101), fixují se na mikroskopické sklíčko
obvykle použitím metanolu a kyseliny octové (obr. 102), barví se různým způsobem (viz dále)
a prohlížejí se pod mikroskopem (obr. 103).
Obr. 102.
Mikroskopické sklíčko
Obr. 103. Mikroskop
Obr. 101. Centrifuga
7.1.2. Klasické barvení mitotických chromosomů
Mitotické chromosomy lze snadno obarvit např. Giemsou (obr. 104). Výsledkem jsou tmavé
(G-pruhy) a světlé pruhy (R-pruhy), které jsou charakteristické pro daný chromosom (lze jej
odlišit, poznat). Světlejší pruhy odpovídají euchromatinu tmavé heterochromatinu.
Chromosomy se dělí podle velikosti, podle polohy centromery a podle pruhů. Karyotyp
člověka sestává ze 46 chromosomů (viz obr. 105).
Chromosom 11
Obr. 105. Světlejší pruhy odpovídají
euchromatinu tmavé heterochromatinu.
Chromosomy se dělí podle velikosti, podle
polohy centromery a podle pruhů.
Obr. 104. Mitotický chromosom 11 s G- a Rpruhy.
R-pruhy jsou světlejší a odpovídají
euchromatinu na interfázních chromosomech.
59
7.1.3. Barvení chromosomů FISH technikou
V 80-tých létech 20. století byla zavedena tzv. FISH technika neboli technika fluorescenční in
situ hybridizace (obr.106). Je založena na schopnosti DNA rozdělit se na dva komplementární
řetězce a opět se spojit, přičemž pro toto spojení je potřebný vysoký stupeň homologie (stejný
kód obou spojovaných řetězců). Pro obarvení části DNA lze použít značenou sondu (fragment
CChhrroommoossoommoovváá DDNNAA Obr. 106. Princip FISH techniky
TT
GG
AA
CC
T
A
AA
CC
TT
GG
A
T
AA
CC
TT
GG
A
T
TT
GG
AA
CC
T
A
DDeennaattuurraaccee
DDNNAA pprroobbaa ((ssoonnddaa))
AA
CC
TT
GG
A
T
TT
GG
AA
CC
T
A
AA
CC
TT
GG
A
T
HHyybbrriiddiizzaaccee
DNA konjugovaný s fluorochromem – na obrázku červeně), který necháme nasednout na
genomovou DNA předem připravenou tak, aby řetězce byly odděleny od sebe. Sonda si najde
své komplementární místo a nasedne na něj. Tak přinese fluorochrom právě do místa, které
nás zajímá. Přítomnost fluorochromu se pak zkoumá ve fluorescenčním mikroskopu.
7.1.3.1. Denaturace DNA, druhy sond, hybridizace
Denaturace se provádí obvykle jak u chromosomové DNA na preparátu, tak u sondy, která se
použije pro hybridizaci. K oddělení řetězců dochází při zvýšené teplotě obvykle ještě
v přítomnosti formamidu (obr. 107). Různé typy DNA sond jsou uvedeny na obr. 108.
Obr. 108. a)Sondy specifické pro určité geny (sekvence)
b)Sondy pro repretitivní sekvence v okolí centromer
c)Sondy specifické pro telomery
d)"Paintingové" sondy pro celé chromosomy
Obr. 107. Denaturace a renaturace
DNA
60
77..11..33..22.. PPoozzoorroovváánníí ssiiggnnáálluu ppoodd mmiikkrroosskkooppeemm
Mikroskopování je v dnešní době velmi
náročnou technologií. Velmi rozšířenou je
fluorescenční mikroskopie, která má velmi
výhodný poměr signál/šum. Princip
fluorescenční mikroskopie je znázorněn na
obr. 109. Fluorochrom je excitován určitou
vlnovou délkou a emituje světlo o jiné vlnové
délce. Proto lze světlo zdroje zablokovat
bariérovým filtrem. V nepřítomnosti signálu je
tak pozadí zcela tmavé. Často se využívá
několika fluorochromů, jež umožňují obarvit
více struktur. Pozorování pak může být
sekvenční, kdy postupně přepínáme jednotlivé
filtry, nebo můžeme pozorovat více barev
najednou použitím dvoj- nebo trojcestného
filtru (excitačního i bariérového). Obraz
většinou snímáme použitím kamery vybavené chlazením. Takto se může obraz snímat delší
dobu (do 30s).
Obr. 109. Princip fluorescenčního mikroskopu. Je
zobrazena cesta světla a jednotlivé filtry.
7.2. Chromosomy
Genom je v eukaryotických buňkách rozdělen na několik částí, které se nacházejí v tzv.
chromosomech. Chromosom se liší stupněm kondenzace mezi interfází a mitózou, kdy jsou
kondenzovanější a tvoří útvary podobající se písmenku X. V mitóze jsou chromosomy dobře
viditelné i v klasickém mikroskopu, ale zejména po obarvení (viz předchozí kapitola).
Chromosom obsahuje nejen určitý úsek DNA, ale také proteiny a RNA. Struktura
chromosomů a její funkční aspekty jsou v současnosti předmětem intenzívního výzkumu.
7.2.1.Významné sekvence na chromosomech
Na chromosomech rozlišujeme několik
významných míst – jsou to centromery,
telomery a počátky replikace (obr. 110).
Centromery jsou identifikovatelné jako
místa konstrikce, v nichž jsou chromatidy
spojeny k sobě, jsou odpovědné za segregaci
chromosomových teritorií (CT), jsou
fixovány na určité místo v CT a mají určitou
sekvenci. Tyto sekvence mohou být stejné
nebo podobné pro více CT.
Telomery. Při replikaci nastává
problém na konci lineárních molekul DNA,
který se řeší speciálními sekvencemi
(tandem GGGTTA – až 10 kbp), kde se váže enzym telomeráza, tj. enzym, který funguje v
komplexu s krátkým úsekem RNA, podle kterého syntetizuje (jako reverzní transkriptáza)
malé úseky DNA na koncích chromosomů. Těmto koncům chromosomů se říká telomery.
Obr. 110. Centromery, telomery a počátky replikace.
Počátky replikace obsahují specifické sekvence pro iniciaci replikace a je jich velký
počet, takže doba replikace celého genomu trvá řádově několik hodin.
61
7.2.2.Chromosomová teritoria (CT)
Již počátkem 20. století se někteří badatelé
(Boveri, Rabl) domnívali, že chromosomy
v interfázi si zachovávají svou identitu
podobně jako v mitóze. První experimenty,
které však vedly k závěru, že chromosomy se
nacházejí v jádře v podobě ohraničených
domén, byly až pokusy T. Cremera v létech
1982-1984. Zavedení FISH podstatně
urychlilo poznání chromosomů jak v mitóze,
tak v interfázi. Na obr. 111 vidíme
chromosomy 1-6 obarvené různými barvami
v tzv. multicolor FISH. Zřetelně je vidět
oddělené prostorové útvary (teritoria).
Chromosomová teritoria se nepromíchávají
jak se původně myslelo. Velké chromosomy se nacházejí spíše na okraji jádra.
Obr. 111. Chromosomová teritoria obarvená
multicolor FISH. Chromosom 1 je červený, 2 je
zelený, 3 je modrý.
7.2.3. Pohyblivost chromatinu
Dlouhou dobu nebylo jasné, zda se chromatin
v jádře pohybuje a jak rychle. První náznaky toho,
že je chromatin v jádře poměrně stabilní byla
pozorování dceřiných buněk pomocí FISH, kdy
těsně po rozdělení měly tyto buňky přibližně
stejnou nebo podobnou strukturu. Obarvení
chromatinu in vivo pomocí GFP proteinu vyřešilo
otázku pohyblivosti chromatinu. Bylo vcelku
jednoznačně stanoveno, že pohyblivost
genetických lokusů i celých chromosomových
teritorií je malá. Při vizualizaci jednotlivých genů
dospěla Bickmorová k závěru, že se tyto geny
pohybují difúzním pohybem, ale jejich difúze je
omezená poloměrem
zhruba 0.5 µm.
Velikost difúzního
koeficientu se lišila podle polohy genů – u membrány nebo
v blízkosti jadérka byla pohyblivost nejmenší. T. Cremer
zkoumal pohyblivost teritorií obarvených tzv. „scratch
technikou“, kdy se buňky mechanicky poškodí a do média se
přidají prekursory syntézy DNA konjugované s Cy3 (obr. 112).
Jádra buněk byla vizualizována pomocí konstruktu s expresí
H2b-GFP. Pohyblivost CT byla jen malá.
Obr. 112. Pohyblivost chromosomových
teritorií byla zkoumána T. Cremerem
pomocí „scratch techniky“ a H2b-GFP
Obr. 113. H2B+GFP a
nascentní mRNA (BrUTP) +
Cy3 ukazuje, že mRNA se
nachází mezi chromatinem
vizualizovaným pomoci GFP.
7.2.4. Vnitřní struktura chromosomových teritorií
První model interfázního jádra navržený Cremerem spočíval
v představě, že syntéza mRNA probíhá na povrchu
chromosomových teritorií (CT) zatímco uvnitř jsou uschovány
sekvence, které transkripci nepotřebují (utlumené geny a
nekódující sekvence). Tato představa byla vyvrácena
v experimentech Verschure, která ukázala, že i uvnitř CT dochází
k transkripci (obr. 113).
62
7.3. Chromosomální aberace
7.3.1. Numerické aberace
Genom obsahuje 46 chromosomů, 22 párů autosomů a 1 pár pohlavních chromosomů buď
XX nebo XY. Euploidní sada chromosomů jich má 23.
Polyploidie je pojem, který se vztahuje k násobku euploidního počtu. U člověka je diploidní
sada 46 chromosomů, triploidní 69 atd. Polyploidie vzniká v důsledku poruch meiozy apod.
Vede ke smrti jedince.
Aneuploidie je jakýkoliv počet chromosomů, který není násobkem euploidní sady.
Monosomie – je přítomný pouze 1 chromosom z dvojice. Člověk s monosomií by měl 45
chromosomů.
Trisomie – jsou přítomny 3 chromosomy určitého typu, u člověka – 47 chromosomů. Všechny
autosomální monosomie a trisomie s výjimkou trisomie 13, 18 a 21 vedou ke spontánním
potratům. Uvedené trisomie mají za následek těžké poškození organismu (deformity končetin,
nervového systému, srdce a mentální retardaci). Trisomie 13 a 18 vede ke smrti brzo po
narození. Trisomie 21 je jediná autosomální trisomie, při níž se člověk dožívá dospělého
věku. Pravděpodobnost trisomie silně závisí na věku matky – pro 20-letou je četnost 0.05%,
pro více než 40-letou je to 3%.
Aneuploidie pohlavních chromosomů jsou četnější, monosomie X je slučitelná s životem.
Monosomie X – Turnerův syndrom – malý vzrůst, záhyby kůže na krku, nedostatečný
sexuální vývoj, vyvíjí se recesivní onemocnění vázaná na X chromosom, neboť chybí druhá
kopie X chromosomu, která by maskovala účinek chybných alel přítomných v genech.
XXY – Klinefelterův syndrom – muži s nedostatečným sexuálním vývojem, sníženým
intelektem. Počet X chromosomů může být i větší – nemoc je pak výraznější.
XYY syndrom – tento karyotyp byl objeven u vězňů. Výskyt je asi 0.1% v normální populací,
ale u vězňů je to 4.5 %. U tohoto onemocnění pozorujeme sklon k násilí, nižší intelekt.
XXX syndrom – klinicky normální, vyšší četnost mentálních retardací a sterility. Více X
chromosomů – výraznější manifestace onemocnění.
7.3.2. Strukturální aberace
Jsou důsledkem zlomu a následného špatného spojení
chromosomů nebo ztráty fragmentu (části
chromosomu). Aberace může nastat spontánně při
replikaci a může být indukovaná chemicky, ionizujícím
zářením a UV zářením. Důsledky vzniku aberace závisí
na tom, jak je rozsáhlá, kde na chromosomu a kde ve
tkání vznikne.
Inverse – rotace zlomeného chromosomového
fragmentu a spojení v obrácené poloze
Duplikace – chromosomální segment je opakován
Translokace – transfer části chromosomu na
nehomologní jiný chromosom.
Reciproká translokace – bez ztráty
genetického materiálu (může a nemusí mít
fenotypický projev), může se přenášet z
generace na generaci. V meioze může dojít k
duplikacím nebo delecím, což vede ke
spontánním potratům.
Robertsonová translokace – zlom krátkých
ramínek dvou chromosomů s následným
Obr. 114. Delece, duplikace a inverse
Obr. 114. Vznik translokace mezi chromosomy 4
a 20
63
spojením velkých ramínek a ztrátou fragmentů malých. U chromosomů 14 a 21 - Downův
syndrom
Delece – segment chromosomu je ztracen. Pouze malé delece jsou tolerovány (Cri-du-chat
syndrom – delece malé části chromosomu 5)
Obr. 115. Různé typy chromosomálních aberací (terminální delece, intersticiální delece, Robertsonová
translokace, paracentrická inverse, reciproká translokace, pericentrická inverse, inserce, kruhový
chromosom a isochromosom).
7.4. Vznik aberací po ozáření
7.4.1. Detekce aberací (standardní experiment)
Standardní experiment sestává z následujících kroků:
1) izolace lymfocytů (odběr od donora, centrifugace a
separace na ficolu, příprava na ozařování
2) resuspendování buněk do média, stimulace k
dělení, kultivace 48-72 h, zastavení cyklu
colcemidem, hypotonický roztok, fixace kyselinou
octovou a metanolem, kapání na vymražené sklíčko,
BUdR – lze odlišit první mitózu (světlá a tmavá část
chromatidy)
3) barvení (Giemsa nebo FISH) pozorování pod
mikroskopem, vyhledání mitóz a jejich
vyhodnocení.
Na obr. 116 vidíme typickou aberaci indukova
zář ntr
nou
ik (chromosome se dvěma centromerami).
Obr. 116. Na obrázku je příklad aberace
ypické pro ozáření – dicentrik se dvěma párt y
fragmentů
ením – dicentrický chromosom neboli dice
64
7.4.2. Mechanismy vzniku výměn
Záření indukuje všechny možné typy aberací; nejčastěji sledované a také nejvýznamnější jsou
ro mechanismy A a C dostáváme kvadratické us B
lost. Dávkové závislosti se proto dají nejlépe popsat lineárněonenta
mizí postupně pro záření s vyšším LET.
7.4.4. Kinetika vzniku a lních aberací v krvi
berace vznikají velmi krátce po ozáření, což lze prokázat tzv. PCC technikou. Tato technika
jí.
výměnné aberace. Dicentriky
jsou nejčastěji sledované
klasickou technikou a
translokace jsou snadno
detekovatelné FISH
technikou (obr. 117). Tyto
aberace mohou zřejmě
vzniknout (A) nehomologním
spojením konců DSB při
NHEJ reparaci (takto mohou
vzniknout i složitější
výměny – viz obr. 117 A
vpravo), ale také při chybné
rekombinační reparaci (B) a
nebo může ze dvou
poškození (nemusí to být
DSB) vzniknout
rekombinační reparací
výměnná aberace (C).
7.4.3.Dávkové závislos
Obr.117. Mechanismy vzniku výměnných aberací u savčích buněk.
NHEJ reparací (A), rekombinační reparací (B) a reciprokou výměnou ze
dvou poškození (C)
ti.
P závislosti na dávce, pro mechanism
dostaneme lineární závis
kvadratickou funkcí
X = aD+bD2
kde kvadratická komp
Obr.118. Lineárně-kvadratická dávková závislost frekvence aberací na buňku. Vpravo je opět schématicky
znázorněn mechanismus vysvětlující lineární kvadratickou komponentu.a
časové závislosti poklesu počtu chromosomá
A
spočívá ve fúzi mitotické buňky s G1-buňkou, v níž chromosomy předčasně zkondenzu
Aberace v lymfocytech v krvi s časem mizí. Pokles počtu dicentriků je daleko rychlejší než
65
pokles počtu translokací. Časové závislosti počtu dicentriků (D) a translokací (GT) v krvi jsou
uvedeny na obr. 119.
.4.5. Komplexní přestavby.
elmi komplexní přestavby
.4.6. Intrachromosomální aberace.
dování uvnitř chromosomů (dříve to nebylo možné).
lutoniem mají v krvi aberace v
lymfoc
7
Po ozáření často vznikají v
chromosomů. Dříve je nebylo možné pozorovat, nyní se
dají zachytit pomocí FISH techniky. Tyto změny nejsou
slučitelné s dalším životem buňky.
7
Multicolor FISH se dá použít pro ban
Bylo zjištěno, že radiace zanechává dlouhodobě změny v podobě stabilních
intrachromosomálních aberací (mechanismy viz obr. 121).
Pracovníci ozáření před mnoha lety při práci s p
ytech – více než polovina lymfocytů nese přestavby (>6 Mb). Počty těchto přestaveb
korelují s dávkou na kostní dřeň. Tyto aberace lze registrovat po dlouhé době, mají nízké
pozadí a metoda má velkou citlivost pro hustě ionizující záření.
Obr. 119. Pokles počtu dicentriků je poměrně
Obr. 121. Kromě typických translokací (a)
může po ozáření docházet také k celé řadě
vnitrochromosomových změn:
- pericentromerické inverse (b),
- paracentromerické inverse (c)
- intersticiální delece (d)
Obr. 120. Komplexní přestavba chromosomů. Šipkami jsou
ukázány změny
rychlý, což ztěžuje jejich detekci po delší době
po ozáření. Tím je ztížena tzv. biologická
dosimetrie, která využívá počítání dicentriků ke
stanovení dávky v případech, kdy dojde
k ozáření člověka nečekaně takže dávka není
dokumentována dosimetrem. Pokles počtu
translokací je menší a lze je detekovat i
dlouhou dobu (roky) po ozáření. Určitou
nevýhodou je zde možnost vzniku klonů
dělením lymfocytů jež nesou danou aberaci.
Tyto klony je třeba z analýzy vyloučit.
66
Na obr.122 je použito 6 fluorochromů (DAPI, FITC, Gold, Texas Red, Cy5 a Aqua). Složený
obraz se dále analyzuje tak, aby jednotlivé oblasti byly lépe rozlišitelné (přiřazují se
pseudobarvy).
7.4.7. Multicolor FISH detekuje intra- i interchromosomální přestavby
Obr. 122. Multicolor FISH pro zobrazení změn uvnitř chromosomů. Je zde použito 6 fluorochromů
(zleva doprava): DAPI, FITC, Gold, Texas Red, Cy5 a Aqua. Superpozice těchto fluorochromů je
zobrazena na předposledním obrázku a poslední obrázek ukazuje přiřazení pseudobarev.
V krvi pracovníků s plutoniem (závod Maják v dřívějším SSSR) byly detekovány komplexní
přestavby spočívající v inter- a současně intrachromosomálních výměnách. U řady těchto
pracovníků došlo ke vzniku nádorů na plících nebo kostí. Pro porovnání byla sledována také
skupina pracovníků „na reaktoru“, u kterých bylo zjištěno značné ozáření γ-zářením.
Pracovníci s Pu (hustě ionizující záření) nesou v krvi intra-chromosomové přestavby,
zatímco pracovníci na reaktoru (ozáření γ-zářením) nesou interchromosomové přestavby.
Vidíme, že v kontrole prakticky nejsou detekovány intra- chromosomové přestavby.
Obr. 123. Intra- a interchromosomální
přestavby
v krvi pracovníků
s plutoniem (nahoře) a
pracovníků s γ-zářením
(dole). Úplně dole je
kontrola
7.4.8.Biologická dosimetrie
Cytogenetická analýza lymfocytů je od počátku 70. let používána pro účely biologické
dosimetrie. Je standardizována – existují kalibrační křivky počtu dicentriků na dávce pro
různé doby od ozáření. Předpokládá se souvislost s nádory. Kromě záření jsou však aberace
indukovány širokým spektrem jiných klastogenů.
FISH technika očividně rozšířila možnosti detekce různých druhů aberací, jednak o
stabilní aberace, což umožňuje biologickou dosimetrii i po dlouhé době po ozáření a jednak o
intrachromosomové aberace, které jsou typické pro hustě ionizující záření.
Problémy – závislost pozadí na věku, individuální citlivost k ozáření, vznik klonů, které je
nutno detekovat a vyloučit.
67
VIII. Vznik bodových mutací po ozáření
8.1.Přímé a zpětné mutace u baktérií
8.1.1. Úvod
U přímých mutací dochází ke ztrátě funkčního proteinu
v důsledku změny genetického kódu. Tyto mutace lze
detekovat na vhodných půdách (obr. 124), např. mutace
lac+ → lac- lze detekovat na půdě s tetrazoliem, mutace
v lacI genu (což je represor lac systému) lze detekovat
na půdě s X-galem, což je substrát pro β-galaktosidázu.
Defekt v lacI genu vede ke vzniku konstitutivní mutace
a syntéze galaktosidázy i bez přítomnosti laktózy. X-gal
způsobuje modré zbarvení mutovaných buněk. Tato
metoda je vhodná pro detekci malého počtu mutací,
neboť modré kolonie jsou vidět na pozadí velkého
počtu bílých kolonií. Při pozorování pod mikroskopem
lze detekovat několik mutovaných kolonií na 105
normálních (bílých) kolonií.
U zpětných mutací se používají půdy, na kterých
původní buňky nerostou (např. pro bakterie
s defektem v syntéze histidinu se použije minimální půda bez histidinu. Protože pro fixaci
mutací je potřeba, aby se buňky alespoň několikrát podělily, přidává se nepatrné množství
aminokyseliny.
Obr. 124. Mutace lze na vhodných
půdách barevně odlišit.
8.1.2. Detekce mutací po ozáření.
Buňky po ozáření mohou přežívat nebo hynout, mohou nebo nemusí nést mutace. My umíme
detekovat přežívající buňky (tj. měřit frakci přežívajících buněk) a detekovat mutace v těchto
buňkách. Obvykle se stanovuje přežití
S(D) = N(D)/No
a současně počet mutantů v závislosti na dávce
M(D) = Nm(D)/No
Normováním pak dostaneme četnost mutací na přežívající buňku
Nm(D)/N(D) = M(D)/S(D)
V případě zpětných mutací (reversí) musíme od hodnoty M(D) odečíst pozadí (Mo), které
může být dosti velké. U přímých mutací je pozadí většinou zanedbatelné.
8.1.3. Tvar křivek Nm/N (D) pro přímé mutace v lacZ genu
Přežití je u bakterií velmi často dáno exponenciální křivkou přežití:
S(D) = exp(-w.D)
Jestliže bude frekvence indukovaných mutací proporcionální velikosti absorbované dávky
(mutace vznikají proporcionálně počtu poškození), pak:
Pm(D) = a.D
Frakce vzniklých mutací pak bude:
Nm(D)/No = aD.exp(-wD)
68
Pokud pro vznik mutace musí dojít k interakci dvou poškození, bude závislost Pm(D)
de tato závislost lineárně-kvadratická.
Nm(D)/No = (aD
kvadratická. V obecnějším případě bu
+bD2).exp(-wD)
odívejme se, jak vypadají experimentální závislosti. Na
.1.4. Vznik zpětných mutací po ozáření
ě, kde původní kmen
na misku v
ávislo
ekvenci GGG
něk TA 102 a to proto, že
ěřeny po přidání malého množství
histidin
P
obr. 125 je křivka přežití (stupnice vpravo), která se
velmi podobá exponenciální závislosti a závislost
frekvence indukovaných mutací na dávce (stupnice
vlevo) odpovídající spíše kvadratické funkci.
Kvadratickou závislost lze interpretovat tak, že pro
vznik mutace jsou potřebná dvě poškození.
Předpokládejme, že při reparaci nebo replikaci dojde ke
vzniku jednořetězové DNA s poškozením.
Pravděpodobnost takové události bude zřejmě úměrná
dávce. Přes poškozenou matrici neprojde normální
replikační nebo reparační mechanismus a je nutná
indukce SOS systému spojeného s indukcí umuC a
umuD proteinů, které společně s polC tvoří kompex
umožňující syntézu na poškozené matrici (viz dále).
8
Zpětné mutace lze detekovat snadno na půd
neroste. Abychom mohli spočítat frekvenci indukovaných mutací
(tj. normovat počty mutací na přežívající buňku), musíme přesně
změřit křivku přežití. Na obr. 126 vidíme křivku přežití pro buňky
Salmonella typhimurium s defektem v syntéze histidinu (jedná se
o systém tzv. Amesových kmenů, kde je známá molekulární
údálost, která vede k reverzi). Vidíme, že v rozsahu 7 řádů je
křivka přežití blízká exponenciální funkci.
Počty reverzí
z sti na dávce sledují křivku
s maximem. Na obrázku 127
vidíme, že počty revertantů závisí
na typu molekulární události,
která vede k reverzi:
TA 98 – frameshift
TA 100 – mutace v s
TA 102 – mutace v sekvenci TAA
Nejvíce mutací zřejmě vzniká u bu
oxidační činidla, ke kterým ionizující záření patří způsobují
častěji poškození TAA.
Křivky byly nam
u na misky (křížky) nebo na miskách bez histidinu
(kolečka). Vidíme typické křivky s maximem dobře
popsatelné dříve uvedenými rovnicemi. Počty indukovaných
reverzí jsou nejmenší u TA98 a největší u TA102.
Obr.125. Kvadratická závislost četnosti
vzniku přímých lac mutací u E.coli (γ-
záření)
Obr. 127. Závislosti počtu
mutací na dávce záření pro
reverze indukované u buněk
Salmonella typhimurium
Obr. 126. Křivka přežití pro
buňky Salmonella
69
8.2. Mechanismy vzniku mutací u baktérií
8.2.1. SOS systém zahrnuje geny
vém
zení DNA ionizujícím zářením UmuD vytváří dimer a
.2.2. Vznik mutací u reparačně defektních kmenů bakterií
u bakterií defektních v určitých
mutátory - umuC a umuD.
Tyto geny mají ve s
promotoru sekvenci potřebnou
pro vazbu lexA represoru a
indukují se proto společně
s dalšími geny SOS systému (viz.
obr. 127a). Produkty těchto genů
se vážou s polymerázou pol III,
čímž vzniká komplex, jenž
umožňuje projít replikační vidlici
přes poškození. Proto je SOS
indukovaná reparace mutagenní.
Na obrázku je znázorněno
poškození DNA UV zářením, ale
stejně funguje SOS indukce a
indukce genů umuC a D i při poško
váže se k jedné molekule umuC. Tento komplex se pak váže s polymerázou III.
Obr. 127a. Indukce genů umuC a umuD při poškození DNA
8
Bude zajímavé zjistit, jaká je radiačně indukovaná reparace
typech reparace. U polAkmene
se SSB nereparují
rychlým typem reparace a velký počet těchto zlomů musí
zvládat pomalá, inducibilní SOS reparace, která je
mutagenní. Proto je tento kmen daleko citlivější ve
srovnání s buňkami standardního kmene (obr. 128).
Mutageneze je
daleko vyšší než u
„wild type“ buněk.
To lze zřejmě
vysvětlit zvýšenou
pravděpodobností
indukce mutagenní
SOS reparace.
LexAObr.
128. PolA defektní kmen
E.coli v porovnání s buňkami „wild
type“.
buňky mají defekt v indukci SOS
systém Mutageneze je zde podstatně zeslabená.
Citlivo něk vůči záření je větší (chybí pomalý typ
reparac
u.
st bu
e). Frekvence indukovaných mutací pro 100 Gy
dosahuje 6.10-4 na přežívající buňku, což je 50x méně
než pro stejné dávky záření u polA kmene (3.10
-3
). Z obrázku je vidět, že i při malých počtech
mutovaných buněk lze přímé mutace snadno detekovat.
Obr. 129. LexA defektní kmen E.coli
v porovnání s buňkami „wild type“.
70
71
.2.3. Role RecBCD nuleázy při vzniku mutací
káza a nukleáza. RecBCD degraduje DNA
homologní DNA.
.2.4.RecBCD nukleáza při reparaci poškození DNA.
ujme kruhovou DNA s řadou χ-
8
Dalším zajímavým enzymem je RecBCD heli
počínaje DSB až po tzv. χ-sekvenci. Zde se překlopí na druhý řetězec a první se začne
obalovat recA
proteinem. Ten
působí jako proteáza
na lexA protein a
spouští se SOS
systém. Proto je role
recBCD dvojí –
jednak eliminuje
poškození degradací
té části řetězce, kde
se nacházejí a
zablokují tak
replikaci a jednak
spouští SOS systém.
RecBCD nukleáza
indukuje také rekombinaci.
Řetězec
obalen recA proteinem
se váže na
Obr. 130. Mechanismus působení
RecBCD nukleázy po vzniku DSB
Obr. 131. Mechanismus působení
RecBCD nukleázy po vzniku DSB
včetně rekombinace.
8
Uvaž
sekvencí na obou řetězcích (obr. 132 a).
Nechť nyní dojde k poškození DNA (obr.
132 b). Jestliže replikační reparace narazí
na poškození DNA, dojde k jejímu
rozpadu. Je-li poškození pouze na jednom
řetězci DNA, druhý řetězec se může spojit
a zůstane nám volný konec DNA
s poškozením na konci. RecBCD
degraduje poškozenou DNA až do χsekvence,
kde vznikne recA obalené
vlákno, které se přichytí na již
replikovanou část DNA a replikace se
obnoví. Takto se buňka efektivně zbavila
poškození a replikace může pokračovat.
Obr. 132. Účast RecBCD nukleázy
při reparaci DNA
8.2. ření a mutageneze
indu ře
Jak jsme viděli, RecBCD nukleáza
průběhu replikace. Poškození vedou pouze ke
hlým typem reparace.
.3. Detekce bodových mutací u savčích buněk
ace. Jsou to např.
utace v genu HPRT (hypoxantin guanin fosforibosyltransferaza),
ří ěk
te
ukleosidu trifluorothymidin (TFT). Buňky bez mutace nevytvářejí kolonie na půdě
5. Citlivost recBC mutantů k ozá
kovaná v těchto buňkách zá ním.
se účastní reparace
poškození DNA u baktérií, přičemž tato reparace
probíhá v
zpomalení replikace. Bez RecBCD nukleázy se část
těchto poškození může reparovat SOS inducibilní
reparací, která bude při ozáření indukována i bez
RecBCD enzymu, a část jich způsobí letální události
jako obecně každý zlom reparovaný SOS reparací.
Citlivost recBCkmene
je podstatně vyšší než u buněk
standardního kmene, ale menší ve srovnání s lexA nebo
recA kmenem (obr. 133, vlevo). Mutageneze je u
recBCbuněk
podstatně vyšší (o 2 řády) než u lexA
kmene a je srovnatelná s buňkami polA-, u nichž však
byla pozorována kvadratická závislost na dávce. Lineární
dávková závislost je zřejmě dána tím, že se většinou
jedná o poškození jednoho řetězce DNA nereparovatelná ryc
Obr.133. Přežití a mutageneze u
buněk recBC-
8
U savčích buněk lze rovněž detekovat bodové mut
m
který odpovídá za rezistenci k 6-thioguaninu. Mutované kolonie
rostou na půdě s 6-thioguaninem, zatímco původní buňky nerostou.
Dávková závislost frekvence indukovaných mutací je na obr. 134,
ze kterého je vidět určitou nelinearitu v oblasti malých dávek záření
(pod 1 Gy). Tato nelinearita mizí pro větší hustoty ionizace a již
pro hodnoty LPE kolem 20 keV/µm je dávková závislost lineární.
Mutace v HPRT genu byly podrobeny zverubné analýze, při které
bylo zjištěno, že většina jich představuje delece (45% buněk má
deletovaný jeden exon, 30% nese totální deleci celého genu).
Podobně působením α-záření dochází rovněž většinou k delecím.
U buněk xrs-5 s defektem Ku proteinu je spektrum indukovaných
mutací trochu jiné (43% buněk nese deletovaný exon ale jen 14%
má totální deleci).
V současné době se často používá další test – detekce p
lymfomu (Mouse Lymphoma Forward Mutation Assay). U tohoto
analog n
Obr. 134. Frekvence
indukovaných mutací
v závislosti na dávce pro
HPRT gen u savčích
buněk.
mých mutací u bun
stu se používá toxický
obsahujícíc TFT. Předpokládá se, že kolonie vyrůstají z mutovaných buněk – buď spontánně
nebo v důsleku působení zkoumaného faktoru (záření). Tento test určuje zda mutace nebo
chromosomální delece nastala v tk lokusu L5178Y tk+/- buněk. Tyto buňky mají jednu
funkční kopii genu pro thymidin kinazu (TK), což je enzym jehož aktivita je kritická pro
syntézu DNA. Po ozáření jsou vypěstovány kolonie a je stanovena jejich velikost. U malých
kolonii se předpokládá že jsou důsledkem chromosomálního poškození, zatímco velké
kolonie jsou výsledkem mutagenní události v tk lokusu.
72
8.4. Transformace buněk po ozáření
.4.1. Schéma experimentu
ěk, které se rozdělí
o jednotlivých buňkách na misky. Za normálních
čase konfluentní populaci
8.4.2.Detekce transformantů po ozáření
rekvence indukovaných transforman a
ů záření. Bylo zjištěno,
t transformantů roste s dávkou. Genetická účinnost
8
Připraví se kultura embryonálních bun
p
podmínek tyto buňky vytvoří po
a dále už nerostou, protože reagují na tzv. kontaktní inhibici
růstu. Po ozáření však pozorujeme vznik ohnisek větší
hustoty růstu buněk. Tato ohniska lze snadno obarvit a
spočítat. Z těchto ohnisek vzniká po injekci buněk do
organismu isogenní myši nádor. Jsou to tedy buňky
nádorové, které rostou nekontrolovaně neboť ztratily
schopnost kontaktní inhibice. Vhodné buňky lze připravit i
z určitých tkání – např. z kůže (epidermální fibroblasty).
Obr. 135. Schéma experimentu
Obr. 136. Dávkové závislos
transformace buněk.
F tů byla měřena po ozáření z
různých podmínek a pro řadu různých typ
že poče
transformace buněk roste prudce pro větší hodnoty LPE záření a
také v přítomnosti pomotorů nádorového růstu jako je např. TPA
(forbol ester). TPA jako promotor nádorové transformace
potencuje vznik transformantů (obr. 136). Je třeba zdůraznit, že
četnost vzniku transformantů je velmi vysoká (dosahuje 1-6.10-3
–
viz obr. 136), což lze těžko vysvětlit nějakým jednoduchým
způsobem. Přímé mutace vznikají s četností v řádu 1-6.10-5
(viz
předchozí kapitola) a jsou tedy o 2 řády méně četné. Spekuluje
se o poškození genů – mutátorů, ale toto vysvětlení je těžko
akceptovatelné.
ti
73
IX. Letální účinky záření
9.1. Přežití buněk
9.1.1. Experimentální stanovení přežití
Přežitím se v radiobiologii rozumí schopnost buňky vytvořit
kolonii. Klasický radiobiologický experiment sestává
z následujících kroků:
1) Pěstování buněk, jejich příprava pro radiační
experiment (vybere se exponenciální nebo logaritmická fáze
růstu, buňky lze synchronizovat hladověním apod). Pro
sledování kyslíkového efektu se volí speciální postupy.
2) Ozáření buněk se může provést v suspenzi nebo na
povrchu pevného média. Pozornost nutno věnovat správné
dosimetrii. Pro tvrdé γ−záření, které je obvykle k dispozici
(terapeutický ozařovač) není dávka na povrchu maximální
(viz křivky hloubkových dávek obr. 138).
3) Vysetí buněk se provede na pevnou půdu (agar).
Zde je nutno věnovat patřičnou pozornost správnému ředění
suspenze tak, abychom si nekontaminovali roztoky s nižší
koncentrací buněk suspenzí z vyšších koncentrací. Inkubace
buněk se provede v termostatu a to do nárůstu kolonií (obr.
137)
Obr. 137. Kolonie bakterií.
4) Počítání kolonií a vyhodnocení experimentu. Kolonie se dříve počítaly ručně;
v současné době se používá analýza obrazu, kdy se kolonie nacházejí postupným prahováním.
Z obr. 137 je vidět, že si počítač poradí i s překrývajícícmi se koloniemi.
5) Znázornění počtu přežívajících buněk (S) v závislosti na dávce (D) v semilogaritmickém
grafu (obr. 138).
9.1.2. Křivka přežití
Křivka přežití se obvykle zobrazuje v semilogaritmickém
měřítku, kdy na ose x je dávka (D) a na ose y je logaritmus
přežití (S – survival). Křivka má obvykle exponenciální část
charakterizovanou určitým sklonem; tuto část lze popsat funkcí:
S = m.exp(-α.D)
v níž je α sklon a platí:
α=1/Do
kde Do je tzv. střední letální dávka.
Hodnota m se nazývá extrapolační číslo. Pro D=0 je dle rovnice
S=m. Oblast dávek D<Dq =Do.ln(m) je oblast ramene křivky
přežití. Na obr. 138 jsou znázorněny veličiny Do, Dq a m
(extrapolační číslo – nahoře vlevo).
D [Gy]
Obr. 138. Křivka přežití.
9.1.3. Interpretace exponenciálních křivek přežití – zásahový princip
Křivky přežití jsou interpretovány tzv. zásahovou teorií (Dessauer, Altenburger), která vzniká
ve 20. létech 20. století. Vychází ze 3 axiomů (tzv. zásahového principu):
(1) ionizující záření přenáší energii hmotě v diskrétních porcích,
(2) akty vydělení energie jsou v prostoru rozloženy náhodně,
74
(3) reakce biologického objektu na ozáření (např. smrt) nastává zasažením citlivého
terčíku.
Nechť v je velikost citlivého objemu (v µm3) a D je dávka v J/kg. Pak počet zásahů
bude α.vD, kde konstanta je spojena s přepočtem jednotek na zásahy (při 60 eV na zásah a při
1 g/cm3 bude rovna α=100). Pravděpodobnost, že nedojde ani k jednomu zásahu bude dle
Poissonova rozdělení:
P=exp(-α.vD)
Tím je vysvětlen exponenciální charakter křivek přežití.
9.2. Teorie vysvětlující křivku přežití
9.2.1. Zásahová teorie
Experimentální křivky přežití mají často tzv. rameno (shoulder), tj. v oblasti malých dávek
více buněk přežívá než by odpovídalo exponentě. V rámci zásahové teorie je zde interpretace
dvojí.
9.2.1.Vícezásahový model
Uvažujme opět terčík o velikosti v, ale nechť pro jeho
zničení je zapotřebí n-zásahů. Pravděpodobnost n zásahů je
dána Poissonovým rozdělením:
P(n) = (αvD)n
e-αvD
/n!
Buňky hynou při obdržení n a více zásahů, a proto frakce
přežívajících buněk pak bude:
Obr. 139. Křivky přežití pro nzásahů
normované tak, aby pro
D=Do bylo přežití 0.5
n-1
N/No=e-αvDΣ(αvD)k/k!
k=0
Na obr. 139 jsou znázorněny odpovídající křivky pro různé hodnoty n. Pro větší n zřejmě
dostaneme větší rameno na křivce přežití.
9.2.2. Víceterčový model
Druhý model předpokládá, že pro inaktivaci buněk je potřeba inaktivovat více terčíků (m).
Protože pravděpodobnost inaktivace jednoho terčíku je 1- exp(-αvD) a pravděpodobnost
inaktivace m tečíků (1- exp(-αvD))m
, bude pro přežití buněk s m-terčíky platit:
N/N
0
=1-(1-e-αvD)m=1-(1-me-αvD+…±e-mαvD).
Na obrázku jsou křivky přežití pro různé počty terčíků (m). Hodnota m je
dána tzv. extrapolačním číslem. Pro velké hodnoty dávky totiž platí:
ln(N/N0
) = -αvD+ln(m)
a exponenciální část křivky přežití můžeme tedy popsat touto rovnicí.
Když extrapolujeme exponentu k nule, dostaneme v semilogaritmickém
grafu hodnotu extrapolačního čísla (viz obr. 140).
Obr. 140. Křivky přežití vypočtené podle víceterčového modelu.
75
9.2.3. Víceterčový vícezasahový model
Kombinace obou modelů je rovněž možná. Pro m-terčíků a n potřebných zásahů pro
každý terčík máme:
1nN/N0=
1 - (1-e-αvDΣ(αvD)k/k!)m
k!
Je třeba zdůraznit, že experimentální závislosti lze proložit různými kombinacemi těchto
křivek a proto toto zobecnění postrádá biofyzikální interpretaci.
9.2.2. Stochastická teorie
Na proces účinku záření se lze dívat, jako na sérii stavů buňky, mezi nimiž
buňky přechází působením záření. Aby nastala smrt (efekt) musí se dosáhnout
určitého koncového stavu. Pro danou dávku existuje pouze určitá pravděpodobnost
přechodu mezi dvěma stavy. Přechody mezi stavy znázorníme diagramem:
Na obrázku je popsán mechanismus, ve kterém je buňka charakterizována 5
stavy, přechody mají všechny stejnou pravděpodobnost α (na jednotku dávky) a
existuje i pravděpodobnosti obráceného přechodu l. Stav buňky je pak
charakterizován vektorem:
),...,,( 10 nxxxx =
Pro uvedené schéma lze napsat systém rovnic:
Obr. 141
xA
dD
xd
=
kde D je dávka záření a A je matice pravděpodobností přechodů mezi stavy na jednotku
dávky.
⎥
⎥
⎥
⎥
⎥
⎥
⎥
⎥
⎥
⎦
⎤
⎢
⎢
⎢
⎢
⎢
⎢
⎢
⎢
⎢
⎣
⎡
−
−
−
−
−
=
αα
αα
αα
αα
α
0..000
0..000
........
........
000..0
000..0
000..00
A
Tento systém rovnic lze integrovat a dostaneme:
oxAD
ex =
kde exp(AD) je dáno Taylorovou řadou:
∑
∞
=
=0
!k
kk
AD
k
DA
e
Počáteční stav popíšeme vektorem:
).0...,0,1(0 =x
Přežití bude dáno počtem buněk, které nedosáhly konečného stavu (jenž odpovídá smrti
buňky).
∑
−
=
=
1
/
0
0
n
xNN
k
k
76
Pro předchozí matici pak dostaneme řešení ve tvaru (vícezásahových křivek):
∑
−
=
=
−
1
!
)(
/
0
0
n
k
D
eNN
k
k
D αα
Jestliže budou v matici A různé pravděpodobnosti přechodů, jako např.
⎥
⎥
⎥
⎥
⎥
⎥
⎥
⎥
⎥
⎦
⎤
⎢
⎢
⎢
⎢
⎢
⎢
⎢
⎢
⎢
⎣
⎡
−
−
−
−
−
=
−−
−−
12
23
21
10
0
0..000
0..000
........
........
000..0
000..0
000..00
nn
nn
A
αα
αα
αα
αα
α
pak křivky přežití budou mít konečné extrapolační
číslo (e) – viz obr. 142. Extrapolační číslo však
nelze interpretovat jako počet terčíků.
Do stochastických modelů lze zahrnout také
reparační procesy jako zpětné přechody. Matice
reparačních procesů při stejné pravděpodobnosti
zpětných přechodů pro všechny mezistavy bude mít
tvar:
⎥
⎥
⎥
⎥
⎥
⎥
⎥
⎥
⎥
⎥
⎥
⎦
⎤
⎢
⎢
⎢
⎢
⎢
⎢
⎢
⎢
⎢
⎢
⎢
⎣
⎡
−
−
−
−
−
=
λ
λλ
λλ
λ
λλ
λ
λ
00..000
0..000
0..000
........
........
000..00
000..0
000..00
)(A
Obr. 142. Dávkové závislosti přežití
vypočtené ze stochastického modelu
(e je extrapolační číslo).
Matice A pak bude součtem A(αi) + A(λ). Jsou-li
všechny hodnoty α stejné, pak dostaneme křivky
zobrazené na obr. 143. Tvar a citlivost výsledné křivky
závisí na poměru α/λ. Čím je tento poměr větší, tím
méně se uplatní reparace a tím citlivější buňky budou;
zároveň se na křivce objevuje výrazné rameno.
Obr. 143. Dávkové závislosti přežití
pro různé poměry α/λ.
9.3. Moderní teorie vysvětlující přežití buněk po ozáření
9.3.1. Charakteristika modelů popisujících a vysvětlujících křivku přežití
Bylo vytvořeno nepřeberné množství modelů, jež se pokoušely vysvětlit rameno na křivce
přežití. Tak např. byl vytvořen model interagujících radikálů, ve kterém interakce
hypotetických radikálů vedla k letálním událostem, a proto byly malé dávky méně účinné.
V modelu Laurie-Orra se předpokládala existence reparačního zásobníku („repair pool“),
77
který se při vzrůstající dávce vyčerpává a rameno na křivce přežití přechází v exponenciální
část. Tento model také správně popisoval chování křivky přežití pro různé dávkové rychlosti.
Velmi známým se stal tzv. molekulární model Chadwicka a Leenhoutse, v němž se
předpokládá interakce dvou SSB vedoucí ke vzniku DSB. Výsledný počet letálních událostí je
proto lineárně-kvadratickou funkcí dávky. Předpokládá se náhodné rozdělení letálních
událostí v buněčné populaci, a proto se lineárně-kvadratická funkce dávky (D) objevuje
v exponentu křivky přežití (S):
)exp( 2
DDS βα −−=
kde α a β jsou konstanty. Tento model naráží na problém se vzdáleností mezi SSB. Při
běžných dávkách kdy část buněk hyne (1-5 Gy) připadá na buňku řádově 102
-103
SSB.
Průměrná vzdálenost mezi nimi je proto více než 106
nukleotidů, což je molekulárně i
prostorově velmi daleko. Proto byli oba autoři modelu nuceni připustit existenci radikálů
s dlouhou dobou života a jejich interakci na velkou vzdálenost. Takový proces zatím nebyl
potvrzen. Molekulární model byl detailně propracován a vydán v knižní formě.
Dalším velmi propracovaným modelem je model Rossiho a Kellerera, který je založen
na mikrodosimetrických úvahách a budeme se jím zabývat podrobně v kapitole o závislosti
biologického účinku na LPE záření. Křivka přežití tohoto modelu má stejný tvar jako u
molekulárního modelu, avšak interpretace lineárně-kvadratického členu v exponentu je úplně
jiná. Je to důsledek interakce dvou poškození, které vedou k letální události a dále důsledek
nerovnoměrného vydělení energie - někdy vzniknou tato dvě poškození z jedné stopy a někdy
ze dvou stop. Proto se zde objevuje lineárně-kvadratický člen. Problémem tohoto modelu je
skutečnost, že lineární komponenta je daleko větší na experimentální křivce než by bylo
možno vysvětlit teorií.
Řada modelů vysvětlujících závislost křivky přežití na LPE se vůbec nezabývala
tvarem křivky přežití pro řídce ionizující záření. Často byly použity víceterčové formule
(Katz) nebo kombinace víceterčové a jednozásahové formule (Wideroe). Někteří autoři prostě
vzali jako výchozí křivku pro γ-záření jako takovou (Guenter).
V současné době je zřejmě nejuznávanější LPL model S. Curtise (Lawrence Berkeley
Laboratory), který popíšeme podrobněji.
9.3.2. LPL model pro savčí buňky
9.3.2.1. Formulace modelu
LPL model je určitým speciálním případem kinetického více- stavového modelu s více
poškozeními. Letální poškození v něm vznikají konverzí (přeměnou) potenciálně-letálních
poškození. Curtis předběžně identifikoval tato poškození s DSB. V současné době věříme, že
DSB jsou hlavním typem poškození, které je v savčích buňkách opravitelné, ale odpovědné za
letální efekt záření.
V LPL modelu se uvažují 2 typy interakce: lineární a kvadratická. Kvadratická
interakce odpovídá NHEJ. Spojené konce DSB jednoho chromosomu vedou k mutacím, ale
nejsou letální. Kvadratická interakce odpovídá spojování konců různých chromosomů a je
letální. V modelu se připouští možnost vzniku neopravitelného DSB (lineární interakce). Toto
poškození bylo původně interpretováno jako vznik dvou DSB v těsné blízkosti. Nyní se spíše
zdá, že se jedná o komplexní poškození, jež buňka prostě není schopna žádným způsobem
opravit, a které nemůže vést ani ke kvadratické interakci. Na cytogenetické úrovni se nejspíše
jedná o terminální delece části chromosomu.
Matematická formulace LPL modelu spočívá ve dvou diferenciálních rovnicích:
78
kde Ldsb je střední počet DSB na buňku, Σdsb (Σf) je pravděpodobnost vzniku reparabilního
(irreparabilního) DSB pro genom o velikosti Y a při dávkové rychlosti . λ)(tD&
dsb a ηdsb-f jsou
pravděpodobnosti reparace a kvadratické interakce.
Interakce v binárním členu je úměrná čtverci počtu nereparovaných DSB na buňku.
Očekávaný počet konců v čase t je 2.Ldsb(t). Binární interakce může vést ke vzniku různých
typů intro- nebo inter-chromosomových aberaci, např. dicentriků, centrických ringů a
translokací. Dominantní jsou zřejmě dicentriky. Proto jsou fragmenty a dicentriky hlavními
příčinami letálních událostí v LPL modelu.
9.3.2.2. Řešení modelu.
Rovnice jsou integrovány při počátečních podmínkách Ldsb a
Lf=0. Přežití buněk se spočte za předpokladu náhodného
rozložení fatálních poškození v buněčné populaci, tj.
S= exp(-Lf),
kde Lf je střední počet letálních událostí na buňku pro t
nekonečno.
Prakticky se bere 10-15 x větší doba, než je poločas
reparace DSB, tj. 1/λdsb + doba ozařování (při malých
dávkových rychlostech může být doba ozařování významná).
Na obr. 144 jsou křivky přežití publikované
Stackhousem a Bedfordem pro CHO buňky
Obr. 144. Křivky přežití pro 3
dávkové rychlosti. Experiment
je zde porovnán s výpočtem dle
LPL modelu s parametry
uvedenými v textu.
Parametry LPL modelu jsou:
2YΣf = 3.35 10
-2
Gy
-1
2YΣdsb = 2.98 DSB cell
-1
Gy
-1
λdsb = 0.123 h
-1
(5.63 h DSB poločas)
ηdsb-f = 7.62 10
-4
h
-1
79
X. Závislost citlivosti buněk na LPE záření
10.1. Teorie terčíku
10.1.1. Exponenciální křivky přežití
Ozáření biologických objektů zářením s vysokým LPE (např. urychlené ionty, neutrony) vede
často k exponenciální závislosti přežití buněk na dávce. Interpretace těchto exponenciálních
křivek je následující. Předpokládá se, že:
(1) těžké nabité částice usmrcují buňku při průchodu určitým citlivým objemem
(terčíkem) v buňce (jádrem);
(2) pravděpodobnost zásahu je dána účinným průřezem terčíku.
Nechť σ je velikost účinného průřezu (v µm2) a F je fluence částic v počtu částic/µm2. Pak
počet zásahů bude σ.F Pravděpodobnost, že nedojde ani k jednomu zásahu bude dle
Poissonova rozdělení (buňka přežije):
S=exp(-σ.F)
Tím je vysvětlena exponenta křivek přežití pro těžké nabité částice. Do rovnice lze dosadit
dávku ze vzorce:
D = 0.16 × LET × F
kde jednotky jsou následující: D v Gy, LET v keV/µm, F v č/µm2
10.1.2. Metoda segmentů stopy částice:
Při středních a nízkých hodnotách LPE buňka nemusí vždy zahynout při průchodu částice
citlivým objemem. Zahyne zřejmě pro velké LPE (předaná energie bude velká). Tak např. pro
malé LPE (pro γ-záření je LET=0.3 keV/µm) bude předaná energie malá (pro jádro baktérie s
rozměrem 1 µm to bude 0.3 keV =300 eV, tj. 5 aktů předání energie po 60 eV, tedy 5 SSB,
které se reparují s velkou pravděpodobností).
Proto se zavádí funkce ψ(L) , která se rovná
pravděpodobnosti inaktivace buňky pro jeden průchod částice s LPE
= L. Tato funkce definuje efektivní účinný průřez inaktivace buňky:
σ = σo.ψ(L) v předchozí rovnici. Nechť εo je energie předaná při
jednom aktu (obr. 145), d nechť je střední délka terčíku. Pak k=L.d/εo
bude střední počet aktů na jeden průchod částice a při Poissonově
rozdělení bude pravděpodobnost m aktů:
P(m) = km.e-k/m!
Při předpokladu, že pro usmrcení buňky je třeba alespoň n aktů dostaneme:
∑
−
−= −
1
)/.(
1)( /.
n
dL
eL
k
odL o
ε
ψ ε
=
!0
kk
Obr. 145. Průchod
částice citlivým
objemem
LPE
Obr. 146. Pravděpodobnost ψ
v závislosti na LPE.
ψJestliže dosadíme funkce ψ(L) do rovnice pro přežití
buněk S=exp(-σF), kde σ=σo.ψ(L) a F=D/0.16/L, pak
pro tzv. citlivost buněk, tj. hodnotu dávky potřebnou
pro inaktivaci 37% buněk (neboli hodnotu koeficientu
α v rovnici S=exp(-α.D)), dostaneme: σo.ψ(L)/0.16/L.
Pravděpodobnost inaktivace pro částici prošedší terčem
je zobrazena v závislosti na LPE pro různý počet
potřebných zásahů (n) na obr. 146.
80
Jestliže dosadíme do rovnice pro citlivost buněk
(tj. vlastně vydělíme L), dostaneme křivky
s maximem (kromě první obr. 147). Tyto křivky
závisí na počtu nutných zásahů (n) a na velikosti
citlivého objemu (d), který pak odpovídá citlivosti
pro γ-záření. Do rovnice dosazujeme účinný
průřez pro vysoké hodnoty LPE, σo. Tyto
parametry pak popisují celou závislost na LPE.
Na dalším obr.148 vidíme závislosti účinného
průřezu a citlivosti buněk na LPE. Uvedené křivky byly
spočteny pro haploidní
kvasinky a odpovídají
v širokém rozmezí
hodnot LPE teoretické
předpovědi. Podobně lze
popsat inaktivaci
bakterálních spor za
předpokladu, že pro
inaktivaci dojde
v citlivém objemu
velikosti 3 nm k 8
událostem vydělení
energie (obr. 149). Pro
molekulu bakteriofága T1 nejlépe odpovídají křivce 2 události
v rozmezí 1,2 nm (1 událost v terčíku o velikosti 0,6 nm dává
horší popis (obr. 149). Metoda segmentů stopy částice je poměrně hrubou aproximací, avšak
je podstatou prakticky všech modelů popisujících citlivost buněk v závislosti na LPE záření.
D/Do
LPE
Obr. 147. Závislost citlivosti buněk na
LPE záření.
σ
Dο
−1
Do
-1
LPE [keV/µm]
Obr. 149. Závislost citlivosti na LPE
záření pro baktérie a viry
LPE [keV/µm]
Obr. 148. σ a Do
-1
v závislosti
na LPE.
10.2. Katzová teorie
10.2.1. Teorie inaktivace biologických objektů ve stopě částice
Katz ukázal, že účinný průřez může být větší, než je geometrický rozměr objektů, jestliže jsou
tyto objekty citlivé k δ-elektronům. Lokální dávka uvnitř stopy částice je přibližně úměrná
Ze
2/E neboli Ze
2/β2 a nepřímo úměrná vzdálenosti od osy stopy, tj. x2 (viz Struktura stopy
částice str. 30). Jestliže tuto dávku použijeme ve vztahu pro přežití:
)/)(exp()( oDxDxS δ−=
.
1
)( 22
2
x
Z
axD e
β
δ =
kde
a integrujeme přes stopu částice výraz 1-S(x), tj. pravděpodobnost, že buňka zahyne (od nuly
do max. doletu δ-elektronů), dostaneme účinný průřez inaktivace pro jeden průchod částice,
který pak můžeme dosadit do rovnice (viz metoda segmentů stopy částice):
).exp( FS σ−=
81
Katzovy konečné rovnice mají tvar
de popis lokální dávky axi
ůřez v závislosti na LPE záření je zde vypočten pro různě citlivé objekty na
obr. 15
,
i biologickým
řivka přežití vesměs exponenciální, tj. nemá rameno.
(viz teorie
segmen
ro „γ-ray kill mode“ se př čové rovnice:
de koeficienty α a β závisí na pr ace nastane jako „ion kill mode“
kto: α=P.σo, β=(1-P)/Do. Pravděpodobnost P musí záviset na vlastnostech záření a Katz ji
de χ je nový parametr.
( )
( )∫
−
−=
0
/
12 oDxD
exdx δ
πσ
∞
cv
cm
a
b
/
1
246,1
1036.1
2
222
7
=
−
=
⋅= −
β
β
β
⎪⎩
⎪
⎨ ⎥
⎦
⎤
⎢
⎣
⎡
⎟
⎠
⎞
⎜
⎝
⎛
−−−= ∫ axDx
bZ
xdx
o
e 11
2
exp12 2
2
0
βπ
πσ
⎧a
k je trochu modifikován a integruje se do m málního doletu
δ−elektronů (a).
Účinný pr
0. Čísla u jednotlivých křivek znamenají Z. Čárkovaně je znázorněna křivka pro
nekonečně tenkou stopu. Účinný průřez pro bakterie
E.coli (Bs kmen) pro
různé částice s daným
LPE a pro dané Z (typ
iontu) je porovnán
s teoretickými hodnotami
(křížky). β je
energie částice. Z obr.
151 je vidět, že i pro
velmi podobné
hodnoty LPE může
nastat situace že
vyšší LPE nezvyšuje
účinný průřez a
naopak ho snižuje.
10.2.2. Katzová teorie pro savčí buňky
σ
σ Do
LPE [keV/µm]
Obr. 151. Závislost účinného
průřezu (cm2
) na LPE záření pro
bakterie.
LPE [keV/µm]
Obr. 150. Závislost účinného
průřezu (cm2
) na LPE záření.
Zatím jsme se zabývali jednoduchým i objekty (viry, citlivými druhy bakterií,
haploidními kvasinkami), pro které je k
Existence ramene u křivek přežití savčích buněk samozřejmě komplikuje situaci.
Pro savčí buňky Katz rozlišuje tzv. „ion kill mode“ a „γ-ray kill mode“. Pro „ion kill
mode“ se předpokládá exponenciální křivka, ve které je exponent úměrný D/L
tů stop částic):
D
LeDS ∞
−
=
α
)(
P edpokládá platnost klasické víceter
i
mD
eDS )1(1)( β
γ
−
−−=
k avděpodobnosti, že inaktiv
ta
zavádí jako: m
effZ ⎤⎡ 2
P
⎥
⎥
⎦⎢
⎢
⎣
−−= 2
exp(1
χβ
k
82
Pro křivku přežití pak dostaneme:
ato rovnice byla pou etry, ale bez jasné biofyzikální
terpretace. Hodnoty Do a m jsou vlastně odvozeny z křivky přežití pro γ-záření, hodnota σo
í pro inaktivaci).
Tyto m
eorie vychází z experimentálního pozorování, že křivky přežití jsou pro γ-záření (X-záření)
ké, zatímco pro neutrony jsou lineární. Byl učiněn
⎥
⎥
⎥
⎦
⎤
⎢
⎢
⎢
⎣
⎡
⎟⎟
⎟
⎠
⎞
⎜⎜
⎜
⎝
⎛
−−
−
−
∞
m
D
D
P
D
L
P
e 0
)1(
11=
−
eDS
0
)(
σ
T žita pro fitování křivek přežití se 4 param
in
je odvozena ze sklonu křivky přežití pro velmi vysoké LPE. 4-tý parametr je potřebný pro
popis přechodu mezi oběma režimy (ion vs γ-ray). Zatímco první model publikovaný v roce
1967 měl jasnou biofyzikální interpretaci a popisoval účinek záření na jednoduché biologické
objekty, rozvinutý model pro savčí buňky je popisný, bez většího významu.
Oba tyto modely patří do kategorie „energy only models“, tj. uvažuje se v nich pouze
o energii deponované v jádře (nukleoidu) buňky (tato energie je determinujíc
odely fungují pokud produkce poškození nezávisí příliš na LET, tj. pokud letálními
poškozeními jsou např. SSB (u citlivých kmenů baktérií).
10.3. Teorie duálního účinku záření
T
u savčích buněk převážně kvadratic
předpoklad, že γ-záření produkuje dvě nezávislá potenciálně letální poškození, které musí
interagovat aby vzniklo poškození letální, zatímco neutrony produkují letální poškození
přímo. Neutrony mají značnou komponentu záření s vysokým LPE, a proto Rossi navrhl
odvodit interpretaci křivek přežití na základě mikrodosimetrie. Mluvíme o tzv. „duální teorii
účinku“, tj. že účinek nastupuje interakcí dvou potenciálně letálních poškození. Počet
poškození je úměrný specifické enegii (z) absorbované v citlivé struktuře (jádře buňky) a
počet interakcí tedy bude úměrný kvadrátu z2
. Střední počet letálních poškození na buňku
s absorbovanou energií z označme G(z) a frakci letálních poškození v populaci buněk
označme E(D). Pak platí
( ) ( ) ( )0 , dzDzfzGDE ⋅∫= ∞
kde f(z,D) je rozdělení čet uvedeného integrálu lze
rovést zavedením f1(z) funkce jako Poissonovou sumaci členů:
ož je rekurentní formule, kterou lze
specifické energie z při dávce D. Výpo
( ) 2
kzzG =
p
[ ] ( )
( ) ( )
( )
[ ] [ ]
( ) [ ] 1
22
1
2
1
1
2
2
0
1
1
2
1
0
0
12
2
)(])(2
)[(
−
−−
∞
′
∞
−
∞
−
∞
+′−+=
++=
′−′+′′−+
′−′′=
′−′′=
∫∫
∫∫
nFDF
nFnDF
z
n
ź
n
zznzz
zzzzz
zzfzzzz
zzdzzfzd
zzfdzzzfzd
22
∞
= ∫ nn zfdzzz
[ ] ( ) 22
12. FDFn znnzznz −+=c řešit:
83
a sumace pak dá:
ních udál ku se použije v exponentu rovnice pro přežití:
ovnice pro přežití v závislos i často používá v radiobiologii jako
ejjednodušší aproximace nelineární závislosti. Skutečná teorie by nutně potřebovala výpočet
druhy záření
a při stejném LPE závisí na energii záření.
rodukce SSB s růstem LPE klesá; naopak produkce DSB měřených sedimentačními
ělení energie (60 eV) bude dán energií v
0.4.1. Vklad jádra stopy k energii d
počteme oba vklady energie na základě geometrických úvah (obr. 152). Mějme stopu částice
á protíná DNA (zelený hranol) jak
je zde šířka D
opy, k je f
Střední počet letál ostí na buň
22
. DDzz D +=
( )2
DDzk D
eS +−
=
R ti na dávce se velm
n
koeficientů a jejich porovnání s experimentem. Ukazuje se, že takové porovnání není úspěšné,
protože koeficienty u lineárního členu jsou mnohonásobně větší v experimentu než by mohla
dát teorie. Také závislost na LPE nebyla touto teorií nikdy popsána. Pro rozumný popis
závislosti radiačních efektů na LPE je nutné popsat vznik poškození DNA v závislosti na
LPE, čímž se budeme nyní zabývat.
10.4. Vznik zlomů DNA pro různé
Produkce zlomů DNA se mění s růstem LPE záření
P
metodami pro vyšší LPE roste. Takové chování produkce zlomů odpovídá energetické
náročnosti a můžeme je matematicky modelovat.
Při průchodu částice přes DNA vznikne zlom pouze s určitou pravděpodobností danou
E a L (LPE, LET) záření. Střední počet aktů vyd
DNA absorbovanou. Ta závisí na struktuře stopy a na parametru srážky (x). Musíme rozlišit
dva velmi odlišné případy - DNA byla zasažena jádrem stopy nebo δ-elektrony. Obecně může
energie v DNA deponovaná pocházet od obou částí stopy částice:
( ) ( ) ( )xyxyxy += δ
∆
1 eponované v DNA
S
(červeně jádro stopy a žlutě oblast δ−elektronů), kter
jádrem stopy, tak δ-obalem (předpokládejme pro začátek, že stopa je kolmá na molekulu
DNA). Pak frakce energie pohlcená v hranolu pocházející od jádra stopy se dá spočítat pro
různé případy vzdálenosti hranolu od osy stopy (x). Frakce energie deponovaná jádrem stopy
v DNA pak bude (viz naznačený výpočet dále):
( )
min
0
minminmin
2/2/
2/
rx
xx
rrr
+〈〈
−=
⎥
⎦
⎢
⎣
⎟
⎠
⎜
⎝
∆
ll
l
π
2
000
,1arccos
1 xxxk
xy ⎥
⎤
⎢
⎡
⎟
⎞
⎜
⎛
−+
−
=
rmax
rmin
l NA, rmin je poloměr jádra
rakce energie předávanást
δ−elektrony (přibližně platí, že l/2>=rmin).
( )
2/0
2/0
minminmin
l
l
〈〈
−=
⎥
⎦
⎢
⎣
⎟
⎠
⎜
⎝
∆
x
xx
rrrπ
,1arccos
1
2
000 ⎥
⎤
⎢
⎡
⎟
⎞
⎜
⎛
−−−
− xxxk
xy π
Obr. 152. S částice (žlutě)topa a
DNA (zelen Červeně jeě).
zobrazeno jádro stopy.
84
10.4.1.1. Odvození rovnic pro jádro stopy
hel α (viz obr. 153) je dán funkcí arccos(xo/rmin) a výseč odpovídající dvojnásobnému úhlu
uhé rovnici shora. Od této frakce se musí odečíst
k energii deponované v DNA
Kromě jádra stopy částice přispívá k energii deponované v DNA také „polostín“ (angl.
ř , je frakce energie předávaná δ-elektrony (l je zde šířka
je zde šířka DNA, rmin je poloměr jádra stopy, k je frakce energie předávaná δ-elektrony
Ú
α je normována na celkový kruh 2π ve dr
frakce energie přenášené jádrem stopy, která odpovídá trojúhelníku ABC.
l je zde šířka DNA, rmin je poloměr jádra stopy (přibližně platí, že l/2>=rmin). xo = x-l/2
2/
arccos.2.
2
1
arccos 0
=
x
α
0
min
0
1
min
l−=
=∆
xx
r
x
y
r
π ,1
minmin
2 ⎟⎟
⎠
⎜⎜
⎝
−=∆
rr
y
π
1
2
00
⎞⎛ xx
Obr. 153. Jádro stopy částice jako válec
(červeně) a DNA jako hranol (zeleně). Frakce
energie přenášené jádrem stopy, která je
deponována v DNA, se spočítá jako část
červené plochy uvnitř zelené normovaná na
celkovou plochu kruhu. xo = x-l/2 je výška
v rovnoramenném trojúhelníku, který se pro
výpočet také použije.
10.4.2. Vklad δ-elektronů
„penumbra“). Rovnice pro tento vklad jsou následující:
( ) 2/
40
1
40
2
75.1
E
arctg −⎟
⎞
⎜
⎛ ⋅
min
min
75.1
lrxpro
r
E
n
x
x
k
xy +>
⋅
⋅
⎟
⎠
⎜
⎝⋅
=
l
l
π
δ
( ) ,2/
40
11
40
min
min
75.1
2
min
2
75.1
rlxpro
r
E
n
x
r
arctg
x
E
arctg
x
kl
xy +<
⋅
⋅
−⎟⎟
⎠
⎞
⎜⎜
⎝
⎛
−−
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛ ⋅
⋅
=
lπ
δ
( ) ,2/0 max l+>=∆ rxproxy
kka DNA, rmin je poloměr jádra stopy
l
=40 E
1.75
nm)(přibližně platí, že l/2>=rm a rin max
85
86
)( 22
uxr +=
)/(
1
.
1
22
xuarctgdu
xux
=∫ +
,
Lyw
n
ef ⋅
⋅
20
⋅
=
l
ε
2
20
1
⎟
⎟
⎟
⎞
⎜
⎜
⎜
⎛
−⋅=
⋅
⋅
⋅
−
Lyw
DSB
ef
egn ε
l
⎠⎝
( )
( ) dxe
L
LN
Ly
dDSB
ef
2
2
0
9 0
1
1
105.2
⎟
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎜
⎝
−∫⋅=
⋅⋅
−∞
− ε
l
0.4.2.1. Odvození rovnic pro δ-elektrony
okální dávka je úměrná 1/r2, kde a integraci je třeba provádět od
dají polovinu celko
ostaneme normováním na celkovou energii δ-elek gruje
/x2.2πxdx, což dá logaritmus a meze se volí od r do r . l je zde šířka DNA, r je
třední počet zlomů dostaneme jako:
hledem různým možným orientacím
olekuly a stopy částice (zhruba 3/2.l), y.L je frakce energie stopy deponované v DNA, εo je
nergie na jeden akt předání a w je pravděpodobnost vzniku zlomu na jeden akt, tj. 60 eV
Podobně pro dvojité zlomy dostaneme:
kde čtverec je zde proto, že DSB vzniká jestliže na obou řetězcích vznikne SSB a tyto události
jsou nezávislé.
1
L
umin=0 do umax.
dxe
L
LN
w
Lyw
SSB
ef
2
0
9 0
1
12
1
105
⎛
⎟
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎜
⎝
⎛
−⋅∫⋅⋅=
⋅
⋅
⋅⋅⋅
−∞
− ε
l
22
maxmax xru −= 75.1
max .40 Er =
je maximální dolet δ-elektronů. Integrací dostaneme
funkci arctg Obr. 154. Polostín stopy částice (žlutě) a
DNA (zeleně). x je parametr srážky
Meze integrace (0 až u vého integrálu. Člen ve jmenovali
tronů ve stopě, kde se inte
max) nám
d
1 min max min
poloměr jádra stopy, k je frakce energie předávaná δ-elektrony, rmax=40 E1.75 (nm)
10.4.2.2. Odvození rovnic pro produkci SSB a DSB zářením
S
kde leff je efektivní rozměr DNA, který je větší než l vz
m
e
(w=1). Skutečný počet SSB může být 1 nebo 2 (na obou řetězcích):
,12 20
1
⎟
⎟
⎟
⎞
⎜
⎜
⎜
⎛
−⋅=
⋅
⋅
⋅
−
Lyw
SSB
ef
en ε
l
⎠⎝
g je geometrický faktor menší než 1, který zohledňuje pravděpodobnost
ásahu druhého řetězce byl-li zasažen první (z g =0,4).
a x a musíme je proto integrovat přes stopu částice.
elné stndardními metodami) a dDSB (přímé DSB) na
dnotku dávky (Gy-1) a na dalton dostaneme:
Předchozí veličiny jsou závislé n
ro střední počet SSB1 (SSB detekovatP
je
87
,,
22
2
33
3
1SSB
za
N
qp
q
qp
q
NaeS +
+
⋅
+
⋅== ⋅−
dDSB
( ) ( )
( ) ( ) ( )
( )dzzfzz
dzzfzELRG
F
F
Ra
1
0
1
0
,
,,,,
1
⋅∫=
∫⋅
∞
−
−
z
ELRD 1
0 ,, =
ezG 1−= zEL,
∞
⋅
( )
( ) ( )
( )
( ) ( )[ ]
( )
( ) ( )
( )
inin
i
x
L
a
nq
xe
x
xx
qnE
qa
xF
σ
µ
σ
µ
ωφµµ
⋅⋅⋅
⎭
⎬
⎫
⎩
⎨
⎧
+−−⋅=
⋅⋅−=
⋅⋅−+⋅=
=
−
−
24
!
,11
2
1/
3
2
,/105.01
,,1
2
12
1
1
22.0
1
0
1
ll
l
Formul
apř. poškození bazí je častější, než vznik SSB,
proto w (počet poškození na 60 eV) musí být větší. Vznik zlomu a poškození báze na
dnom řetězci lze spočítat, jestliže zmenšíme leff na l/2 (jedná se o jeden řetězec) a zvětšíme
. Komplexní poškození jednoho řetězce je hlavním adeptem na poškození nereparabilní
chlou reparací (SSB1ir)
0.4.3.Výpočet poškození DNA v závislosti na LPE
ení DNA v závislosti na LPE
edeného modelu na obr. 155.
ce tzv. komplexních poškození (SSB1+poškození
áze, tj. dvě nezávislé události na stejném řetězci DNA, leff
e je odhadem pro SSB1, které se obvykle měří po ozáření a přímé dDSB, které
představují hlavní příspěvek k DSB pro částice s vyšším LPE. Výpočet jiných typů poškození
je možný, jestliže zvážíme jejich povahu. Tak n
a
je
w
ry
in x
L
aEq µωσ =−⋅⋅=⋅= ,116,/194 1
42.3
ii
q
ii
q
ω
ωφ
−
⋅
−
∑−=
−−∞
,
1
1, 1
ll
F
a−1
D
1
Produkce poškoz
záření je spočtena podle uv
Počet SSB na jednotku dávky s růstem LPE klesá, stejně
jako počet poškozených bazí. Produkce DSB nejprve roste
a posléze klesá. Na obr. 155 je křivka 1 – produkce SSB1,
2 – produkce přímých dDSB, 3 – produkce poškození bazí
(výpočet proveden jako pro SSB, pouze w větší),
4-produk
b
bude rovna l/2 a w bude větší).
10.5. Odvození rovnic pro přežití bakteriálních buněk
Pro přežití bude zřejmě platit (viz model reparace u baktérií):
kde a je střední počet letálních události a křivka přežití j
koeficientem
e dána exponenciální křivkou s
a. V této funkci však musí figurovat z, tj. speci
kterou buňka cítí. Jestliže G(z) b
Obr.155. Na obrázku jsou
teoretické křivky produkce
poškození DNA
fická energie, neboť to je energie,
ude pravděpodobnost inaktivace buněk při specifické energii
z, pak sensitivitu (1/Do) můžeme psát jako:
Další výpočet lze učinit podle Gubina
zjednodušeným způsobem (viz
rovnice). Zde koeficient a
Výpočet integrálu s f(z,D) funkcí je možné napsat ve formě integrálu s f1(z) funkcí.
10.5.1. Praktický výpočet přežití buněk
závisí na L a
energii záření a dosazuje se z
předešlého výpočtu. µ je zde frakce
energie předávaná oblastí stopy kolem
jádra s rozměrem citlivého objemu
je geom.
průřez citlivé oblasti (pro baktérie je to
přibližně 1 µm2)
(závisí mírně na energii), σin
XI Přežití a mutageneze při ozáření buněk hustě ionizujícím zářením
11.1. Přežití a indukce přímých mutací hustě ionizujícím zářením u baktérií
11.1.1. Vznik přímých mutací po ozáření γ-zářením a urychlenými částicemi
Křivka přežití a frekvence indukovaných mutací v lacZ lokusu E.coli v závislosti na dávce pro
γ-záření 137
Cs je pro srovnání uvedena na obr. 145. Je zřejmé, že křivka přežití je
exponenciální zatímco frekvence indukovaných mutací roste s dávkou kvadraticky. V tomto
experimentu byly stanoveny mutace v lacZ genu pomocí pěstování baktérií na půdě
s tetrazoliem. Na dalším obrázku (obr. 146) jsou uveden křivky přežití a mutageneze pro
těžké ionty (helium s třemi hodnotami LPE a ionty uhlíku se dvěma hodnotami LPE). Křivky
přežití zůstávají exponenciální, ale účinnost iontů helia je větší ve srovnání s γ-zářením. Je
zajímavé, že také závislosti Nm/N(D) zůstávají kvadratickými až do vysokých hodnot LPE
(72 keV/µm). Pro ionty uhlíku se mutageneze snižuje.
Obr.146. Četnost vzniku mutací u
E.coli pro hustě ionizující záření.
Obr. 145. Křivka přežití a
četnost vzniku přímých lac mutací
u E.coli (γ-záření).
11.1.2. Relativní účinnost různých druhů záření.
Letální účinek hustě ionizujícího záření je evidentně větší ve srovnání s γ-zářením (obr. 147) a
až pro hodnoty LPE nad
100 keV/µm se snižuje. To
nelze vysvětlit fluktuacemi
energie v citlivém objemu
buněk, ale spíše větší produkcí
zlomů DNA (DSB) účinkem
hustší ionizace (viz kapitola X).
U mutageneze dochází rovněž
nejprve k růstu účinnosti záření
při zvyšování LPE a posléze
k poklesu, ale maximum se
objevuje při menších
hodnotách LPE (obr. 148). Pokles lze vysvětlit tím, že pro těžké částice buňky hynou
Obr. 148. Relativní genetická
účinnost hustě ionizujícího
záření v závislosti na LPE.
Obr. 147. Radiosensitiva
buněk (1/Do) v závislosti na
LPE záření.
88
průchodem částice přes genom buňky, tj. v přežívajících buňkách nevznikají mutace. Nárůst
může souviset s charakterem poškození DNA, která vedou k mutacím. Pravděpodobně jsou to
poškození komplexního typu, která vedou spíše k mutacím než k letálním událostem.
11.1.3. Závislost citlivosti buněk a mutageneze na LPE u polAkmene
E.coli
Vznik mutací by mohlo objasnit chování reparačně defektních kmenů E.coli na které se nyní
rovněž podíváme. Zajímavé jsou buňky polA, ve kterých se indukuje SOS reparace podobně
jako u buněk „wild type“.
Na obr. 149 je citlivost polA defektního
kmene k různým typům záření. Vidíme, že citlivost
se prakticky nemění což lze vysvětlit velkým
příspěvkem SSB k letálním událostem (chybí rychlý
typ reparace).
Mutageneze vzrůstá
pro těžké nabité
částice a prochází
přes maximum při
10 keV/µm (obr.
150). Chování je
zde podobné jako u
buněk standardního
kmene.
Obr. 149. Citlivost a mutageneze polA
kmene E.coli pro hustě ionizující záření
Obr. 150. Závislost citlivosti
buněk polAa
relativní
genetické účinnosti na LPE
11.1.4. Závislost citlivosti buněk a mutageneze na LPE u lexAkmene
E.coli
lexA- buňky mají defekt v indukci SOS systému. Mutageneze je zde podstatně zeslabená.
Citlivost buněk vůči záření je větší (chybí pomalý typ
reparace). Frekvence indukovaných mutací pro
100 Gy dosahuje 6.10-4
na přežívající buňku, což je
50x méně než pro stejné
dávky u polA kmene
(3.10
-3
). Z obr. 151 je
vidět, že i při malých
počtech mutovaných
buněk lze přímé mutace
snadno detekovat.
Citlivost těchto
buněk
klesá (obr. 152). U těchto buněk se SO
se moc nemění
nebo spíše klesá
s růstem LPE (podobně
jako u polA kmene).
Mutageneze výrazně
S reparace neúčastní mutageneze, a proto je produkce
mutací malá, a ani vyšší hodnoty LPE záření ji nezvyšují. To nelze vysvětlit žádným známým
mechanismem. Pravděpodobně i rychlý typ reparace zlomů DNA za účasti enzymů excisní
reparace jako je polA není zcela bezchybný a může určité typy poškození DNA interpretovat
jako přítomnost jiné báze v řetězci kde je prováděná oprava.
Obr. 152. Závislost citlivosti
buněk lexAa
relativní
genetické účinnosti na LPEObr.151. Citlivost a mutageneze lexA
kmene E.coli pro hustě ionizující záření
89
11.2. Indukce reverzí u baktérií zářením s vysokou hustotou ionizace
Zpětné mutace lze detekovat snadno na půdě, kde původní kmen neroste. Abychom mohli
spočítat frekvenci indukovaných mutací (tj. normovat počty
mutací na přežívající buňku, musíme přesně změřit křivku
přežití. Na obr. 126 (viz kap. 7) je uvedena křivka přežití pro
buňky Salmonella typhimurium s defektem v syntéze histidinu
(jedná se o systém tzv. Amesových kmenů, kde je známá
molekulární událost, která vede k reverzi). Počty reverzí na
přežívající buňku v závislosti na dávce jsou uvedeny na
obr. 153. Křivky odpovídají různým druhům záření – γ-záření,
deuterium (5 a 12 keV/µm),
helium (22 a 83 keV/µm). Na
obr. 154 je závislost relativní
genetické účinnosti na LPE
záření. Je zajímavé, že
genetická účinnost dále klesá u
buněk TA 98, kde je
mutagenní událostí frameshift.
U kmene TA 102, kde
pozorujeme relativně velkou
mutagenezi pro γ-záření
se genetická účinnost dále
zvyšuje pro těžké ionty s růstem LPE záření. Je obtížné
hledat zde vysvětlení na úrovni poškození DNA.
Každopádně se zdá, že poškození vedoucí k reverzím u TA102 a TA100 se liší svou
podstatou od poškození, jež indukují reverze u TA98.
Obr. 154. Relativní mutageneze
u buněk Salmonella
typhimurium pro těžké ionty.
Obr. 153. Dávkové závislosti
Nm/N v log-log měřítku pro TA102
kmen ozářený různými druhy záření.
Indukci přímých mutací i reverzí u baktérií lze popsat lineárně kvadratickou závislostí
do poměrně vysokých hodnot LPE a normováním lze tedy docela jednoznačně stanovit
hodnoty relativní genetické účinnosti, které nejsou funkcí dávky. Těžké částice s vysokým
LPE indukují mutace s větší účinnosti u buněk standardního kmene a polA mutanta, s menší
účinnosti u lexA kmene s defektem indukce SOS systému. U zpětných mutací byly zjištěny
rozdíly mezi účinností záření v závislosti na genetické změně – pro změnu v kodonu TAA je
mutageneze nejvyšší, pro GGG menší a pro frameshifty nejmenší. Těžké nabité částice s
vysokým LPE jsou efektivnější pro mutace v TAA kodonu a relativně méně efektivní pro
frameshift mutace. Kvadratické závislosti na dávce lze vysvětlit nezbytností indukce SOS
systému pro vznik mutací. Podíváme se nyní blíže na indukci SOS samotnou.
11.3. Indukce SOS systému zářením
SOS systém lze zkoumat podle indukce jednotlivých genů s regulací lexA represorem nebo
také s využitím indukce profága λ, který má vlastní represor (lambda represor), jenž je
součástí SOS systému. Zvláštností λ-represoru je jeho schopnost indukovat profága rychleji,
než buňka zahyne, tj. při vážném ohrožení buňky (poškození DNA), dojde ještě na poslední
chvíli k indukci profága, který se pomnoží a lyzuje buňku.
90
11.3.1. SOS chromotest
Ve speciálně upravených kmenech E.coli (nesoucích konstrukt s lacZ genem pod kontrolou
lexA promotoru) lze sledovat indukci SOS systému měřením množství β-galaktosidázy
pomocí vhodného substrátu (ONPG) a fotometrie. Na obr.155
vidíme indukci SOS v závislosti na dávce pro různé druhy
záření. Rostoucí křivky představuji
koncentrace β-galaktosidázy,
klesající křivky jsou kontrolní a
představují koncentrace fosfatázy.
Je zřejmé, že indukce je nejsilnější
t také podle indukce profága λ, který je u tzv. lysogenních kmenů
obností
pro ionty helia. Počáteční sklony
závislostí z obr. 155 normovány na
γ-záření (SOSIP je tzv. SOS
induction potency) jsou zobrazeny
na obr. 156 v závislosti na LPE
záření. Vidíme, že indukce SOS
je nejefektivnější pro LPE kolem
20-50 keV/µm.
Obr. 156. Závislosti indukce
SOS na LPE záření.
Obr. 155. Dávkové závislosti indukce SOS systému
ionizujícím zářením (měřeno SOS chromotestem).
11.3.2. Indukce λ fága
SOS systém lze zkouma
zabudován do genomu a nachází se pod kontrolou SOS systému.
Při poškození DNA dochází k jeho indukci a pomnožení. Na
obr.157 je citlivost kontrolní a lysogenní populace buněk a
indukce profága zářením. Křivka prochází přes maximum, neboť
počet fágových částic na misku je pro velké dávky snižován
letálním účinkem záření. Jak lze očekávat, profág je indukován
s daleko větší
pravděpod u
buněk s defektem polA
enzymu. Na obr. 158
jsou stejné závislosti
porovnány pro buňky
standardního kmene a
polA. Je z nich vidět, že
indukce profága je větší
na jednotku dávky u
polA kmene E.coli než
u standardního kmene a
to v přibližně stejném
poměru jako je
redukováno přežití.
Obr. 157. Křivky přežití
normální a lysogenní
kultury E.coli a indukce
profága v závislosti na
dávce.
Obr. 158. Porovnání standardního
emkmene a isogenního kmene s defekt
v polA .
91
11.3.3. Indukce profága λ hustě ionizujícím zářením
í
SOS systému zářením je potřebná pro
přežití
1.4. Přežití a mutageneze savčích buněk po ozáření hustě ionizujícím zářením
1.4.1. Přežití savčích buněk v závislosti na LPE záření
hustoty ionizace, což je v souladu
Ionty helia indukují fága efektivněji pro standardn
kmen, ale stejně efektivně pro polA defektní mutovaný
kmen, kde je však indukce SOS i tak velká (obr. 159).
Tyto poznatky jsou ve shodě s výsledky získanými SOS
chromotestem.
Indukce
buněk, ale vede ke vzniku mutací a ke
kvadratické závislosti četnosti mutageneze na dávce.
Poškození, která indukují SOS jsou produkována s větší
četností zářením s vyšším LPE (v oblasti 20-
50 keV/µm), což znamená, že jsou to komplexnější
typy poškození, jež vyžadují větší vydělení energie pro
svůj vznik.
Obr. 159. Indukce profága λ hustě
ionizujícím záření.
1
1
Citlivost savčích buněk vůči záření narůstá pro vyšších
s dříve zdůvodněnou představou, že
letální události jsou u savčích buněk
odvozeny od DSB. Produkce DSB
pro vyšší LPE se zvětšuje, a proto
roste také citlivost (obr. 160). Pro
hodně velké LPE nastává opět pokles
citlivosti (to je na obrázku patrné
v oblasti 88-166 keV/µm). Pokles
citlivosti buněk lze vysvětlit
fluktuacemi energie – viz kap. IV).
Růst citlivosti buněk vůči záření
v oblasti 0,3-88 keV/µm není možné
vysvětlit mikrodosimetrií. Je zřejmé,
že dříve popsaný model inaktivace
savčích buněk nazvaný jako „dual
radiation action theory“ (kapitola
10.3) a rozvíjený zejména Rossim a
Kellererem nemůže v principu tyto
výsledky vysvětlit. Také model Katz
formě a poměrně dobrý popis křivek přežití je proto umožněn pouze zavedením dodatečných
(nemodelových) předpokladů o závislosti pravděpodobnosti režimu „ion kill mode“ na LPE
záření. Tyto předpoklady ovšem činí z modelu bezcenný ryze matematický popis. Rozumný
popis přežití savčích buněk v závislosti na LPE záření se objevuje v práci Gunthera a
Schultze, kteří modelují vznik poškození DNA mikrodosimetrickými metodami a dále do své
teorie zahrnují fluktuace energie v citlivém objemu savčích buněk. Popis tohoto modelu je
však poměrně složitý a model neřeší biofyzikálním způsobem vznik poškození DNA
(pravděpodobnost vzniku SSB nebo DSB je v závislosti na absorbovane specifické energii
popsána formální funkcí se 3 parametry). Proto tento model nedoznal velkého uplatnění a
nebudeme jej podrobněji popisovat.
Obr. 160. Přežití T1 buněk (lidské buňky ledvin) při ozáření
částicemi s různou hustotou ionizace: 1-166 keV/µm,
2-110 keV/µm, 3-88 keV/µm, 4-61 keV/µm, 5-25 keV/µm,
6-20 keV/µm, 7-5,6 keV/µm, 8-0,3 keV/µm
e neobsahuje popis vzniku poškození DNA v žádné
92
Závislosti přežití na LPE záření byly studovány v mnoha pracech. V některých autoři
použili stejné částice, a aby dosáhli větších hodnot LPE, snižovali jejich energii, jindy naopak
zvyšovyli LPE výběrem vhodného iontu. V další kapitole jsou uvedené také výsledky přežití a
mutageneze pro velmi těžké ionty končící uranem.
11.4.2. Vznik chromosomových aberací a bodových mutací po ozáření u savčích buněk
V kapitole VII jsme se zabývali vznikem a
osudem chromosomových přestaveb. Tyto
přestavby vznikají několika mechanismy, z nichž
nejčastější je zřejmě chybné spojení konců
chromosomů při NHEJ reparaci. Vyšší hustota
ionizace vede k markantnímu zvýšení účinnosti
indukce aberací (obr. 161). Na obrázku jsou
uvedeny závislosti počtu dicentriků/buňku na dávce
pro různé druhy záření (γ-záření, X-záření,
neutrony, α-částice). Vidíme, že stejný efekt jako
řídce ionizující záření (γ-záření nebo X-záření) zde
působí 20-30x nižší dávky α-záření. Proto jsou
neutrony a α-částice považovány ze zdravotního
hlediska za velmi nebezpečné druhy záření.
U savčích buněk lze rovněž detekovat
bodové mutace (např. mutace v genu HPRT), který
odpovídá za rezistenci k 6-thioguaninu (kap. 7.2).
ozáře
ěžkými
onty s různou hodnotou LPE. Detekované závislosti
sou složité, a proto je uvedeme v další kapitolce kde
e zároveň pokusíme o jejich interpretaci.
Vznik těchto mutací byl detekován po ní
t
i
j
s
11.4.3. Transformace buněk hustě ionizujícím
z
Ú ěžkých nabitých částic je podstatně větší ve
s
z
Obr. 161. Dávkové závislosti indukce
dicentrických aberací pro různé hodnoty LPE
záření.
Obr. 162. Četnost transformace buněk
v závislosti na dávce záření pro různé LPE.
ářením
činnost t
rovnání s X-zářením, zejména v oblasti malých dávek
áření (obr. 162). Lineárně-kvadratická závislost
přechází na lineární.
93
XII. Matematické modely mutagenního účinku záření s vysokým LPE
12.1. Indukce mutací a přežití baktérií po ozáření částicemi s velmi vysokým LPE
V tabulce 5 jsou uvedena souhrnná data o indukci mutací různými druhy záření. Jsou popsány
charakteristiky záření a uvedeny účinné průřezy pro indukci mutací. Tyto experimenty byly
provedeny v Berkeley na Bevalacu (Fe, Ne ionty), Dubně na urychlovači U400 (D, He, C),
Darmstadtu (B. subtilis) a některé také u nás v Řeži u Prahy na cyklotronu (lacI mutace na
svazcích He a D)
Tab.5. Fyzikální parametry těžkých iontů , které byly použity v experimentech, experimentální účinné průřezy
indukce mutací (σm) mutagenní účinnosti na částici (MPE), získané z poměrů σm a konstanty indukce mutací αm
pro X nebo γ-záření
94
Vznik mutací u baktérií po ozáření můžeme matematicky popsat na základě představ o
struktuře stopy částice. Zavedeme k tomu účelu mutagenní účinnost γ-záření jako koeficient
ve vztahu m=αm.D, a mutagenní účinnost záření s daným LET jako koeficient ve vztahu
m=σmF. ( )
( ) DFm
FDm
m
mi
α
σ
γ =
=
Poměr těchto účinností označíme MPE=σm/αm
Veličina MPE se snadno určí z experimentu a pokusíme se tedy o její výpočet. Zavedeme
ještě důležitý vztah mezi dávkou δ-elektronů Dδ a fluencí částic F. Budeme předpokládat, že
frakce energie deponovaná elektrony bude fδ. Pak platí:
FLETfD
FLETD
×××=
××= ∞
δδ 16.0
16.0
Spočteme frakci fδ na základě modelu struktury stopy částice.
Strukturu stopy lze popsat několika modely různých autorů (Chatterjee, Kudrasov,
Kiefer a Katz), přičemž se tyto modely liší jednak úbytkem energie v závislosti na vzdálenosti
od osy stopy a jednak odhadem pro dolet δ-elektronů. Přesto vedou tyto modely k velmi
podobným odhadům pro závislost fδ(E). Stopa je popsána v modelu Kudryashova (resp.
Kiefera a Straatena) funkcemi:
95
22
bβ
δ
2
1
000125.0
Z
D
eff
××=206.1
2
1
bE
Z
D
n
eff
×≈δ
Závislosti fδ(E) jsou uvedeny na obr. 162.
Obr. 162. Výsledky Monte Carlo výpočtů frakce energie deponované těžkými ionty v nepřímých zásazích (fδ)
ve sférických objektech (rs=0,3µm). Funkce fδ (Εn) je spočtena na základě modelů Kudriashova, Chetterjeeho,
Katze a Kiefera.
Závislost fδ(E) byla spočtena Monte Carlo ale
lze ji snadno popsat empirickou funkcí:
kde c=rδ/rs rδ=0.0616.E1.7 je aproximace
Kiefera a Straatena pro dolet elektronů ve
stopě částice. Na obr. 163 je znázorněna
závislost uvedené funkce na velikosti
citlivého objemu rs. Vidíme, že pro větší rs je
frakce fδ menší. Křivky spočtené na základě
semiempirické formule jsou proloženy
experimentálními body.
V tabulce 6 jsou uvedeny kromě účinných
průřezů pro indukci mutací také hodnoty MPE, které mají důležitou vlastnost. Jestliže je
relativní biologická účinnost těžkých částic stejná
jako je účinnost γ-záření, tj. mi=mγ, pak
dosazením za dávku dostaneme:
Obr. 163. Závislost frakce energie
deponované v nepřímých zásazích na
energii částice pro různé velikosti
citlivého objemu.
( ) ( )
( )n
Cc
Bc
ED
ec
eAf
×
+
×−×=
−
−
log
log
1
/
/
δ
MPE = 0.16. L,
tj. MPE bude lineárně růst s LPE částic. Pro velmi
těžké částice, které zabijí buňku průchodem přes
její citlivou strukturu a jejichž mutageneze
prostřednictvím δ-elektronu je stejná jako u γzáření
dostaneme:
Obr. 164. Mutagenní efektivita částic
jako funkce LET pro lac1mutace
v E.
coli (O,) lac Z mutace v E.coli HfrH( ),
jeho reverse v S. thyphimurium TA 102
(∇) a v B. subtilis HA 101 spores (◊).
MPE = 0.16. fδ . L
Na obr. 164 jsou uvedeny hodnoty MPE pro různé
LPE. Je vidět, že MPE nesouvisí jednoznačně s
LPE částic. Jestliže však vyneseme MPE v
závislosti na fδ.LPE, dostaneme zřetelnou
korelaci; nejlepší pro model Kudryashova a
Kiefera (obr. 165). Závislosti MPE na LET pak
vytvářejí sérii křivek (obr. 166).
Na
tomto
obrázku
vidíme
závislostni MPE
na LPE a ické
Obr. 165. Závislosti MPE na frakci
LPE odpovídající nepřímým srážkám.
Obr. 166. Závislost MPE na LPE pro
různé ionty (Z je nad křivkou)
96
Pro oblast LPE do přibližně 100keV/µm je zřejmě lepší
veličinou pro popis mutagenního účinku L.(1-fδ) a to z
toho důvodu, že částice nezabíjejí buňky, přes které
projdou a naopak nejvíce mutagenních události vzniká v
těchto případech. MPE lze pak popsat jako nelineární
funkci veličiny L.(1-fδ). Na obr. 167 je vidět, že tato
funkce je jednoznačná.
Obr. 167. Mutagenní účinnost na částici (MPE) urychlených těžkých iontů pro LPE<100 keV/µm jako
funkce omezeného LPE (LET(1-fδ)) .
12.2. Model mutagenního účinku záření s různou hustotou ionizace pro savčí buňky
ět budeme rozlivat přímý a nepřímý zásah citlivého objemu.
U savčích buněk je hustota chromatinu menší a nerovnoměrná, o čemž svědčí skutečnost, že
některé částice mohou projít jádrem buňky a nezpůsobit žádný efekt. To budeme modelovat
otvory v jádře. Průchod částice otvorem bude rovněž považován za nepřímý zásah. Pokud
bude energie částice dostatečná, může být citlivý objem zasažen δ−elektrony.
Obr. 168. Přímý a nepřímý zásah u bakteriálních buněk (vlevo) a u savčích buněk s velkými rozdíly
v hustotě chromatinu (otvory modelují místa v jádře s malou hustotou genetického materiálu). Nepřímé
zásahy jsou zde dvojího typu.
Znázorníme si situaci kdy částice prošla otvorem a její δ-elektrony zasáhly genetický materiál
buňky (obr. 169). Frakce energie deponovaná v citlivém objemu pak bude závislá na energii
částice. Na obr.170 jsou tyto závislosti pro různé modely popisující stopu částice.
Obr. 170. Frakce energie deponovaná
v citlivém materiálu
buněk při průchodu otvorem o
průměru 0.1-0.3 µm fx.
Obr. 169. Modelování situace, kdy
částice prošla otvorem a zasáhla citlivé
struktury svými δ-elektrony.
97
Výpočet fx byl proveden za předpokladu existence spojité jaderné hmoty kolem jednoho
otvoru metodou Monte Carlo, užitím různých modelů popisujících strukturu stopy částice. Pro
účely dalších výpočtů byla závislost fx(E) popsána funkcí:
cwx Rqpro
r
q
af <⎟
⎠
⎞
⎜
⎝
⎛
+= 1ln
c
c
wx Rqpro
r
R
af >⎟
⎠
⎞
⎜
⎝
⎛
+= 1ln
7.1
.077.0 Eq =
g
x
A
fLET
D ∞
=
16,0
δ
kde
je poloměr buněčného jádra (6 µm), r je poloměr otvorů (0.1 µm), aw je fitovaný
arametr a rovná se aw=0.062. Závislost fx(E) je podobná pro různé modely stopy částice
činný průřez pro inaktivaci bude složen ze dvou komponent, neboť částice může inaktivovat
ebo projde otvorem a její δk
řežití pro ionty helia s LPE =
20 keV/µm, která je exponenciální, můžeme psát:
V t -elektronů rovna:
V těchto rovnicích je dávka pocházející od δ-elektronů rovna:
ádné mutace tak nevzniknou.
í úměrný dávce indukované δkde
αm,d je konstanta indukce m k definici účinného průřezu
pro indukci mutací: p=σ/Ag mů
kde σi je počítáno z p
a Rc
p
(Chatterjee , 1973; Kudryashov, 1973; Kiefer and Straaten, 1976)
2.2.1. Model letálního účinku záření pro velmi vysoké LPE1
Ú
buňku buď tak, že projde citlivou oblastí (mimo otvory) n
elektrony způsobí inaktivaci. První komponenta bude pro velmi těžké částice rovná
geometrickému průřezu citlivé části jádra Asen. Druhá komponenta bude dána
pravděpodobností, že částice projde otvorem (průřez všech otvorů na jádře je Ag-Asen) a
pravděpodobností, že buňka zahyne působením dávky Dδ.
))(1)((,, δσσσ DSAAA sengseninsisenii −−+=+=
řivku pVzhledem k tomu, že pro δ-elektrony bereme
))exp(1()( δδασ DAAA sengseni −−×−+=
ěchto rovnicích je dávka pocházející od δ
Částice procházející sensitivní části jádra buňku zabije a ž
Naopak, částice procházející přes otvor způsobí vznik mutac
elektrony. Jestliže pro záření s nízkým LPE (ionty helia) bude frekvence indukovaných
mutací m(D), pak pro velmi vysoké LPE bude pravděpodobnost indukce mutace v buňce
ozářené δ-elektrony jedné částice:
( ) ( )( ) insinsiins AADmDp /,σδδ −=
( ) ( ) insinsiinsm AADD /,,p
utací pro nízké LPE. Vzhledem
žeme psát:
σα δδδ −=
ins
xm
ins A
fLET
A
iginsiins
xmm
AA
fLET
σ
α δ= ∞16,0,
σ
ασ δ
−−
= ∞16.0 ,
,
ředešlé rovnice.
98
Experimentální účinný průřez inaktivace buněk v závislosti na LPE je znázorněn na obr. 171.
2.2.2. Model letálního účinku záření pro střední LPE
2.2.3. Vznik mutací u savčích buněk po ozáření různými druhy záření – model
ři průchodu
Teoretické křivky jsou zobrazeny pro velmi vysoké LPE a jak je vidět, dobře odpovídají
experimentu.
Obr. 171. Účinný průřez inaktivace pro V79 buňky
ozářené různými těžkými ionty je zobrazen v závislosti na
LET, ( ∞LET ). Experimentální data jsou porovnána
s křivkou vy očít nou sp a použitím předchozích rovnic pro
∞LET >500 keV/µm. (○ = ionty He a Kr, □ = C a Xe, ◊ =
U, obrácený trojúhelník, Ne). Byly použitAr, ∆ y
následující parametry: konstanta inaktivace pro nízké LPE
(α = 0,67 Gy-1
), plocha jádra σ =100 µm2
; účinný průřez
citlivých částí jádra σ = 35µm2
. fx hodnoty byly
vypočítány z výše uvedených rovnic.
1
Pro střední hodnoty LPE je dříve
rozpracovaná teorie neplatná. Buňky mohou přežít
přímý zásah do citlivé části jádra a produkce
mutací v těchto buňkách předčí mutace
indukované δ-elektrony. Proto v této oblasti LPE
může být popis pomocí LET∆=LET (1-fx)
vhodnější, než použití celkového LET∞.
Omezíme se na popis konstant inaktivace a
indukce mutací (α a αm) lineárními závislostmi.
Pak můžeme celkem snadno popsat závislosti
účinného průřezu inaktivace a indukce mutací na
LPE (obr. 172). Na obrázku jsou experimentální
data porovnána s teoretickými křivkami
vypočítanými z výše uvedených rovnic.
Obr. 172. Účinný průřez inaktivace pro V79
buňky ozářené různými těžkými ionty je
zobrazen v závislosti na LET, ( ∞LET ).
1
mutagenního účinku záření
Snadno lze spočítat mutagenezi pro velmi těžké ionty, kdy částice p
citlivou strukturou inaktivuje buňku a mutace vznikají pouze při průchodu otvorem. V oblasti
středních hodnot LPE je nutno model doplnit podobně jako u letálních účinků záření – zde
vznikají mutace také při průchodu částice
citlivým objemem, protože nenastává letální efekt
se 100% účinností (obr. 173).
Obr. 173. Účinný průřez mutageneze pro buňky V79
ozářené různými těžkými ionty je zobrazen v závislosti
na LET, ( ∞LET ). Jsou uvedena experimentální data
odlišných la oří: Kranert (○ = ionty O a Au, □ = Ne
a Pb, ◊ = Ni, ∆ U, obrácený trjúhelník, Ti). Byly použit
borat
y
následující parametry: mutagenní konstanta pro nízké
LET α = 2x10-5
Gy-1
; η = 0,2mm. L0 = 20keV/µm.
99
XIII. Účinek záření na tkáně
13. 1. Pokrok v radiační terapii v průběhu 20. století
13.1.1. Léčebná terapie na začátku 20. století
Prakticky od objevu radioaktivního záření je toto záření využíváno k
léčbě nádorových onemocnění. První úspěšná léčba byla uskutečněna
u 49-leté pacientky s basaliomem kůže na nose (obr. 174). Pacientka
byla ozařována ve více než 100 frakcích, v průběhu 9 měsíců. Poté
žila ještě 30 let. Vespod je pacient, u něhož byl vyléčen spinocelulární
karcinom. Mnoho pacientů v té době žaslo nad blahodárným vlivem
záření. Nutno zdůraznit, že bez
ozařování by většina z nich
beznadějně zemřela.
Na začátku 20. století byla
terapie zářením prováděná velmi
jednoduchým způsobem. Na obrázku
175 je Riederová terapeutická místnost v Mnichově –
současně bylo ozařováno několik pacientů. Terapie byla
doprovázena jiskrami, praskáním a kouřem, ale byla účinná.
Obr. 174. První pacienti
léčení ionizujícím zářením.
Obr.175. Ozařovna začátku 20.
století.
13.1.2. Léčebná terapie na začátku 21. století
V průběhu 20. století zaznamenala léčebná terapii zářením velký pokrok. Na obr. 176 je
ozařovna s lineárním urychlovačem.
Schéma urychlovače je vpravo, kde
vidíme, že elektrony produkované
v elektronovém dělu jsou urychleny
elektromagnetickou vlnou, jejich dráha je
zakřivena magnetem a dopadnou na terčík,
kde produkují X-záření. Svazek fotonů je
kolimován do ozařovaného prostoru. Celý
systém může kolem pacienta rotovat a
svazek se dá směrovat na tentýž bod
z různých směrů. To umožňuje podstatné
šetření zdravých tkání při zachování
dostatečné dávky v nádoru. Na obr. 177
vidíme soudobé plánování léčby pomocí CT
kdy v příčném řezu je vidět nádor (červeně)
v prsu pacientky. Ozařování je voleno
s využitím klínu (vlevo), který mění intenzitu
napříč svazkem. Jsou použita dvě protilehlá
tangenciální radiační pole (6 MV) s klínem
(zobrazeno je pouze jedno), která dodají téměř
homogenní dávku uvnitř prsu. Izodozy
ilustrují homogenitu pole napříč tkání.
Výsledkem je homogenní prozáření oblasti
kolem nádoru při šetření zdravých tkání – plic,
srdce a kůže na povrchu.
Obr. 176. Terapie pomocí lineárního urychlovače
(vlevo) a jeho schéma (vpravo)
Obr.177. Transaxiální pohled na CT obraz,
který ilustruje typický ozařovací plán pro
rakovinu prsu (vlevo). Radiační pole jsou
tvarována tak, aby byla minimální dávka
absorbovaná v plících a v srdci (vpravo).
100
Léčebná terapie zářením je příkladem úspěšné aplikace pokročilé fyziky při léčbě lidských
onemocnění, jež vede ke zlepšení kvality a délky života a v mnoha případech dokonce k
vyléčení pacientů jinak ohrožených na životě. Co způsobuje záření rakovinným buňkám?
Zhoubné onemocnění je charakterizováno neomezeným dělením buněk, které narušuje
okolní orgány a tkáně a ohrožuje pacienta na životě. Cílem léčebné terapie zářením je proto
aplikace takové dávky do cílového objemu, která sterilizuje rakovinné buňky a to při
přijatelném poškození okolní zdravé tkáně.
Některé faktory napomáhají tomuto léčebnému cíli, jiné zhoršují situaci a výsledek
léčby. K první skupině faktorů patří např. skutečnost, že nádor sestává z dělicích se buněk,
které jsou zčásti v M-fázi buněčného cyklu a jsou tedy citlivé k záření. Normální tkáň se dělí
málo a je tedy obvykle rezistentnější. Naopak u nádorů je zhoršené zásobení kyslíkem a část
buněk může být v hypoxii, která snižuje účinek záření.
13.2. Kvantitativní popis účinku záření na tkáň
13.2.1. Terapeutický poměr
Studium účinku záření na tkáně je důležité z
toho důvodu, že vysoké procento lidské populace
onemocní v průběhu života zhoubným nádorem (asi
20-25%) a z toho zhruba 60% lidí je ozařováno
masivními dávkami ionizujícího záření s cílem
odstranit nádor nebo alespoň zmírnit potíže
(paliativní ozařování). Na obr.178 vidíme
schématicky závislosti pravděpodobností vyléčení
nádoru na dávce a pravděpodobnosti vzniku
poškození zdravé tkáně. Poměr dávek se nazývá
„terapeutické poměr“ a je příznivý, jestliže se
křivka pro nádor nachází vlevo od křivky pro
zdravou tkáň. To však vždy nenastává.
Při terapii je nezbytné stanovit dávku záření
(přesnou hodnotu) a to tak, aby tato dávka byla optimální. Proto je od počátku existence
radioterapie snaha zavést kvantitativní modely účinku záření, které by umožňovaly tuto
hodnotu spočítat.
Obr.178. Definice „terapeutického poměru“ .
13.2.3. Strandqvistovy grafy
Ozařování se používá k léčbě nádorů už od počátku 20. století. Úspěšnost se postupně
zlepšovala od zvládnutí povrchově se šířících nádorů ve 20-tých a 30-tých létech přes nádory
hrtanu, úst a nosu ve 30-tých létech až po hlouběji uložené nádory, když se začaly používat
kobaltové ozařovače v 50-tých a 60-tých létech. Standardní frakcionační schémata byla 5
frakcí za týden po dobu 5-7 týdnů.
Změny ve frakcionaci, o které se terapeuti pokoušeli směřovaly jednak k
hyperfrakcionaci (HF) – větší počet menších frakcí a také k akcelerované frakcionaci (AF) –
zkrácení celkové doby ozařování při použití větší dávky na frakci. Oba tyto režimy mohou mít
význam z čistě praktického hlediska (např. je třeba urychlit ozařování kvůli špatnému
zdravotnímu stavu).
Jak již bylo uvedeno, zvyšování dávky je limitováno poškozením zdravé tkáně. Z
druhé strany, příliš malá dávka nezlikviduje nádor, který ve většině případů ohrožuje život
pacienta.
Už ve 30-tých létech bylo zjištěno, že při frakcionované léčebné terapii odpovídá
dávce 20 Gy v jedné frakci zhruba 40-45 Gy ve 12 dnech, a to je dále ekvivalentní 50 Gy ve
101
třech týdnech. V roce 1944 se objevuje Strandqvistová monografie, v níž jsou uvedeny
výsledky léčby 280 pacientů s rakovinou kůže. Na základě těchto údajů autor sestrojil tzv.
isoefektní křivky, tj. závislosti dávky nutné pro dosažení toleranční reakce tkáně na době
frakcionované léčebné terapie.
Ukázalo se, že tyto závislosti lze vystihnout v dvojitém logaritmické měřítku přímkou,
tedy rovnicí:
ln (D) = κ.ln(T) + η
kde κ a ν jsou konstanty. Strandqvist proto zobrazil své klinické údaje v grafu, v němž
na svislou osu nanášel logaritmus celkové dávky a na horizontální osu logaritmus celkové
doby ozařování. Tyto grafy se nazývají Strandqvistovy grafy a grafy odrážejí obecnou
zákonitost růstu celkové dávky, která způsobuje určitou reakci tkáně, s růstem doby ozařování
T v kvantitativním tvaru. Jelikož Strandqvist předpokládá, že linie odpovídající různým
reakcím tkáně jsou paralelní, parametr h se dá pak chápat jako míru poškození tkáně.
Strandqvist dospěl k hodnotě sklonu κ=0,22 pro různé typy poškození kůže, a také pro
nádor (spinocelulární karcinom kůže). Později se ukázalo, že sklon κ se liší pro kůži a pro
karcinom kůže (výsledky mnoha autorů shrnul Cohen ve své disertaci): κk=0,33 a κr=0,22.
Aby bylo možné určit dávku při změně frakcionačního režimu, zavedl Ellis (1969)
empirické funkční závislosti. Ellis předpokládal, že rozdíl ve sklonech pro nádor a zdravou
tkáň je dán existencí homeostatických zpětnovazebních regulačních mechanismů u
normálních tkání, které neexistují u nádoru. Proto se normální tkáň zotavuje rychleji než
nádor a frakcionovaná terapie je výhodnější nežli jednorázové ozáření.
Druhý základní Ellisův předpoklad se týká buněčné reparace, která probíhá uvnitř
buněk po každém ozáření a je ukončena během několika hodin. Podle Ellise se buňky kůže a
karcinomu kůže neliší svými reparačními schopnostmi, neboť jsou stejného původu.
Vzhledem k tomu, že u nádoru nedochází k repopulaci, je nárůst dávky v grafu
důsledkem zvyšování počtu frakcí, po každé z nichž proběhne buněčná reparace. Stejnou
závislost na počtu frakcí lze očekávat pro normální tkáň, která se navíc zotavuje repopulací.
Pro kůži tedy můžeme psát: ln (D) = κk.ln(T) + ηk
a pro karcinom kůže: ln (D) = κr.ln(T) + ηr
Pro nádor je podstatný počet frakcí N a nikoli doba ozařování T. Protože platí
přibližně, že N je úměrné T (5 frakcí v týdnu o stejné velikosti), můžeme v rovnici pro nádor
T zaměnit za N. Pro kůži pak můžeme psát, že sklon je součtem dvou příspěvků, z nichž první
je stejný jako u nádoru, tj.
κk = ν + τ
kde ν=κr představuje buněčnou reparaci; druhý sčítanec představuje příspěvek
repopulace. Po dosazení parametrů z Cohenovy disertace ν = 0,24 a τ = 0,11 dospěl Ellis k
výsledným rovnicím.
13.2.4. NSD koncepce
11.024.0
.TN
D
NSD =
Výsledné rovnice definují tzv. nominální standardní dávku (NSD) pro zdravou tkáň
jako:
24.0
N
D
NSTD =a tzv. nominální standardní dávku na nádor (NSTD) :
Tyto rovnice definují dávku pro daný frakcionační režim a danou hodnotu NSD
(NSTD), která odpovídá určitému stupni poškození tkáně (event. pravděpodobnosti vyléčení
nádoru). Význam tohoto výsledku byl obrovský, o čemž svědčilo využívání uvedených rovnic
102
v praxi po dlouhou dobu po celém světě. Ellis navrhl zavést pro NSD jednotku 1 ret (roentgen
equivallent therapy) a pro NSTD jednotku 1 ren (roentgen equivallent neoplasma).
Ellis značně rozšířil možnosti využití uvedených rovnic zavedením dalšího
předpokladu, že totiž míra poškození kůže je dána rozsahem poškození pojivové tkáně;
pojivová tkáň je pak podle Ellise kritickou tkáni pro poškození zářením prakticky všech částí
těla s výjimkou některých citlivých orgánů.
Hodnota NSD a NSTD závisí na lokalizaci, velikosti nádoru, technice ozařování
apod. V učebnicích radioterapie se často uváděly hodnoty NSD v retech pro toleranci tkáně za
určitých podmínek.
13.2.5. TDF faktor
V roce 1973 zavádějí Orton a Ellis tzv. TDF faktor pro výpočet toleranční dávky u
neregulárních frakcionačních režimů.
Jestliže totiž dojde ke změně frakcionačního režimu, např. v polovině ozařování,
vzniká problém, jakou dávkou lze pacienta doozařovat. Orton a Ellis zavádějí pojem tzv.
parciální tolerance:
PT = NSD*n/N,
kde NSD odpovídá zadané reakci, n je již aplikovaný počet frakcí a N je celkový počet frakcí
odpovídající úplnému režimu. Jestliže zavedeme dávku na frakci d a dobu mezi frakcemi t,
můžeme parciální toleranci psát ve tvaru (dosazením z Ellisovy rovnice):
169,0538,1538,0
..).( −−
= tdNSDnPT
Parciální tolerance se mohou sčítat až do celkové maximální hodnoty PT=NSD. Vzhledem k
linearitě vztahu pro PT na počtu aplikovaných frakcí n, Orton a Ellis zavádějí tvz. TDF faktor
jako:
3169,0538,1
10... −−
= tdnTDF
TDF faktor lze počítat i pro neúplné frakcionační režimy a sčítat v případě aplikace
dvou různých režimů. Celková dávka pak musí být taková, aby finální hodnota TDF
nepřekročila určitou mez.
13.2.6. Cohenův model
Rozvoj radiobiologie vedl k pokusům zavést radiobiologické výsledky do radioterapie.
Jako první s o to pokusil Cohen v roce 1968. Jeho model je založen na předpokladu, že
makroskopická reakce tkání je způsobena vyhubením určité populace kmenových buněk. Čím
menší je přežití kmenových buněk, tím silnější bude reakce. Předpokládá se, že reakce
odpovídá minimálnímu množství kmenových buněk, které máme ve tkáni těsně po skončení
terapie.
Přežití buněk po ukončení terapie je podle modelu důsledek dvou protichůdných
procesů – letálního účinku záření na jednotlivé buňky a zotavení na úrovni tkáně –
repopulace. Letální účinek záření je popsán křivkou přežití s ramenem, která zároveň v sobě
zahrnuje buněčnou reparaci. Repopulace se uskutečňuje mezi jednotlivými frakcemi dávky
podle logistické křivky. Normální tkáň se může plně zotavit pouze v tom případě, jestliže
počet buněčných dělení nepřekročil kritickou mez. Po vyčerpání této vitální kapacity tkáně
další zotavení už neprobíhá. Model bere do úvahy objemový faktor (tj. závislost účinku
frakcionované terapie na velikosti ozářeného objemu nebo velikosti pole).
2
.. ybya
dt
dy
−=
Cohen bere víceterčovou formuli pro popis přežití (později lineárně-kvadratickou).
Repopulace je popsána diferenciální rovnicí:
103
kde y je množství buněk, a, b jsou parametry určující rychlost růstu a počet buněk v
rovnovážném stavu (po dosažení maximální hustoty).
Výsledné přežití je v Cohenově modelu dáno vztahem:
∏
−
= −−+
=
1
1
1
).exp().(
.N
i iiii
i
N
taScS
cS
S
kde Si je přežívající frakce po i-té frakci záření, tj. dávce di, a je rychlost růstu, ti je interval
mezi frakcemi a ci je mez růstu po i-té frakci. Tato mez je rovna 1 při vyčerpání růstových
možností nebo eG.S1.S2…Si pro i-tou frakci G je maximální možný počet buněčných cyklů.
Možnosti Cohenova modelu jsou následující. Optimalizací lze určit parametry a model
lze pak využít v klinické praxi. Vzhledem k tomu, že parametry jsou získány z
experimentálních, či klinických dat, lze považovat předpovězenou dávku za interpolovanou
nebo extrapolovanou hodnotu. Radiobiologická interpretace umožňuje zavádět korekce na
různé faktory jako např. LPE záření, dávkovou rychlost, kyslíkový efekt apod.
13.2.7. NSD koncepce a přežití kmenových buněk
Experimenty na tkáních ukázaly (např. Hornseyová), že určité poškození tkáně (definované
např. jako LD50 v 5 dnech) odpovídá určité hladině přežití kmenových buněk (S=0.01 pro
tenké střevo). Hladina přežívajících buněk pro LD50 byla stejná pro několik různých režimů
frakcionace a také při ozáření v anoxii. Podobná souvislost byla nalezena také pro kůži a u
krvetvorné tkáně.
Vzhledem k tomu, že NSD koncepce popisuje účinnost frakcionovaného ozařování a
týká se především makroskopické reakce kůže, logickým důsledkem bylo hledání vztahu mezi
NSD a přežitím kmenových buněk ve tkáni.
Pro kůži se tedy můžeme pokusit o nalezení vztahu mezi přežitím kmenových buněk a
makroskopickou reakcí popsanou NSD. Budeme předpokládat, že určité přežití SN po N
frakcích bude korelovat s NSD a bude závislé na D, N a T. V obecném případě na dávkách v
jednotlivých frakcích di a intervalech mezi frakcemi ti.
Pak lze formálně psát:
∏=
=
N
i
iiiiiN tdStdS
1
),(),(
kde Si je frakce kmenových buněk přežívající v době ti po i-té frakci ve srovnání s přežitím
před i-tou frakcí. Rovnici lze přepsat do tvaru:
∑=
−=−
N
i
iiiiiN tdStdS
1
),(ln),(ln
Jak jsme viděli, TDF lze rovněž psát jako součet:
∑=
=
N
i
iTDFTDF
1
kde
169.0538.1. === −
βγβγ
atdTDF iii
104
iiii TDFtdS .),(ln α=−
Protože rovnice pro přežití i TDF jsou identické svým tvarem i obsahem (popisují
poškození stejných kmenových buněk) a protože veličiny TDFi a TDFj jsou nezávislé pro
libovolnou kombinaci i a j, lze dojít k závěru, že v té oblasti, kde platí uvedené rovnice, bude
také platit:
kde α je nějaký parametr. Pro libovolnou frakci záření lze pak psát:
βγ
α −
−
= td
etdS ..
),(
Parametry γ a β mají dříve uvedené hodnoty. Rovnice popisuje přežití kmenových
buněk ozářených dávkou d v době t po tomto ozáření. Hodnota S(d,t) nezávisí na indexu i, což
nám dává možnost hledat vztah mezi přežitím ve tkáni a přežitím „in vitro“. Pro obecný
případ, kdy koeficienty NSD formule jsou ν a τ, dostaneme pro γ a β následující vztahy:
τν
γ
−−
=
1
1
γτ
τν
τ
β .
1
=
−−
=
Pro nádorovou tkáň tedy dostaneme γ=1.315 a β=0.
Dostáváme tedy rovnici pro přežití buněk ve tvaru:
γ
α d
edS .
)( −
=
který popisuje křivku přežití s ramenem a odpovídá docela dobře experimentálním výsledkům
(přinejmenším stejně jako lineárně kvadratická formule). Tuto křivku navrhnul Hugget pro
popis přežití buněk a ukázal, že parametry γ=1.48 a γ=1.36 odpovídají dobře okysličené a
anoxické kultuře buněk.
13.2.8. Popis přežití kmenových buněk tkáně
Z uvedeného se dá soudit, že reakci nádorové tkáně na
ozáření by bylo možné popsat opakovaným použitím stejné
křivky přežití (viz obr.179).
Výsledné přežití pak bude:
γ
α dN
N edS ..
)( −
=
Křivka přežití však může
silně záviset na
podmínkách ozařování a
také na fázi buněčného
cyklu (viz obr. 180). Proto
může být koeficient v
exponentu rovnice různý
pro různé typy nádorů (a reálně vzato může se měnit
v průběhu ozařování).
Obr.179. Křivka přežití (A) a
přežití ve tkáni (B) při frakcionovaném
ozařování. Obr. 180. Křivky přežití pro různé
fáze buněčného cyklu.
Pro zdravou tkáň máme složitější rovnici s časovou závislosti, která však nepopisuje
repopulaci buněk ve tkáni vhodným způsobem. Proto byly zkoušeny jiné způsoby popisu
zotavení tkáně v průběhu léčby zářením. Kmenové buňky se dělí exponenciálně – jako buňky
v kultuře – avšak toto dělení nastává s určitým zpožděním, které je způsobeno zpětnovazební
regulací tohoto dělení.
105
Pro terapii trvající T dnů bude počet kmenových buněk větší v poměru daném
vztahem:
).(
/ oTT
DT eSS −
= β
( )0
..
)( TTedS dN
NIT
−+= −
β
γ
α
kde SD by bylo přežití po aplikaci frakcionovaného ozařování bez repopulace. Jestliže
použijeme rovnici pro přežití a dosadíme repopulaci, dostáváme jednoduché formule pro
popis účinku záření na tkáň:
tato rovnice platí pro T>To, kde To je doba zpoždění repopulace. Pro zjednodušení můžeme
rovnici logaritmovat a zavést veličinu závislou na reakci tkáně (DFT):
).(. oo TTdNDFT −−= βγ
pro T<To nebo pro tkáně bez repopulace musíme časovou závislost vynechat a máme:
γ
dNDFT .=
Veličina DFT resp. DF byla použita pro analýzu dat u řady tkání. Na obr.181 vidíme závislost
DF=Nd
γ
na čase pro dvě úrovně reakce kůže krysy na ozáření (3 a 5). Je zřejmé, že po 20
dnech začíná repopulace a projevuje se lineárním nárůstem DF. Rovnice pro DFT tedy velmi
dobře popisuje tyto výsledky. Na vedlejším obrázku (obr. 182) vidíme stejná data
analyzována pomoci Cohenova modelu (přímkové závislosti).
Doba ozařování (dní)
Obr. 181. Závislost DF faktoru na
době ozařování pro dva stupně reakce
kůže krysy na ozařování Lineární
nárůst DF s časem potvrzuje správnost
výše uvedeného modelu .
O
o
br. 182. Závislost dávky na době
zařování podle Cohenova modelu.
Další reakce tkání, které byly analýzovány pomocí DFT modelu, jsou různé stupně
poškození střeva u myší, kde byla data publikována Withersem a myelitida rovněž u myší.
Experimentální výsledky pro myelitidu byly publikovány pracovníky Grayovy laboratoře
(Hornseyová). Na obr.183 vidíme závislost DF na čase pro tkáň tlustého střeva u myši.
Experimentální body odpovídají různému počtu přežívajících buněk na kryptu tlustého střeva
– od 10 buněk pro plné kolečka až po 100 buněk pro trojúhelníky. Na obr. 184 je
106
Strandqvistův graf pro myelopatii jako konečný efekt frakcionovaného ozařování míchy u
myší. V rovnici DF=Nd
γ
je γ=1.55 (plná čára v grafu).
13.2.9.
Obr.183. Závislost DF faktoru na
době ozařování tlustého střeva u myší.
Repopulace se projeví růstem hodnoty
DF.
Obr. 184. Závislost dávky na počtu frakcí
pro radiační myelitidu u myší.
Experimentální systémy sledování poškození tkání
Tkáně používané nejčastěji jako experimentální modely:
Kostní dřeň – metoda slezinných kolonií (Till a McCulloch, 1960) – injekce buněk kostní
dřeně po ozáření je vstřiknutá letálně ozářeným myším stejného imbredního kmene a na
slezině jsou pak po 2 týdnech spočítány mikrokolonie. Byly stanoveny parametry křivky
přežití: n=2.5, Do=105 Gy pro in vitro experimenty a n=1.5, Do=95 Gy pro in vivo ozáření.
Rozdíl je pravděpodobně způsoben přechodem buněk z Go fáze do buněčného cyklu během
doby do odebrání vzorku.
Přežití buněk ve střevních kryptách – Withers a Elkind (1970) – v kryptách dochází k dělení a
diferenciaci s rychlým obratem (4 dny), po ozáření dochází k obnově těch krypt, kde alespoň
jedna buňka zůstala schopná dělení. Přežití krypt má velká extrapolační čísla odpovídající
počtu buněk v kryptách: n= 100-400, Do = 1 Gy.
Kůže – Field, Withers zavedli počítání kolonií u kůže po větších dávkách záření. Vydělí se
ostrůvek kůže tak, že se ozáří velkou dávkou okolí (30 Gy). Pak lze hodnotit nodulární růst
buněk v ostrůvcích. Takto byly určeny parametry Do=1.35 Gy, n=12. n bylo spočteno z Dq
pro rozdělenou dávku.
Reakce dalších tkání na ozáření:
Cévy – zvýšená permeabilita, nekróza cévní stěny, pozdní změny - atrofie, teleangiektázie,.
Plíce – radiační pneumonitida (po 2-6 měsících) a postiradiační fibróza (po době nad 6
měsíců), prahová dávky je u obou postižení 8 Gy.
rofie, insuficience funkce.Ledviny – nefropatie, 11 Gy lokálně, hypot
Ovaria – radiosensitivní, sterilita po 3 Gy
Varle – přechodná sterilita již po 0,15 Gy, trvalá po 3 Gy
Oko – nejcitlivější čočka – katarakta 0,2 Gy, latence 6 měsíců, na zadní stěně se začne měnit
spořádání vláken čočky, které omezí průnik světla.u
13.2.10. Typy tkání
káně vT organismu se liší a rozlišujeme několik typů tkání:
1) Jednoduchá tranzitní populace – buňky vcházejí a se stejnou rychlostí odcházejí
spermatozo krvetvorby, kožní buňky)( a, červené krvinky a jiné buňky
2) Rozpadající se populace (oocyty)
3) Statická populace (neurony – je zde však pomalý úbytek)
107
4) Dělící se tranzitní populace – více buněk odchází než vchází a rozdíl odpovídá
dělení (diferencující a proliferující buňky krvetvorby – promyelocyty)
5) Zárodečná populace (stem cells) – dělí se a odcházejí (mizí, diferencují) – (každá
obnovující se populace musí mít prekursory tohoto typu – epiteliální tkáně )
6) Uzavřená dělící se populace – nádorový růst
Po ozáření tkáně se nemusí poškození hned projevit. Tak např. u jaterní tkáně dochází
k dělení pouze pří poškození (parciální hepatektomie). Je-li tkáň předtím ozářená, může dojít
k selhání obnovné funkce. Proto jsou z radiobiologického hlediska důležité tkáně, které se
obnovují, tj. obsahují frakci dělících se buněk. U těchto tkání vede ozáření k akutním reakcím.
Pozdní reakce pak nastávají u pomalu se obnovujících tkání.
U obnovujících se tkání může docházet k akceleraci dělení, tj. k repopulaci po určité
době, kdy kmenové buňky jsou odblokovány. Toto odblokování může být spojeno s
vymizením určité tranzitní populace, která měla danou kmenovou populaci jako prekursora a
regulovala její dělení. Snížení počtu dělících se kmenových buněk zářením má za následek
postupné snížení počtu ve všech následných kompartmentech v časovém intervalu
odpovídajícím obratu buněk v dané tkáni. Toto zpoždění reakce je pro určitou tkáň typické.
Z hlediska radiační terapie jsou důležité pozdní následky (poškození tkání). Toto
pozdní poškození závisí na způsobu frakcionace dávky a na ozařovaném objemu.
13.3. Radiační terapie
13.3.1. Komplikace po ozařování tkáně v radioterapii
V terapii se pro popis přežití v současné době nejčastěji používá buď exponenciální nebo
exponenciální formule s lineárně-kvadratickým exponentem:
2
.dd
eS βα −−
=do
eS α−
=
Pro přežití po N frakcích můžeme psát:
).exp( DS oN α−= )))//(1(.exp( βαα dDSN +−=
kde D je celková dávka a d je dávka na frakci při rovnoměrném ozařování. Tyto rovnice se
obvykle přepisují do tvaru (pro isoefekt lze použít libovolnou transformaci):
)).exp(.exp().exp(),( 0 DvNSvNvDNTCP k
oN
k
o α−−=−= −−
))))//(1(..exp(.exp().exp(),( βαα dDvNSvNvDNTCP k
oN
k
o +−−=−= −−
který popisuje sigmoidní závislosti (obr. 178) pravděpodobnosti vzniku komplikací (NTCP)
na dávce. No a k jsou parametry tkáně a ν=V/Vs je poměr ozařovaného objemu k nějakému
standardu Vs (je to korekce na velikost ozařovaného objemu). V literatuře se uvádějí
parametry této rovnice pro NTCP5% a 50%. Objemová závislost se někdy uvádí, někdy
nikoli. Často se uvádí pouze parametr αo=α.G, (vzhledem k nedostatku přesných údajů o
frakcinaci) čímž se rozumí:
))))//(1.(. βαααα dGo +==
Parametry 2G, K a N0 jsou uvedeny v tab. 6 pro celou řadu tkání.
108
Tab. 6. Radioterapeutické parametry poškození tkání (rovnice pro NTCP)
Xerostomia85.0100.1046Příušní žláza
Patologická fraktura393.9400.0975Hrudní koš
Těžká nekróza, stenózafistula241.8400.0732Konečník
Slepota80.6800.0732Sítnice
Slepota393.9400.0976Překřížení zrakových
Slepota393.9400.0976Optický nerv
Šedý zákal18.6700.1824Oční čočka
Nekróza1045.2300.1126Stehenní kost
Klinické poškození nervu1054.430.17360.0976Pažní pleteň
Klinické poškození nervu1045.2300.0976Cauda equine
Zánět štítné žlázy19.7600.0419j Štítná žláza
oint & mandible
Žaludeční vředy1118.770.76370.1151Žaludek
Zánět míchy90.680.12110.0714Mícha
Perforace tlustého střeva / fistula2172.961.33230.1464Tlusté střevo
Perforace tenkého střeva302.920.76170.1126Tenké střevo
Nekróza kůže
Telangiectasia
351.42
393.94
0.5867
0
0.0886
0.0976
Kůže
Pneumontida11.903.00070.0977Plíce
Selhání jater349.842.56430.1587Játra
Otok hrtanu19.6700.0418Hrtan
Nekróza chrupavky19147.401.17780.1291Hrtan
Symptomatický močový měchýř
contracture and volume loss
7007.992.92390.1171Močový měchýř
Zánět osrdečníku669.162.59110.1395Srdce
Klinická perforace jícnu2132.370.46810.1180Jícen
Chronický zánět ucha9391.3800.1464Uši
Akutní zánět ucha241.8400.1464Uši
Nekróza345.810.88150.0956Mozkový kmen
Nekróza235.361.33900.0975Mozek
Klinický zánět ledvin123.374.60910.0177Ledviny
Poškození orgánůN0kαGOrgán
109
13.3.2. Místní vyléčení nádoru (local control)
Závislost pravděpodobnosti vyléčení nádoru (TCP) na dávce
má sigmoidní tvar a lze ji charakterizovat dvěma parametry
(obr. 185): D50 dávkou pro 50% vyléčení a γ50, což je
poměr D50 a rozdílu dávek mezi 0% a 100% na
extrapolované přímce (červeně). Veličina γ50 je tedy úměrná
sklonu – čím je větší, tím je křivka strmější.
Obr. 185. TCP v závislsoti na
dávce záření.
Jestliže lze reakci nádorové tkáně na ozáření popsat
opakovaným použitím stejné křivky přežití, pak střední
počet nádorových buněk, které zůstaly v organismu po
ozářování bude:
N
oNo SNSNn 1.. ==
Jestliže pro likvidaci nádoru nesmí v organismu zbýt
ani jedna nádorová buňka, pak pravděpodobnost vyléčení
bude: ).exp()exp( 1
N
o SNnP −=−=
Pro popis přežití můžeme použít
různé typy rovnic; v současné době se
nejčastěji používá lineárně-kvadratická
rovnice; její dosazení dává:
))))//(1(.exp(.exp( βαα dDNP o +−−=
Obr.187. Závislosti TCP na dávce
ilustrující možné důvody rozšíření této
křivky při (a) nehomogenní populaci buněk
v nádoru (vlevo) nebo (b) nehomogenní
populaci pacientů. Rozšíření této závislosti
je nepříznivou okolností neboť ani při
hodně vysokých dávkách nedosáhneme
dostatečně vysoké pravděpodobnosti
vyléčení pacientů.
kde N je celkový počet frakcí, d je dávka
na frakci (předpokládá se, že dávky jsou
stejné) a No je počáteční počet nádorových
buněk. Závislosti P(D) se také často
označují TCP(D). Při léčbě nádorových
onemocnění zářením se zavádí pojem
„local control“, tj místní vyléčení nádoru.
Na obr. 186 vidíme jak pravděpodobnost
vyléčení (tumor control probability, TCP)
závisí na dávce.
Skutečné křivky se liší tím, že jsou
širší, což může být způsobeno přítomností
rezistentní frakce v nádorech nebo variabilitou populace (obr. 187).
Obr. 186. Teoretická závislost pravděpodobnosti
vyléčení nádoru na dávce při různé velikosti nádoru.
Křivka přežití (vpravo, dole) je popsaná buď LQ
(lineárně-kvadratickým) modelem nebo LPL
modelem.
110
13.3.3. Výpočet dávky záření při radioterapii
Různé druhy záření jsou různě pronikavé, což je
demonstrováno na obr.188. Pro roentgenovo
záření závisí jeho pronikavost na energii lampy
(tzv. ortovoltážní terapie jde více do hloubky než
povrchová). Ještě větší pronikavost má
supervoltážní terapie tvrdým X-zářením.
Dávka absorbovaná v různých hloubkách
se popisuje pomocí isodoz (obr. 189). Tyto křivky
popisují oblasti stejné dávky počínaje od 100% maximální
hodnoty. Výpočet se uskutečňuje
pomocí počítačů a bere v úvahu pokles se
čtvercem vzdálenosti od zdroje, exponenciální
absorbci ve tkáni a další faktory. Pacient je obvykle
ozařován několika ozařovacími poli nebo tzv. rotací,
kdy hlavice se zářičem rotuje kolem těla a svazek
míří stále na nádor. Rotace nemusí činit celých 360o
;
pokud je úhel menší, mluvíme o ozařování kyvem.
Ve všech těchto případech se výsledné isodozy
vytvoří složením jednotlivých směrů se započtením
nehomogenit v těle pacienta. Na obr. 190 vidíme
porovnání isodoz pro následující techniky ozařování:
ze 2 opačných polí, při rotaci, ze 3 polí, a rotací
s klínem.
Obr.188. Průběh hloubkové dávky p
různé druhy záření.
ro
13.3.4. 3D radioterapie a IMRT terapie
Obr.189. Isodozy – křivky o stejné dávce.
Vpravo je pole s klínem.
D
C
B
A
Obr. 190. Isodozy pro 4 různé
techniky ozařování pacientů.
A) dvě protilehlá pole, B) rotace o
360o
, C) ze tří polí a D) kyvem
s klíny. Výsledné isodozy by měly
pokrývat nádor dostatečně velkou
dávkou a do okolí by měl být spád
dávky dostatečně rychlý. Zejména
v oblasti kritických orgánů
(rektum nebo močový měchýř u
karcinomu prostaty) by měla být
dávka co nejmenší.
3D-CRT (3D-conformal radiotherapy) začíná CT tomografií, při které se snímá řada řezů
tělem pacienta a provede se rekonstrukce obrazu (obr. 191). V konečném obraze se zaznačí
nádor, a také citlivé tkáně, na které musí být dávka co nejnižší. Při plánování léčby se navrhne
celková léčebná strategie, tj posoudí se možnost chirurgického zákroku před nebo po
radioterapii, zváží se možnosti adjuvantní chemoterapie a další léčby. Navrhne se druh záření
(např. elektrony, X-záření, γ-záření), počet ozařovacích polí (event. ozařování rotací nebo
kyvem), pacient se označí tak, aby jej bylo možné reprodukovatelně nastavovat do svazku
záření. Počítačem se zpracují isodozy a porovnají se s polohou nádoru a citlivých struktur
pacienta.
111
Nejpokročilejší metodou radioterapie je tzv. IMRT (intensity modulated radiation
therapy). Ozařování je prováděno velkým počtem
svazků namířených na nádor z různých stran s
modulovanou intenzitou. Výsledkem je extrémní
přesnost a vysoká dávka v nádoru při šetření
zdravých tkání.
Přístup k šetření zdravých tkání prodělal
při svém vývoji několik etap:
1950: používala se čtvercová/obdélníková pole
1960: používaly se olověné bloky chránící citlivé
struktury
1990 – 2000: pole se tvarovalo, dané pole.
2001 – současnost: IMRT terapie – kontinuální
změna tvaru a profilu intensity při neustálém
fokusování svazku na nádor
IMRT terapie - využívá se proměnného
kolimátoru řízeného počítačem (obr. 192), který
upravuje tvar zářivého pole v každém okamžiku
tak, aby co nejlépe odpovídal tvaru nádoru.
Obr. 191. Série příčných řezů pořízených
pomocí CT se zakresleným nádorem a citlivými
orgány .
Při IMRT terapii se výrazně šetří citlivé struktury, neboť jsou stíněné při libovolném
nasměrování svazku (na obr. 193 žlutě). Dávkové distribuce u IMRT terapie jsou uvedeny na
obr. 194, 195 – standardní terapie vede k rozsáhlejšímu ozáření zdravých tkání.
Obr. 193. Ozařování pomocí IMRT. Pro každý
směr svazku máme optimální profil svazku.
Obr. 192. Kolimátor pro IMRT terapii
s měnitelným profilem pole.
Obr. 194. IMRT terapie z 9 polí (vlevo) a z 5
polí. Více polí vede k lepší distribuci dávky Obr. 195. Porovnání standardní 3D terapie a
IMRT terapie (vpravo).
112
13.3.5. Terapie neutrony
eutrony jsou částice bez náboje stejně těžké jako je proton.
znikají např. v jaderném reaktoru při štěpení uranu nebo také
a urychlovači při dopadu deuteronů na terčík, kdy může dojít k
ddělení neutronu od protonu. Neutrony také vznikají
nejrůznějších jaderných reakcích. Při průchodu hmotou ztrácejí
eutrony svou energii většinou v pružných a nepružných
rážkách, přičemž největší část energie ztratí při srážce se stejně
elikou částicí, tj protonem (jádrem vodíkového atomu). Energie
epřímo, prostřednictvím sekundárních
ak), podle jejich energie a
ižší a nižší orbity, až jsou
35 MeV) a rozpadne se.
ňk
ch ické
a pracovištích ve světě (viz. tab.7). Vzhledem
vysokým nákladům a nepříliš přesvědčivým úspěchům terapie piony ve srovnání
T, se současné době terapie piony nerozšiřuje.
13.3.7. Terapie protony
Ozařování protony má velkou výhodu v tom, že svazek lze velmi přesně vymezit a pacienta
lze ozařovat z mnoha různých směrů. To umožňuje dosáhnout velké dávky v určitém malém
objemu (několika cm3) a značného gradientu dávky v okolí. Takto se dá léčit řada pacientů,
kteří se nehodí pro léčbu γ-zářením:
1) izolované metastázy na mozku
2) AMD (senilní degenerace makuly) – věkem podmíněné onemocnění zraku (37%
ztrát zraku, 15% u osob nad 50 let), léčba laserem způsobuje sama poškození zraku – protony
jsou vysoce účinné
enigní nádory mozku)
N
V
n
o
v
n
s
v
je tedy předávána hmotě n
částic (odražených protonů, jader uhlíku, kyslíku apod). Toto
jsou poměrně těžké částice a hustě ionizují (mají vysoké LPE).
Neutrony mají tedy ve srovnání s X-zářením větší hodnotu LPE a
menší kyslíkový poměr, a proto jsou vhodnější pro rezistentní
nádory (např. s anoxickou komponentou) . Průběh hloubkových
dávek je u neutronů podobný jako u X-záření.
13.3.6. Terapie zápornými piony
Záporné mesony π mají z hlediska radioterapie výhodné vlastn
absorbované dávky v určité hloubce pod povrchem (Braggův pe
jednak jsou tyto částice zachytávány atomy, postupně klesají na n
nakonec pohlceny jádrem, které tímto získá velkou energii (1
Produkty těchto rozpadů mají dolet srovnatelný s rozměrem bu
Proto je kyslíkový poměr u pionů menší než u standardní
experimenty s piony byly prováděny na několik
Obr. 19
osti. Jednak je maximum
y a velmi hustě ionizují.
typů záření. Klin
k
s moderními metodami jako je IMR
Tab. 7. Laboratoře v nichž proběhly klinické experimenty na svazcích záporných mesonů π
6. Neutronový generátor
ve službách radioterapie.
3) meningiomy (b
4) nádory hltanu a hrtanu – značně přesnější rozložení dávky umožňuje více ozářit
nádor a méně zdravé tkáně v okolí
113
5) oční nádory u dětí (šetření byť malého kousku tkáně před ozářením je pro další
vývoj dítěte nesmírně důležité)
6) nádory prostaty – šetření rekta a močového měchýře může vést k recidivám
7) inoperabilní nádory plic v časných stádiích
Na obr. 197 je centrum protonové terapie na Loma Linda University v Kalifornii.
Obr. 197b. Plánování – analýza CTObr. 197a Plánování léčby - CT
Obr. 197c. Pohyblivý svazek protonů Obr. 197d. Boční fixní svazek
114
XIV. Účinek záření na organismy
14.1. Experimenty se zářením
Kromě léčebných účinků se brzo přišlo na to, že záření
může člověku velmi vážně ublížit. Sama Marie Curie na
svou práci se zářením doplatila. Již v roce 1920 pociťovala
silnou únavnost a závratě. V roce 1930 onemocněla
nevyléčitelnou anémií a 4 roky poté zemřela v horském
sanatoriu, kde byla léčená. Vzhledem k neviditelnosti
záření však mnozí dlouho nechápali jeho škodlivost nebo ji
brali na lehkou váhu.
V období studené války došlo k řadě případů
zneužití záření a to jak v Rusku, tak v USA. Dokumentuje
to zpráva D.O.E. „Human Radiation Experiments“. Tak
např. byl v průběhu 2 let podávána 829 ženám plutoniový
kokteil s komentářem typu – budete se cítit lépe. Fyzici mnohdy pracovali s nadšením bez
ohledu na své zdraví i zdraví jiných. Tak např. dr. Slotin zemřel po experimentování se dvěma
hemisférámi plutonia, které ručně posunoval k sobě dokud neucítil atomovou reakci (obr.
198). Když mu sjel šroubovák, reakce přešla v intenzívní záři a Slotin oddělil obě hemisféry
ručně od sebe. Zemřel po 9 dnech.
Obr. 198. Americký atomový fyzik
Slotin experimentující s plutoniem.
14.2. Deterministické účinky záření na organismus
Rozlišujeme deterministické účinky, pro které existuje práh, jež se týkají velkých dávek, u
nichž nastává rychlý nástup, a které mají relativně malý význam pro společnost a stochastické
účinky, kde se předpokládá bezprahovost, které nastávají po malých dávkách, dochází k nim
po dlouhé době po ozáření, a které mají velký význam pro společnost. Stochastické účinky
zahrnují zejména kancerogenní působení záření a genetické účinky (vliv záření na zárodečné
buňky a plod).
14.2.1. Citlivost různých organismů k záření
Účinek záření na tkáně lze vysvětlit přežitím kmenových buněk tkáně (určité reakci tkáně
odpovídá určitá hodnota přežití). Podobně účinek záření na úrovni organismu lze redukovat
na poškození určité tkáně, tedy opět na přežití buněk. Záření způsobuje u organismů akutní
nemoc z ozáření. U člověka rozlišujeme tři formy podle velikosti dávky a podle příznaků:
- dřeňová forma (poškození krvetvorby)
- gastrointestinální forma (poškození střevního epitelu)
- neurovaskulární forma (poškození cév mozku)
Citlivost jednotlivých organismů se hodnotí pomocí LD50 (Gy), tj dávky, při které zahyne
polovina jedinců:
Tab. 8. Hodnoty LD50 pro různé organismy [Gy]
Člověk 4-5 Gy Prase 3 Gy Králík 8 Gy
Pes 2,5-3 Gy Opice 4-5 Gy Kůň 6 Gy
Myš 5-10 Gy Kuřata 10 Gy Ryby 6 Gy
Potkan 7-10 Gy Krysy 20 Gy Želvy 150 Gy
Hmyz 100-1000 Gy Pšenice 50 Gy Rajčata 120 Gy
Houba 300-500 Gy Špenát 150 Gy Zelí 150 Gy
115
Pro srovnání
uvádíme také citlivost jednotlivých buněk k
záření:
Savčí buňky 1-2 Gy
Escherichia coli 100-200 Gy
Prvok 1000-3000 Gy
Micrococcus radiodurans 8000 Gy
Rozdíly v citlivosti se objasňují různě: různé
populace buněk jsou kritické a různě velké.
Zhruba platí, že fylogeneticky vyvinutější
organismy jsou citlivější. U Micrococcus je
rezistence způsobena mnoha kopiemi genomu na buňku a efektivní reparací poškození DNA.
Obr. 199. Citlivost různých bakterií
k ozáření. Micrococcus je nejodolnější.
14.2.2.Nemoc z ozáření u člověka
K nemoci z ozáření dochází u člověka pro dávky větší než 0,7 Gy. Nejcitlivější jsou krevní
buňky, dále střevní a nejvíce rezistentní se jeví nervové buňky, které se nemnoží.
Dřeňová forma: kostní dřeň – úbytek kmenových krvetvorných buněk, které jsou
velmi citlivé. Prahová dávky je zhruba 1 Gy, prodromální fáze nastupuje za 30 min – 48 hod,
dále pozorujeme latentní fázi 2 dny až 3 týdny načež přichází manifestní fáze. Dochází k
útlumu krvetvorby, cytopenii, nejvíce kostní dřeně je lokalizováno v páteři, dorzálních
oblastech žeber a pánve – ozáření těchto oblastí je kritické (lze v případě potřeby stínit).
Prodromální symptomy zahrnují zvracení, průjem. Při těžkém průjmu je
pravděpodobná smrt. Během prvních dnů dochází k prudkému poklesu lymfocytů, který je
dávkově závislý a může být použit jako indikátor dávky. Latence je dlouhá (obvykle několik
týdnů), pancytopenie způsobuje těžké infekce, pokles trombocytů způsobuje hemoragie
(krvácení). Symptomy tedy zahrnují vzestup infekčních komplikací, krvácení, anemii, špatné
hojení ran. Maximální pokles lymfocytů nastává 3. den. Podle počtu lymfocytů lze odhadnout
další vývoj nemoci z ozáření.
14.2.3. Léčba nemoci z ozáření
Léčba spočívá v:
prevenci infekcí a jejich léčbě;
podávání hemotologických růstových faktorů;
transplantaci kmenových buněk.
Prevence infekcí – izolace, antibiotika (i preventivně), acyklovir (x Herpes), riziko krvácení
při hluboké trombocytopenii lze redukovat transfúzí trombocytů.
Růstové faktory – podávají se u vyšších dávek, G-CSF nebo GM-CSF, co nejdříve po ozáření
a dlouhodobě (10-20 dní). Stimulují krvetvorbu – redukce neutropenie. Nežádoucí účinky –
bolesti kostí, hlavy, horečka.
Transplantace – nejlepší by byly autologní či syngenní kmenové buňky, ty jsou však obvykle
nedostupné. Po alogenní transplantaci dochází k reakci štěpu proti hostiteli a naopak.
Transplantace je vhodná pouze při dávkách 8-10 Gy v případě, že nejsou poškozeny další
tkáně.
Při současném poranění člověka radiace dále zhoršuje vyhlídky na uzdravení.
116
14.2.4. Gastrointestinální forma nemoci z ozáření (GIS)
Je letální, dávky jsou větší než u samotné dřeňové formy (epitel je rezistentnější, (>8 Gy).
Manifestace je rychlejší ve srovnání s dřeňovou formou (10min – 48 h), latentní fáze trvá 3-5
dnů a následuje manifestace onemocnění.
Podstatou této formy je úhyn kmenových buněk střevního epitelu denudace střevní
sliznice, eliminace funkční bariéry bránící vstupu mikrobů do těla a ztrátám tekutin. Nejvíce
je postiženo tenké střevo. Dochází ke zpomalení nebo zastavení obměny epitelu krypt.
Při lokálním ozáření dochází později ke vzniku atrofie, fibrotizace a vředů. Výsledek
závisí na dávce a jejím rozložení v čase.
Klinické projevy splývají s projevy dřeňového syndromu, neexistují specifické
projevy.
odpovídajíGIS. Při mikroskopickém vyšetření lze ve stolici nalézt tzv. zánětlivé buňky.
14.2.5. Neurovaskulární syndrom
Dochází k němu po expozici velmi vysokými dávkami – 30 Gy a více (vojenské operace,
nehody v jaderných zařízeních). Při výbuchu jaderné zbraně se lidé vystavení takto vysokým
dávkám nacházejí v zóně letální z hlediska tlakových a teplotních účinků.
Prodromální fáze nastupuje za několik minut, latence do 2 dnů nebo úplně chybí,
manifestní fáze provázená smrtí. Mechanismy souvisí s poškozením cév a CNS. Cévní složka
se manifestuje po 30Gy, CNS – po dávkách nad 100 Gy.
Typický je úbytek endoteliálních buněk – zvýšení propustnosti kapilár – únik plazmy
do intersticia – pokles krevního tlaku, edém, krvácení do mozku končící smrtí.
Poškození CNS – demyelinizace a perivaskulární edém, nekróza. V průběhu
manifestní fáze při dávkách nad 100 Gy se pozoruje zhoršování vědomí, následované
bezvědomím a smrtí.
14.3. Stochastické účinky záření na organismy
14.3.1. Radiační karcinogeneze
Zdroji informace jsou zde experimentální zvířata, experimenty s transformací buněk a ozářené
populace lidí (v uranových dolech, v domcích s radonem, po bombardování Hirošimy a
Nagasaki, po Černobylu, po dalších radiačních nehodách).
Zhoubné nádory jsou charakterizovány:
- transformaci buněk, které nereagují na kontrolní mechanismy regulující růst
- schopností invazivního růstu
- tvorbou metastáz
Vznik nádorů – uznávaná je tzv. klonální teorie, kdy nádor vzniká z jediné buňky, jež
změní své genetické vlastnosti tak, že má růstovou výhodu a vytvoří klon. V něm dojde k
další mutaci atd. tak, až se odblokují reakce na okolní kontrolní signály a dojde k
nekontrolovanému dělení.
Ve prospěch jednobuněčné teorie svědčí – podobnost nádorových buněk co se týče
enzymatické a genetické výbavy, přítomnost imunoglobulinů. V průběhu progrese nádoru
dochází ke vzniku dalších subklonů s odlišnou genetickou výbavou.
14.3.2. Radiační karcinogeneze u zvířat
Už v roce 1930 byla prokázána možnost indukce leukémie u myší zářením, v roce 1958
Upton publikoval dávkové závislosti indukce myeloidní a lymfoidní leukémie.
Obecnými zákonitostmi jsou: velká spontánní inicidence, dávkové závislosti strmé na
začátku pro malé dávky a poté se zakřivující, maximum podstatně menší než 100%. Dávkové
závislosti jsou určeny pro relativně vysoké dávky ve srovnání s potřebami radiační ochrany
(1-100 mSv). Nejnižší použité dávky jsou přibližně 400 mGy a výsledky nasvědčují lineární
117
závislosti pravděpodobnosti vzniku nádorů na dávce. Doba latence je u zvířat poměrně krátká
- jsou to měsíce až roky, u lidí 2-5 let pro leukémie a 35-40 let pro solidní tumory.
14.3.3. Epidemiologické studie
Výsledky epidemiologických studií jsou zpracovány ve zprávě UNSCEAR 2001. Závěr této
zprávy je takový, že objem dat se od poslední zprávy (UNSCEAR 1994) rozšířil, zejména
přibyly další případy úmrtí ve skupinách z Hirošimy a Nagasaki (odhad činí 421 dodatečných
úmrtím následky ozáření, 334 na solidní nádory, 87 na leukémii). Vyšší statistická přesnost
umožnila trochu upřesnit také závěry o závislostech dávka-účinek. Výsledky studií ukazují, že
data jsou konzistentní s lineárními (solidní nádory) nebo lineárně-kvadratickými (leukémie)
UZ(ED) závislostmi účinku záření na dávce, UZ(D) (na obr. 200,201). V poslední zprávě
UNSCEAR je také učiněn závěr, že epidemiologická data sama o sobě neumožní odpovědět
na otázku, zda existuje prahová dávka v UZ(D) závislosti; UZ(D) data pro leukémii jsou
konzistentní s existencí prahu v oblasti malých dávek záření.
Byl potvrzen závěr dřívější zprávy o účinku vnitřního ozáření dětí radioaktivním
jodem a vznikem rakoviny štítné žlázy (Černobyl). Odhad rizika je však komplikován
nedostatečně určenou dávkou. Také výsledky dalších studií z území bývalého Sovětského
svazu (Maják, řeka Teča) jsou nedostatečné pro upřesnění UZ(D) závislostí.
Celkové riziko vzniku solidního nádoru na 1 Sv činí 11% s chybou zhruba 2x (6-22%)
a 1% pro leukémie. Při snížení dávky na 0,1 Sv bude podle lineárně-kvadratického modelu
riziko vzniku leukémie 20x menší.
Obr. 200. Dávkové závislosti
incidence solidních nádorů u obyvatel
Hirošimy a Nagasaki. Pro malé dávky
je vidět, že experimentální data jsou
v souladu s lineární závislosti.
Obr. 201 Dávkové závislosti incidence
leukémií u obyvatel Hirošimy a Nagasaki.
Pro malé dávky je vidět, že experimentální
data odpovídají spíše lineárně-kvadratické
závislosti nebo závislosti s prahem do
zhruba 0.2 Sv.
Epidemiologické studie jsou pro radiační ochranu velmi cenné, avšak neumožňují stanovit
přesně riziko pro velmi nízké dávky záření (pod 20 cSv) vzhledem k vysoké spontánní
incidenci zhoubných onemocnění a nízké statistické spolehlivosti závěrů.
118
14.3.4. Radiační riziko a další rizika jímž je člověk vystaven
V tabulkách jsou uvedeny rizika, kterým je člověk v životě vystaven (počty úmrtí a zkrácení
života). Radiační riziko je nutno nastavit v tomto kontextu tak, aby bylo podstatně menší ve
srovnání s běžnými riziky.
Tab. 10. Počty úmrtí za rok na milión lidí
Tab.9. Odhad zkrácení života pro určitou profesi
Pro práci se zářením jsou stanoveny limitní dávky,
které nesmějí být překročeny. Mají za cíl vyloučení
deterministických účinků a omezení stochastických na nezbytné minimum. Práce musí být
plánována tak, aby její prospěšnost pro lidstvo převýšila možný negativní vliv na zdraví
pracovníka nebo obyvatelstvo. Při práci s ionizujícím zářením se řídíme následujícími limity.
Kardiovaskulární
choroby
4780
Rakovina 1700
Autonehody 220
Domácí úrazy 150
Zabití 100
Oheň 30
Utopení 30
Otrava 13
Radiace 9
Letecké nehody 8
Elektřina 6
Zabití bleskem 1
Kousnutí zvířetem nebo
hmyzem
1
Průmysl Zkrácení života (ve dnech)
Hornictví 328
Stavebnictví 302
Zemědělství 277
Radiační dávka 5cSv/rok 250
Přeprava/Služby 164
Státní služba 55
Tab. 11. Limity pro ozáření
V zaměstnání Mimo zaměstnání
Celé tělo 50 mSv/rok 1 mSv/rok
Kůže
Končetiny
Jiné orgány
500 mSv/rok N/A
Oční čočka 150 mSv/rok N/A
14.3.5. Výpočet dávek v radiační ochraně
Pro výpočet biologického účinku se zavádějí jednak radiační váhové faktory, které se liší pro
různé druhy záření, jednak tkáňové váhové faktory, které se liší pro různé tkáně. Faktorem se
násobí dávka jako fyzikálně změřená veličina a výsledná veličina se pak nazývá ekvivalentní
resp. efektivní dávka (tab. 12). Tyto dva postupy lze také kombinovat.
Tab.12. Radiační a tkáňové váhové faktory
Radiační váhové faktory pro stanovení ekvivalentní dávky
α-záření 20
β-záření 1
γ a X-paprsky 1
neutrony, termální, rychlé 2.5 (10-20)
těžké ionty >20
Tkáňové váhové faktory pro stanovení efektivní dávky
močový měchýř 0.05 pohlavní orgány 0.20
kost 0.01 játra 0.05
kostní dřeň 0.12 plíce 0.12
prso 0.05 kůže 0.01
tlusté střevo 0.12 žaludek 0.12
jícen 0.05 všechno ostatní 0.05
štítná žláza 0.05 celé tělo 1.00
119
XV. Žhavá témata současnosti v oblasti radiační biofyziky
15.1. Nové, principiálně důležité výsledky
15.1.1. Resonanční charakter přenosu energie ionizujícího záření na molekuly DNA
v oblasti malých energií sekundárních elektronů
Fyzikální procesy přenosu energie ve vodě nebo vodním roztoku DNA jsou poměrně
dobře prostudovány. Na základě znalosti účinný
navrženy počítačové programy založené na
Monte-Carlo metodě pro detailní výpočet
vzniku ionizací a excitací molekul ve vodě,
přenos energie na DNA jednak přímo a jednak
prostřednictvím radikálů a nakonec pro
výpočet poškození DNA (přehled v disertaci
Běgusová M., 1999). Tyto modely umožnily
vysvětlit závislosti vzniku zlomů DNA v
závislosti na struktuře DNA (na posloupnosti
nukleotidů), na její konformaci a event. na
přítomnosti proteinů v DNA molekule. Ve
zmíněných programech se procesy simulují do
určité energetické úrovně elektronů (např. 20
eV) a předpokládá se, že pod touto úrovní už
elektron nemůže s DNA interagovat tak, aby
způsobil vznik zlomu (pod prahem ionizace).
Tento předpoklad se však ukázal být
nesprávný. V řadě prací kanadské skupiny,
pod vedením L. Sanche, se dokazuje, že
energie elektronu potřebná pro indukci DNA
zlomu (SSB i DSB), může být podstatně
menší, než se doposud předpokládalo (2-20 eV). Tento jev spočívá v resonanční absorpci
elektronu molekulou DNA (obr. 202). Absorpce vede k nestabilnímu stavu molekuly, který
může s určitou pravděpodobností způsobit vznik zlomu. Autoři ukazují, že vzhledem
k početnosti sekundárních elektronů s energii 1-20 eV (5.10
ch průřezů pro různé fyzikální reakce byly
4
na MeV), může uvedený
mechanismus indukce zlomů DNA konkurovat známým procesům excitace, ionizace nebo
interakce molekuly DNA s radikály. Zajímavý je resonanční průběh závislosti indukce zlomů
DNA na energii elektronů, který je spojován se zachycením elektronu k molekule DNA.
Obr. 202 Resonanční záchyt elektronů na
molekule DNA a její poškození vznikem DSB (A),
SSB (B) a ztrátou spiralizace (C). Nejúčinnější
jsou elektrony s energií 10 eV.
120
15.1.2. Struktura genomu není náhodná
i“ nebo „terčíku“ pro účinek záření je znám už
přinejm
oloha chromosomů v jádře buňky
V několika pracích byly měřeny v jádrech buněk radiální vzdálenosti fluorescenčních
d středu jádra. Byly sestrojeny grafy distribucí těchto
Význam struktury „citlivé oblast
enším půl století. Je zřejmé, že ty genetické elementy, které mají k sobě blízko, mohou
zřejmě interagovat daleko častěji než vzdálené elementy. Dlouhou dobu se však předpokládalo,
že molekuly DNA (chromosomy) plavou v jádře buňky asi jako „nudle v polévce“ a celé jádro
si lidé představovali jako „sáček“ naplněný touto „nudlovou polévkou“. Zavedení FISH
techniky v 80-tých létech jasně ukázalo, že v jádře existují tzv. chromosomová teritoria, tj. že
jednotlivé chromosomy zaujímají prostor, který je podstatně menší ve srovnání s jádrem
buňky. Zároveň se však zjistilo, že polohy teritorií jsou velmi variabilní, a proto se nadále
předpokládalo, že jednotlivé lokusy jsou v jádře umístěny více či méně náhodně. Teprve přesná
měření ukázala význam geometrie jádra pro odhad účinků záření.
0 5 10 15 20 25 30
Membrane-to-domain[%]
0
10
20
30
40
Content of G-bands
Center-to-domain[%]
50
60
70
80
90
100
Lymphoblasts (Boyle et al., 2001)
Granulocytes
Go-lymphocytes
HT-29 cells
19 22
16
17 20
21
1
9
14
5
12
7
18
11
10
2
8
15
4
6
3
13
19
22
16
17
20
21
9
1
14
5
12
7
18
11
10
15
2
8
4
6
3
13
0 20 40 60 80
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
xav = 67.8±1.5
chromosome 8
lym
Center-to-domain distance [%]
0 20 40 60 80 100
Probabilitydensity[x10-2]
chromosome 3
lym
xav =72.2±1.3
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
chromosome 17
lym
romosome 19
lym
xav = 65.5±1.8xav =53.7±2.3
h vzdáleností na obsahu G pruhů pro G0-lymfocyty (černé trojúhelníky)
A B
Obr. 203 Umístění chromosomových teritorií v
jádře lidských buněk. (A) Radiální distribuce
čtyř chromosomových teritorií v trojrozměrně
fixovaných jádrech lidských G0-lymfocytů. Pro
každý chromosom jsou uvedeny průměrné
hodnoty a jejich standardní odchylky.
(B) Závislost trojrozměrných radiálníc
a HT-29 buňky (bíle kruhy). Pro porovnání jsou uvedeny výsledky na dvourozměrně fixovaných lymfoblastech
(černé body) a dřívější výsledky na dvourozměrně fixovaných granulocytech (bílé kruhy).
ch
P
středů chromosomových teritorií o
121
vzdáleností pro 22 chromosomů (obr. 203 A). Chromosomy 16, 19 a 22 byly nalezeny blízko u
středu jádra. Nejvíce na okraji byly umístěny chromosomy 3, 4, 8 a 18 (obr. 203 B).
Na grafech (obr. 203 B) je znázorněna závislost průměrné 3D vzdálenosti středů
chromosomových teritorií na obsahu G-pruhů u lidských G0-lymfocytů a u buněčné linie
HT-29. Pro porovnání jsou zde také uvedeny grafy, které vyjadřují závislost 2D vzdáleností
středů chromosomových teritorií od jaderné membrány u lidských granulocytů a lymfoblastů.
Poměr mezi obsahem R a G pruhů (R/G obsah) pravděpodobně ovlivňuje umístění
chromosomů. Vzdálenosti chromosomů od středu jádra v G0-lymfocytech, granulocytech,
HT-29 buňkách a lymfoblastech byly přibližně úměrné obsahu G pruhů. Některé rozdíly
v distribucích radiálních vzdáleností, které byly publikovány pro různé buněčné typy, mohou
být zapříčiněny zejména způsobem měření vzdáleností v jádře nebo normováním, které se
používá v různých laboratořích. Paralelní měření polohy jednotlivých chromosomů v G0lymfocytech
a buňkách HT-29 naznačuje, že by umístění většiny chromosomů v buněčném
jádře mohlo být podobné pro oba buněčné typy (obr. 203 B). Pouze v případě umístění
chromosomu 5 byl v těchto dvou buněčných typech nalezen rozdíl větší než 10 %R (R je
poloměr jádra buňky). V jádrech granulocytů se chromosom 16 nacházel mnohem blíže
k jaderné membráně, než tomu bylo u G0-lymfocytů a HT-29 buněk.
Jak vyplývá z výše popsaných zákonitostí, genetické elementy (geny, centromery,
chromosomy) se nacházejí přednostně v určité vzdálenosti od středu jádra, ve sférických
vrstvách, které se mohou zcela překrývat (např. pro geny ABL a BCR), nebo mohou být
vzájemně velmi vzdáleny (např. gen c-MYC a BCR). Uvnitř těchto vrstev je rozložení
elementů v převážné většině případů náhodné. Pro odhad pravděpodobnosti interakce po
ozáření dvou elementů je proto důležité zjistit hladiny (radiální vzdálenosti), na kterých se
nacházejí a prověřit, zda jsou v rámci dané hladiny jejich polohy náhodné. Pro elementy
náhodně se vyskytující uvnitř určité radiální vrstvy lze použít hustotu pravděpodobnosti
výskytu (viz obr. 203 A) normovanou na jednotku objemu (funkce ψ) pro výpočet
pravděpodobnosti interakce mezi oběma elementy. Příklad takového výpočtu je uveden pro
chromosomy 8, 9 a 22 na obr. 204. Pravděpodobnost vzájemné interakce pro chromosomy 9 a
22 se rovná R9,22=2.1, zatímco pro chromosomy 8 a 22 je uvedená pravděpodobnost R8,22=0.5.
Tyto rozdíly jsou způsobeny pouze odlišnou polohou odpovídajících vrstev jednotlivých
chromosomů.
122
Párování heterologních genetických elementů
Mezi genetickými elementy může docházet ke vzniku vázaných stavů, které se projevují
neúměrně vysokým počtem případů, kdy se heterologní genetické oblasti párují dohromady
(angl. tethering) v malé
prostorové vzdálenosti. Tento
efekt byl studován pro ABL a
BCR geny v lidských Tlymfocytech.
Výsledek experimentů
je uveden na obr. 204.
Pro Go-lymfocyty bylo
naměřeno podstatně více
případů, kdy geny ABL a BCR
jsou blízko (<0.5 µm), než by
se dalo čekat z teoretického
výpočtu založeného na Monte
Carlo simulaci (obr. 205). Pro
srovnání vidíme, že
u stimulovaných lymfocytů
experimentální údaje dobře
odpovídají teorii. Vzhledem
k tomu, že měření bylo
provedeno v 2D projekci, skutečný nárůst počtu vázaných stavů oproti případu, kdy jsou geny
blízko u sebe náhodně, je nutno vypočítat jako poměr ploch (A2-A1)/A3, což v našem případě
činí 7.3±1.5. Docházíme tedy k závěru, že pravděpodobnost interakce mezi chromosomy 9 a
22 by měla být alespoň 2.1x7.3, což je 15.3x větší v porovnání s náhodným rozdělením. Jak
bude uvedeno dále, experimentálním měřením bylo zjištěno, že uvedená hodnota je 11x větší,
což je v souladu s výše vypočítaným odhadem.
Frakční jaderný objem , ν
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Hustotapravděpodobnostiinterakce
0
2
4
6
8
10
ψ8
(ν)xψ22
(ν)
ψ9
(ν)xψ22
(ν)
Obr. 204 Závislost hustoty pravděpodobnosti interakce
mezi chromosomy 9 a 22 (8 a 22) na frakčním jaderném
objemu. Celková pravděpodobnost interakce se vypočte
jako integrál pod zobrazenou křivkou: červená plocha pro
chromosomy 9 a 22 (modrá plocha pro chromosomy 8 a
22). Pravděpodobnost interakce je normována na případ,
kdy se oba chromosomy nacházejí zcela náhodně v celém
objemu jádra (plocha pod čerchovanou přímkou se
rovná 1).
Otázka existence vázaných stavů je velmi důležitá, a proto byla zkoumána v dalších
experimentech při použití 3D fixace. Bylo zjištěno, že v ojedinělých případech lze najít vazbu
mezi genetickými elementy, která se projevuje atypickým úhlovým rozdělením (rozdělením
úhlů element-střed jádra-element), jež neodpovídá funkci sinus. V těchto případech se také
setkáváme s atypickým rozdělením vzájemných vzdáleností mezi genetickými elementy, kdy
je upřednostněna určitá vzdálenost.
123
Také pro 3D vzdálenosti mezi
geny ABL a BCR v Go-lymfocytech
byl nalezen posun k menším hodnotám
(obr. 205). Z hlediska vzniku CML je
však důležitá distribuce těchto
vzdáleností v kritické buněčné
populaci, tj. v buňkách CD34+
. Tyto buňky lze
separovat z kostní dřeně nebo z mobilizované
krve. Předběžné experimenty ukázaly, že
skutečně v buňkách CD34+
jsou vzdálenosti
mezi ABL a BCR menší, než by odpovídalo
radiálním distribucím.
Minimální vzdálenost ABL-BCR [µm]
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
Pravděpodobnost
0.00
0.01
0.02
0.03
Pravděpodobnost
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
a
Stimulované lymfocyty
b
Go-lymfocyty
0.0 0.3 0.7 1.0
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
A2
A3
2D
3D
A1
c
Obr. 205 Distribuce minimálních 2D
vzdáleností mezi geny ABL a BCR (ABm) ve
stimulovaných (a) a nestimulovaných (b)
lidských lymfocytech. Teoretická závislost
pravděpodobnosti na ABm (plná čára) byla
počítána pomocí modelu jak pro 2D projekce,
tak pro 3D vzdálenosti. Počáteční část
distribuce do 1 µm je znázorněna na obr. 205 c,
kde tmavě modrá oblast znázorňuje plochu pod
experimentální distribucí ABm pro hodnoty ABm
<0.5 µm (A2). Světle modrá oblast na obr.205 b
znázorňuje plochu pod teoretickou křivkou ve
2D (A1) a šrafovaná oblast ve 3D prostoru (A3).
Jak vidíme, počet jader Go-lymfocytů
s ABm<0.5 µm je podstatně vyšší (2x), než je
teoretická předpověď.
Obr. 206 Vazba (tethering) mezi geny RET a H4 u
buněk štítné žlázy. Geny RET a H4 jsou odděleny
poměrně velkou molekulární vzdáleností a v jádře
se nacházejí daleko od sebe (A). Ve 30% případů se
však RET a H4 nacházejí poblíž (B-D). Na obr. E je
mitóza, kde je vidět, že v kondenzovaném stavu jsou
oba geny také blízko u sebe.
124
Výměny vznikají tedy zejména tam, kde
jsou dané chromosomové oblasti blízko u sebe
buď v důsledku stejných radiálních distribucí,
nebo v důsledku vazby (tethering). Vazba mezi
určitými genetickými strukturami (tethering) již
dříve (Kozubek S. et al., 1997) pro c-MYC a
IGH lokusy (obr. 207). V dalších pracích byla
taková vazba prokázána pro geny ABL a BCR
v Go lymfocytech měřením 2D i 3D vzdáleností.
Na tyto naše výsledky navázali další
autoři, kteří sledovali geny RET a H4 v buňkách
štítné žlázy (Nikiforova et al., 2000) a prokázali,
že vznik nádorů štítné žlázy po Černobylu je
právě důsledkem RET/H4 aberace, a ta vzniká
proto, poněvadž existuje vazba mezi těmito geny
(obr. 206, 208). Prostorová blízkost dvou genetických
oblastí podstatně zvyšuje pravděpodobnost jejich
interakce po ozáření. Výrazně se to projevuje pro
hustě ionizující záření, kde výměnné aberace vznikají
mezi blízko se nacházejícími chromosomy. Pro takové
dvojice chromosomů (např. 9 a 22 nebo 14 a 18) nacházíme aberace také u často se
vyskytujících zhoubných onemocnění krvetvorby. To v menší míře platí také pro gamma
záření, kde formování aberací trvá delší dobu a vzájemně tak může interagovat více
chromosomových dvojic.
Obr. 207 Vazba mezi geny c-MYC a IGH byla
prokázána pro dva typy buněk . Na obrázku jsou
distribuce vzájemných vzdálenosti mezi oběma
geny (Kozubek S. et al., 1997).
Obr. 208 Vazba mezi geny RET a H4 byla
prokázána na základě podobného rozdělení
v práci Nikiforové
Prostorové uspořádání chromosomů a vazba genetických elementů mohou tedy
významně ovlivnit indukci genetických poškození zářením. Pro zhodnocení tohoto vlivu je
však nutný přesný výpočet.
125
15.1.3. Geometrie genomu v jádře se mění účinkem záření
Dalším zajímavým aspektem je kinetika vzájemného prostorového uspořádání
kritických genů po ozáření v jádře buňky. Vizualizace genetických struktur umožňuje
zkoumat také tuto otázku experimentálně. Byl studován vliv ionizujícího záření na změny ve
struktuře chromatinu vyššího řádu v interfázních jádrech buněčných linií ML-1 a U-937. 2D
vzdálenosti centromer 8, 9 a 17 a genu TP53 od těžiště jádra a vzdálenosti mezi homologními
signály byly měřeny v časových intervalech 2 h a 5 h po ozáření. Dvě hodiny po ozáření bylo
zjištěno zmenšení vzdáleností
signálů genetické oblasti od
těžiště jádra a zmenšení
vzdáleností mezi homologními
signály. V časo-vém intervalu 5
hodin po ozáření byl sledován
zpětný posun vzdáleností
signálů centromer 8, 9 a 17 a
genu TP53 od těžiště jádra a
vzdáleností mezi homologními
signály do původní pozice před
ozářením (tab.12). Posuny
vzdáleností pro centromery 8 a
9 v buňkách U-937 a jejich
návrat do původní pozice po
ozáření jsou uvedeny na
obr. 209.
0 1 2 3 4 5
90
93
96
99
102
105
0 1 2 3 4 5
VzdálenostNN(%)
87
90
93
96
99
102
0 1 2 3 4 5
65
67
69
71
73
75
0 1 2 3 4 5
VzdálenostCN(%)
62
64
66
68
70
72
Časový interval po ozáření [h]
Centromera 8
U-937
Centromera 9
U-937
Centromera 8
U-937
Centromera 9
U-937
Obr. 209 Zmenšení vzdáleností centromer 8 a 9 od těžiště jádra
(tmavě modrá) a zmenšení vzájemných vzdáleností
mezi homologními signály centromer 8 a 9 (červená) v buňkách
U-937 po ozáření.
0 50 100 150 200
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0 50 100 150 200
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
Centromere-to-centromere
distances
Centromere17
Gene-to-genedistances
TP53gene
Distancein%ofradiusDistancein%ofradius
Probability
Probability
Obr.210 Rozdělení vzdáleností mezi dvěma genetickými lokusy
(centromerami 17 a geny TP53) v jádrech buněk ML-1
v kontrole (červeně) a po ozáření dávkou 5 Gy (žlutě). Exp.
distribuce odpovídají teoretickým křivkám spočteným za
předpokladu náhodného rozložení genetických oblastí ve
sférické hladině.
Ozáření buněk tedy vede ke
změnám ve struktuře jádra
vyššího řádu. Homologní
genetické struktury se k sobě
přibližují, což bylo v literatuře
interpretováno jako důsledek
rekombinační reparace s využitím
druhé kopie genetického
materiálu jako templátu.
Ukázalo se, že pohyb
homologů k sobě je důsledkem
pohybu chromatinu směrem ke
středu jádra (zřejmě jako
následek rozvolnění chromatinu
126
při reparaci). Sférické hladiny pro jednotlivé struktury se tedy posouvají směrem ke středu
jádra. Rozložení genetických lokusů uvnitř sférických hladin však zůstává náhodné (obr.
210), což vyvrací výše uvedený mechanismus rekombinační reparace.
Tabulka 12. Topografické parametry odlišných genetických úseků v interfázních jádrech buněčných linií
ML-1 a U-937 určených po ozáření
Ozářené buňky
Genetický úsek
(buněčný typ)
Topografický
parametr
Kontrola [%]
2 h [%] 5h [%]
CN8
69.6 ± 0.7 64.4 ± 0.7* 69.3 ± 0.6
Centromera 8
(U-937) N N8 8
98.7 ± 1.2 90.4 ± 1.1* 97.4 ± 1.0
CN9
73.5 ± 1.2 66.6 ± 0.7* 73.5 ± 0.6
Centromera 9
(U-937)
99NN 101.1 ± 3.0 92.5 ± 1.7* 102.1 ± 1.7
CP 47.5 ± 0.6 43.1 ± 1.1* 45.5 ± 0.8
TP53
(ML-1) PP 66.4 ± 0.9 63.5 ± 1.6 65.4 ± 1.2
CN17
59.3 ± 0.8 55.6 ± 1.4* 63.2 ± 1.3
Centromera 17
(ML-1) N N17 17
84.5 ± 1.1 78.2 ± 1.7* 90.5 ± 1.6
CP - průměrná vzdálenost genu TP53 od těžiště jádra; PP - průměrná vzdálenost mezi dvěma
homologními geny TP53; CN8 - průměrná vzdálenost centromery 8 od těžiště jádra; N N8 8 - průměrná
vzdálenost mezi dvěma homologními centromerami 8; CN9 - průměrná vzdálenost centromery 9 od
těžiště jádra; N N9 9 průměrná vzdálenost mezi dvěma homologními centromerami 9; CN17 - průměrná
vzdálenost centromery 17 od těžiště jádra; N N17 17 - průměrná vzdálenost mezi dvěma homologními
centromerami 17 (vzdálenosti jsou uvedeny v % lokálního poloměru, R); *statisticky významné
rozdíly při p<0.05.
Pohyb genetické struktury v jádře po ozáření byl očekáván v souvislosti s reparačními
procesy, nebyl však znám charakter tohoto pohybu, jeho kinetika a způsob detekce. Změna
geometrie genomu po ozáření znamená, že event. další záření již působí na změněnou
strukturu, která může vykazovat odlišnou citlivost.
Pohyb chromatinu po ozáření – ať už je důsledkem reparačních procesů nebo jiných
mechanismů – může ovlivnit pravděpodobnost vzniku aberací a tím i zhoubných onemocnění.
Znamená podstatnou komplikaci při modelování účinků záření matematickými prostředky.
127
15.1.4 Genová exprese je indukována malými dávkami záření (první výsledky získané
metodou DNA-čipů)
Změny exprese genů jsou známy již více než deset let a za tuto dobu se podařilo
trochu nahlédnout do vzájemných vazeb mezi jednotlivými geny. Tak např. indukce TP53
způsobuje celou kaskádu indukce dalších genů, jako jsou GADD45, CDKN1A, MDM2,
BAX, MCL1, BCLX. Tyto geny se uplatňují při regulaci buněčného cyklu a u zhoubných
onemocnění nacházíme mutace v těchto genech. Kromě genů ovlivňujících buněčné přežití
N, MYC, HRAS apod., které nemají přímý
vliv na letální účinek záření. Uvedené
studie však byly provedeny užitím relativně
vysokých dávek záření. Použitím techniky
DNA-čipů u buněk ML-1, které jsou p53
pozitivní, byla zkoumána indukce genů
v oblasti dávek 2-50 cGy (Amundson).
Byla prokázána indukce celé řady genů,
včetně genů CDKN1A, GADD45, MDM2, ATF3 a BAX, které byly detailněji studovány
(obr. 211, 212). Indukce v oblasti nízkých dávek měla poněkud jinou kinetiku ve srovnání
s vysokými dávkami záření. Dávková závislost vykazovala v některých případech linearitu,
jindy konkávní závislost, někdy i s lokálním maximem v oblasti dávek kolem 0.5 Gy.
Současné pokroky v chápání molekulárních u
byly studovány také další geny, jako jsou FOS, JU
dálostí, které následují po ozáření buněk
a vedou
Obr. 211 DNA čipy (A). Na čipu je zeleně znázorněna
exprese genu rovná kontrolní hodnotě a červeně jsou
zobrazeny zářením indukované geny. Relativní indukce
dávkou 50 cGy pro různé geny je znázorněna dole (B).
Obr. 212 Dávkové závislosti indukce některých
genů po ozáření. Je vidět, že i dávky pod
10 cGy silně indukují expresi MDM2 a ATF3.
k poškození DNA, reparaci, apoptóze a zpoždění buněčného cyklu, mohou znamenat
nové cesty pro usměrnění účinků záření. Nabízejí se možnosti zvýšení citlivosti
k ionizujícímu záření - např. inaktivací genu RAS nebo jiných genů odpovědných za
128
rozpoznávání poškození DNA a jejich reparaci. Jestliže se při léčbě zhoubných nemocí
zářením uplatňuje apoptóza, lze uvažovat o její podpoře. Naopak, ve zdravé tkáni je nutno
apoptózu potlačit. Toho lze docílit např. blokováním některých genů, jako je např. růstový
faktor TGFβ. Podobně, zpoždění buněčného cyklu v G2-fázi lze eliminovat a tím rovněž
zvýšit citlivost buněk, zejména v liniích s mutovaným p53 proteinem, které ztratily kontrolu
přechodu G1/S (tzv. G1-checkpoint).
V této oblasti bylo zatím publikováno poměrně málo prací; oblast je však velmi
perspek
5.2. Nově objevené účinky záření
5.2.1 Záření poškozuje také přímo nezasažené buňky (bystander efekt)
považ
také pro transformaci buněk (Sawant et al., 2001).
tivní, zejména z hlediska pochopení mechanismů a možného ovlivnění účinků záření.
1
1
Dlouhou dobu se v radiobiologii
ovalo za platné tvrzení, že
genetické účinky záření vyžadují, aby
byla molekula DNA zasažena zářením
nebo radikálem, který záření vytvořilo.
V současné době se však již
nahromadily experimentální výsledky
v dostatečné míře na to, aby bylo
možné učinit závěr, že při ozáření
buněk částicemi jsou poškozeny také
ty buňky, které nejsou přímo zasaženy.
Tento jev se nazývá „bystander effect“
(BE) a lze jej nejlépe demonstrovat
v experimentech s α-zářením, kde se
ukazuje, že zářením jsou postiženy
také buňky, přes které neprošla částice.
BE byl pozorován pro různé
účinky záření: letální účinky,
chromosomové aberace, mutace,
genetickou nestabilitu a genovou expresi, a
Pro výzkum BE byl s výhodou použit mikrosvazek záření. Při ozáření 10% buněk ionty hélia
(8 částicemi) pozorovali autoři stejnou frekvenci transformovaných buněk jako při
rovnoměrném ozáření celé populace stejnou průměrnou fluencí (obr. 213). Spektrum mutací
pro BE buňky je jiné, nežli podobné spektrum pro přímo zasažené buňky (obr. 214). To
naznačuje, že také mechanismy mohou být v obou případech odlišné.
Obr. 213 Bystander efekt. Závislost počtu
transformovaných buněk na fluenci při ozáření 10%
buněk mikrosvazkem nebo při rovnoměrném ozáření
celé populace.
129
BE lze zkoumat v podstatě 3 metodami:
(i) ozáření buněk nízkými dávkami záření (tak,
aby velká část buněk nebyla přímo zasažena),
(ii) ozáření vybraných buněk mikrosvazkem a
(iii) působení na buňky médiem z ozářené
kultury. Zkoumání mechanismu BE ukázalo, že
pro vznik BE je důležitá komunikace mezi
buňkami – při použití látek, jež rozrušují
komunikační kanálky, dochází k vymizení BE.
Existují tedy přinejmenším dva typy přenosu
signálu pro BE – přes komunikační kanálky a
přes medium. Zdá se, že bylo vyjasněno, jaký je
vztah mezi BE a genetickou nestabilitou (GN).
V experimentech Lynga se ukázalo, že apoptóza
může být indukovaná nejenom mediem
z ozářených buněk, ale také médiem
z potomstva těchto ozářených buněk, ve kterých
docházelo ke GN. Znamená to, že mechanismus
BE je shodný s mechanismem GN a přenos
signálu pro BE mezi buňkami je shodný
s přenosem signálu do dalších generací jednou
ozářené buňky.
BE znamená, že riziko odhadnuté na
základě extrapolace z oblastí vysokých dávek
směrem k velmi nízkým dávkám může být
velmi podhodnoceno. Pro záření s nízkým LET,
BE nejvíce přispívá k účinkům záření při velmi
nízkých dávkách (pod 0.1 Gy), pro vysoké LET
nelze závislost na dávce definovat, protože už
průchod jediné částic vyvolává plný efekt. Byly
učiněny odhady BE pro plícní buňky ozářené
inhalací dceřiných produktů radonu. Autoři
došli k závěru, že poměr mezi frekvencemi indukovaných zhoubných onemocnění plic pro
obyvatele domů se zvýšenou koncentrací radonu (nízké dávky) a horníky z uranových dolů
(vysoké dávky), který činí 2.4-4, odpovídá téměř nulovému BE, tj. minimálnímu počtu buněk
v okolí každé buňky zasažené α-částicí. Skutečnost, že se BE u nádorů plic vzniklých při
inhalaci radonu neuplatňuje, lze možná přičíst na vrub tomu, že při prolongovaném ozařování
částicemi s vysokým LET se ionizující záření uplatňuje jako iniciační i jako promoční faktor.
Obr. 214 Spektrum mutací v exonech
HPRT genu se liší pro bystander buňky
(B) a přímo zasažené buňky(C). Spektrum
pro spontánní mutace je na obrázku (A) a
liší se od obou předchozích spekter. To
naznačuje, že také mechanismy mohou být
odlišné.
130
„Bystander efekt“ byl potvrzen v mnoha pracích, mechanismus není znám;
předpokládá se přenos reaktivních kyslíkových nebo dusíkových radikálů. BE souvisí s GN a
možná má stejnou příčinu. BE má velký význam z praktického hlediska, neboť vede
k nelinearitě závislostí na dávce a v důsledku BE mohou být současné odhady radiačního
rizika podceněny.
15.2.2. Nelinearita křivky přežití v oblasti velmi malých dávek záření a adaptivní reakce
buňky na ozáření
V posledním desetiletí byly vyvinuty přesné metody měření klonogenního přežití buněk
po ozáření v oblasti velmi nízkých dávek záření. Jednotlivé buňky jsou po ozáření rozděleny
do vhodných komůrek nebo do gelu a poté je sledována každá buňka zvlášť. Takto se
zpracuje dostatečně velký počet bu
přežití. V poslední době se začaly
používat také počítačem řízené
mikroskopy, umožňující opakované
snímání a porovnávání obrazu
v potřebných intervalech po
ozáření. Příklad křivky přežití
získané těmito moderními
prostředky je uveden na obr. 215.
Pro X-záření je na křivce přežití
patrná oblast zvýšené citlivosti
(hypersensitivity, HS) pro dávky
zhruba do 0.2 Gy. HS byla
naměřena pro řadu buněčných
typů). Úsilí o vyjasnění
mechanismu HS v oblasti malých
dávek záření vedlo ke snahám
modifikovat křivku přežití použitím
různých druhů záření, použitím
chemických modifikátorů (zejména
inhibitorů reparačních enzymů) a
přítomností mezibuněčných
kontaktů (ozařování v mikrokoloniích).
Výsledky ukázaly, že látky, které ovlivňují reparaci (např. 3-aminobenzamid), mohou
zmenšit nárůst rezistence v oblasti 0.2-1 Gy. Autoři tyto výsledky interpretují tak, že nárůst
rezistence na křivce přežití (viz obr. 215) je způsoben indukcí reparace (nikoli hypersensitivní
subpopulací buněk). To by vysvětlovalo také dlouhou dobu známý jev adaptivní reakce buňky
něk tak, aby bylo možné statisticky vyhodnotit jejich
Obr.215 Křivka přežití v oblasti velmi nízkých dávek záření
pro X-záření. Pro dávky pod 20 cGy je patrná oblast
hypersesintivity.
131
na ozáření, při kterém buňky vykazovaly snížený cytogenetický účinek záření po předběžném
ozáření malou dávkou. Tento jev se rovněž interpretuje jako indukce reparačního
mechanismu.
Z hlediska radioterapie je zajímavé zjištění, že při frakcionovaném ozařování
s intervalem 8 h, docházelo k opakování HS oblasti na křivce přežití a aplikace 3x0,4 Gy za
den bylo účinnější než aplikace 1,2 Gy denně po dobu 5 dnů. Byl zkoumán také vztah HS
k BE tím, že byly srovnávány buněčné linie s výrazným/nevýrazným BE a
výraznou/nevýraznou HS. Bylo zjištěno, že buňky s výrazným BE nevykazovaly HS, a
naopak. Možné vysvětlení je, že signál indukovaný v buňkách při velmi malých dávkách, jenž
vede k letálnímu efektu (HS), zůstane uvnitř buňky, a proto je tak účinný. Jestliže jej buňka
propustí ven, její citlivost se zmenší, ale poškodí se buňky v okolí.
Hypersensitivita v oblasti malých dávek záření znamená silnou nelinearitu na křivce
přežití a následně může znamenat také nelinearitu jiných účinek záření, jako je transformace,
mutageneze, GN apod. To se dá očekávat zejména s ohledem na předpokládaný mechanismus
HS, kterým je indukce reparačních procesů.
15.2.3. Vznik chromosomových aberací po ozáření neodpovídá molekulárním hmotnostem
chromosomů
Značná pozornost byla věnována vztahu mezi strukturou chromatinu vyššího řádu
a vznikem aberací. Byly provedeny experimenty na lymfocytech ozářených neutrony a
γ-zářením. V těchto experimentech byly sledovány výměnné aberace ve velkých skupinách
chromosomů. Paralelně byly hledány strukturální charakteristiky, které by korelovaly s
četností výměnných aberací.
Indukce výměnných aberací hustě ionizujícím zářením
Bylo prokázáno, že výměnné aberace v lymfocytech ozářených rychlými neutrony
vznikají s velmi vysokou frekvencí jen mezi specifickými chromosomy. Detekce výměnných
aberací mezi 10 vybranými chromosomy lidských lymfocytů ozařovaných třemi dávkami
rychlých neutronů s průměrnou energií 7MeV byla prováděna pomocí opakované duální FISH
techniky. Při každé hybridizaci byly hodnoceny rozdílné páry chromosomů. Definované
pozice metafázních chromosomů byly uloženy na hard disk a automaticky nahrávány po
každé ze šesti úspěšných rehybridizací. Touto cestou bylo získáno šest rozdílných obrazů
stejných metafázních chromosomů. Srovnávání těchto obrazů umožnilo identifikovat výměny
pro chromosomy HSA 1, 2, 3, 4, 8, 9, 12, 14, 18 a 22. Frekvence těchto výměn nevykazovala
žádnou korelaci s molekulární hmotností interagujících chromosomů. Nejvýznamnější byly
výměnné aberace mezi chromosomy HSA 14/18, 9/22, 14/8, 18/8, 8/3, 1/14, 1/8, 3/8, a 3/14.
Tyto výsledky jasně ukazují, že výměnné aberace postihují stejné chromosomy, které
podléhají translokacím u často se vyskytujících forem lymfomů a leukémií. Vysoká frekvence
132
výměnných aberací souvisí s prostorovou blízkostí chromosomů v jádře. To je pravděpodobně
jeden z hlavních důvodů vzniku specifických translokací vedoucích k maligní transformaci
buněk.
Tabulka 13. Počet výměn mezi páry chromosomů ve vybrané skupině (N ) a počet těchto
výměn počítaných podle modelu lineární úměrnosti (N ) pro vybrané dvojice
chromosomů
ij
10
ij
10,th
0.5 Gy 1 Gy 1.5 GyDvojice
Chromosomů
N ij
10
N ij
10,th
p N ij
10
N ij
10,th
p N ij
10
N ij
10,th
P
1/8 4 0.43 <10-4
6 1.01 <10-4
9 2.01 <10-4
1/14 2 0.34 <10-2
4 0.69 <10-3
11 1.58 <10-6
3/8 2 0.35 <10-2
2 0.82 - 12 1.62 <10-6
3/14 1 0.25 - 4 0.58 <10-3
5 1.15 <10-3
3/18 1 0.19 - 1 0.45 - 4 0.89 <10-2
4/12 1 0.29 - 1 0.69 - 6 1.38 <10-3
8/14 2 0.18 <10-2
5 0.42 <10-5
8 0.84 <10-6
8/18 1 0.14 - 2 0.33 <10-2
7 0.65 <10-6
9/22 0 0.11 - 4 0.24 <10-4
6 0.55 <10-6
14/18 5 0.11 <10-6
5 0.25 <10-6
16 0.51 <10-6
p - statistická významnost rozdílů.
Byly porovnány frekvence indukovaných aberací zjištěné experimentálně (při
opakovaných hybridizacích metafázních buněk lidských lymfocytů ozářených neutrony)
s hodnotami vypočtenými podle lineárního modelu (modelu, ve kterém se předpokládá
proporcionalita mezi molekulární hmotností a pravděpodobností indukce aberace). Po ozáření
dávkou 1.5 Gy byl pozorován pro HSA 8, 14, 18 a 22 mnohem větší počet výměnných
aberací, než je teoretická předpověď počítaná podle molekulární hmotnosti chromosomů.
Také po ozáření menší dávkou neutronů byl pozorován větší počet aberací pro chromosomy
HSA 14 a 22, než je teoretická předpověď. Statisticky významné nebyly rozdíly mezi
teoretickou a experimentální hodnotou výměnných aberací pro chromosomy HSA 8 a 18 po
ozáření menší dávkou neutronů.
Nejvýznamnější výsledky jsou shrnuty v tab. 13. Nejvyšší frekvence výměnných
aberací byla pozorována pro chromosomy HSA 14 a 18 po dávce 1.5 Gy (f14,18=0.036±0.009).
133
Teoretická předpověď pro tyto chromosomy činí (f14,18
th
=0.0012). Po dávce 1.5 Gy je
frekvence výměnných aberací pro další páry chromosomů, jež jsou uvedeny v tabulce 13 (1/8,
1/14, 3/8, 3/14, 3/18, 4/12, 8/14, 8/18, 9/22), rovněž významně vyšší. Vzhledem k nízkému
počtu pozorovaných aberací nebylo možné prokázat statistickou významnost frekvence
výměn pro dvojice chromosomů 3/8, 3/18 a 4/12. Na druhé straně jsme, v rozporu
s očekáváním, nepozorovali žádné výměnné aberace mezi některými většími chromosomy
(např. 3/4, 3/2, 4/2).
Indukce výměnných aberací řídce ionizujícím zářením
Výsledky, podobné jako v předchozí kapitole, byly získány pro γ-záření. Sada
zkoumaných chromosomů zahrnovala 11 chromosomů (HSA 1, 2-4, 7-11, 21 a 22);
opakovaná hybridizace byla prováděna podobným způsobem jako v předchozích
experimentech (obr. 216). Závěry z této práce potvrdily v zásadě předchozí výsledky. Bylo
zjištěno, že nejvíce výměnných aberací vzniká pro ty dvojice chromosomů, které nacházíme
často translokované u zhoubných onemocnění krvetvorby. Tak např. zvýšený počet výměn
byl nalezen u HSA 3 a 21, HSA 4 a 11, HSA 22 a 9, HSA 22 a 21. Translokace t(3;21)
nacházíme u CML, t(4;11) u pre-B-ALL nebo ALL, t(22;9) u CML a ALL a t(22;21) u
Ewingova sarcomu. Na rozdíl od neutronů nebyl však vliv struktury na vznik výměnných
aberací u řídce ionizujícího záření tak výrazný - četnosti vzniku aberací byly mnohem blíže k
očekáváním, jež jsme vypočítali podle hmotnosti jednotlivých chromosomů. Tento jev lze
přičíst na vrub odlišnému prostorovému rozložení zlomů vyvolaných řídce a hustě ionizujícím
zářením. Při průchodu sekundární částice odražené neutrony rozhraním mezi dvěma
chromosomy mohou s poměrně velkou pravděpodobností vzniknout zlomy na obou teritoriích
a vzápětí interagovat za vzniku výměnné aberace. V případě řídce ionizujícího záření jsou
zlomy rozloženy v prostoru náhodně a musí čekat mnohem delší dobu na svého "partnera",
aby mohlo k interakci dojít.
134
Obr. 216. Opakovaná hybridizace téže mitózy lidského lymfocytu ozářeného dávkou 3Gy γ-záření. Lze pozorovat
dicentrickou aberaci mezi chromosomem 2 a 3 (2.a 3. hybridizace); translokaci mezi chromosomem 7 a
neidentifikovaným chromosomem.
FISH technika je velmi vhodným prostředkem pro studium vzniku aberací po ozáření.
Ukazuje, že některé dvojice chromosomů mohou tvořit výměnné aberace s vyšší četností, než
se dá čekat z jejich molekulární hmotnosti. Jsou to právě ty dvojice, jež se často vyskytují
také u zhoubných onemocnění.
15.3. Příspěvek nových výsledků k řešení starých problémů
15.3.1. Genetická nestabilita - příčina nebo průvodní jev zhoubných
nádorových onemocnění?
Genetická nestabilita genomu (GN) je dlouho diskutovaným jevem, kterému mnozí
autoři přikládají velký význam v onkogenezi. Proto se tímto jevem budeme blíže zabývat.
Normální buňka má k dispozici systém pro udržení stability, tj. pro zajištění přesné
duplikace genetického materiálu a jeho rozdělení do dceřiných buněk. Tento systém zahrnuje
několik set genů. U zhoubných onemocnění se pozorují změny v primární struktuře genomu;
obvykle tím více, čím agresivnější je nádor. Často se pozoruje tzv. aneuploidie, tj. odlišný
počet chromosomů. Tyto skutečnosti odpovídají "teorii somatických mutací", jež byla
navržena německým embryologem Boverim již v roce 1914. GN může být způsobena defekty
v celé řadě genů. Tyto defekty můžeme pozorovat např. jako chromosomové aberace.
135
Vznik zhoubných onemocnění lze popsat na základě GN zhruba takto: 1) Dojde k
iniciaci v jedné buňce, která se částečně vymkne růstové kontrole a stane se geneticky
nestabilní. 2) V expandující populaci buněk dochází ke genetickým změnám, které jsou
většinou eliminovány (vzhledem k metabolickým nevýhodám, které znamená vyřazení
určitých genů), avšak s určitou frekvencí mohou vzniknout mutace s dodatečnou výhodou pro
růst a šíření nádorové populace. 3) Proběhne postupná, evoluční selekce klonů buněk, které
jsou více a více abnormální jak geneticky, tak biologicky, až nakonec nádor svého hostitele
usmrtí. GN zvyšuje přizpůsobivost buněk a vysvětluje tak celou řadu jevů, jako je invaze
maligních buněk do cizí tkáně, adaptace novým podmínkám v této tkáni, vytváření si
krevního zásobení v nádoru, klamání imunitního systému apod. GN vysvětluje také
mnohotvárnost nádorových onemocnění a vznik rezistence k chemoterapii.
Ionizující záření indukuje genetickou nestabilitu (přehled viz Morgan 1996), a to jak
záření s nízkým lineárním přenosem energie (LPE), tak s vysokým LPE (α-částice). GN se
pozoruje po několik generacích od ozáření, kdy se fixuje poškození tzv. mutatorového genu.
Zastánci mechanismu radiační onkogeneze, který je založený na GN, tedy předpokládají, že
onkogeneze spočívá v indukci mutace (v mutatorovém genu), která vede k mutačnímu
fenotypu buňky (Hall 2001). To vysvětluje také vysokou četnost indukce transformovaných
buněk po ozáření, která je daleko vyšší, než by odpovídalo četnosti indukce mutace v jednom
lokusu jako iniciační události.
Teorie GN, jako základní fenomén onkogeneze, má však svá slabá místa, zejména při
vysvětlení iniciace zhoubného onemocnění. U řady zhoubných onemocnění je v současné
době známa genetická změna, která je příčinou vzniku nádoru a může se často vyskytovat u
pacienta jako jediná genetická změna - např. translokace genů ABL/BCR u chronické
myeloidní leukémie (CML). To je silným argumentem ve prospěch tvrzení, že iniciační
událost zde musela být specifickou genetickou změnou. Podpůrná fáze (angl. promotion) pak
nevyžadovala další změny genomu. U CML se také vyvíjí GN v průběhu onemocnění a
vznikají sekundární aberace, ale tento proces je poměrně pomalý (několik let). Logickým
vysvětlením je tedy to, že prvotní genetická změna je příčinou GN. Jestliže by byla GN
prvotní, dalo by se čekat, že v maligní populaci buněk budou přítomny další genetické změny
- ať už mající pozitivní efekt z hlediska proliferace nebo indiferentní. Jak se zdá, toto
pozorování je v rozporu s teorii radiační onkogeneze jako důsledku GN. Kromě toho byly
translokace ABL/BCR nalezeny v buňkách bezprostředně po ozáření (Ito et a., 1995).
V poslední době byla GN pozorována také v buňkách jako důsledek BE (Seymour
and Mothersill, 1997, Watson et al., 2000, viz také kapitola o BE). Jako příčinu BE i GN se
nejčastěji zmiňují reaktivní kyslíkové nebo dusíkové radikály (přesněji „reactive oxygen or
nitrogen species“).
GN je mnoha autory považována za prvotní příčinu zhoubných onemocnění, a to jak
po ozáření, tak obecně. Zdá se však, že tento závěr nemusí být - vzhledem k uniformitě
maligních klonů v některých případech - pravdivý. Spíše se nabízí vysvětlení, že iniciace je
událost ve specifickém lokusu, což ovšem nevylučuje celou řadu takových událostí v ozářené
populaci, které se však neuplatní. In vitro vzniká zřejmě GN ve velké části populace
porušením některého z genů mutatorového typu.
136
15.3.2. Individuální radiosensitivita
Existuje několik studií, ze kterých lze usuzovat na možnost stanovení individuální
sensitivity k ozáření. To by samozřejmě mělo význam pro radiační ochranu.
Bylo zjištěno, že citlivost chromosomů k indukci aberací je větší pro řadu případů
osob, u kterých je také zvýšená pravděpodobnost onkogeneze; kromě toho mohou mít vyšší
výskyt aberací v periferní krvi také pacienti se solidními nádory. Navržený mechanismus
spočívá v poškození kritických genů (např. genů odpovědných za reparaci). Problémem zde
zůstává otázka rozptylu měření – např. pro pacienty se zhoubným onemocněním je střední
hodnota výskytu aberací podstatně vyšší než u zdravé populace, nicméně rozptyl je tak velký,
že u konkrétního člověka nelze říci, ke které skupině patří. Zkoumání tohoto rozptylu pro
metodu počítání mikrojader a počítání aberací v metafázi ukázalo, že intraindividuální
variabilita (opakované měření u stejného člověka) je podobná jako interindividuální (měření u
různých jedinců). Bylo proto doporučeno činit závěry až po opakovaném stanovení těchto
veličin u téhož člověka. Individuální radiosensitivita by se mohla stát důležitým vodítkem
pro výběr zaměstnanců pro práci se zářením. Je však nutné dopracovat metody detekce
sensitivních jedinců.
15.3.4. Biologická dosimetrie
Za relativně nejlepší metodu pro biologickou dosimetrii je považována metoda
analýzy dicentriků užitím fluorescenčního +Giemsa barvení (FPG) tak, aby se detekovaly
pouze první mitózy. Mnoho pokusů bylo učiněno s FISH technikou (fluorescenční in situ
hybridizace), která umožňuje detekovat translokace (viz obr.16), tj. aberace, které jsou daleko
stabilnější než dicentriky, a to by FISH techniku předurčovalo k detekci ozáření v minulosti.
Bohužel, výsledky epidemiologických studií ukázaly na řadu problémů, spojených s takový
měřením (např. možnost vzniku a pomnožení klonů nesoucích aberaci, které mohou vést
k nesprávným odhadům, viz obr. 217).
Moderní, vysoce průchodné technologie umožňující screening exprese velkého počtu
genů vedly k návrhu nového systému pro biologickou dosimetrii – cílem bylo definovat
systém genů, podle jejichž exprese by se stanovila dávka (celotělová) a doba ozáření. Autoři
zjistili, že nejsilnější byla odpověď genu DDB2, který kóduje p48 podjednotku XPE proteinu
odpovědného za UV sensitivitu. Indukce DDB2 a CDKN1A je lineární s dávkou v rozsahu
0,2-2 Gy při měření 24 a 48 h po ozáření. Naopak pro 72 h vykazovaly dávkové závislosti
silné nelinearity s lokálním maximem kolem 0.5 Gy.
137
Biologická dosimetrie
je obohacena
dalšími technikami; jejich
použití však není
standardizováno a má
řadu úskalí. Proto je
využití těchto technik
v praxi zatím velmi
omezeno.
Obr. 217 Poměr mezi počtem dicentriků určených standardní metodou biologické dosimetrie a počtem
translokací detekovaných delší dobu po ozáření v závislosti na dávce záření pro osoby ozářené při radiační
nehodě. Je zřejmé, že obě metody si příliš neodpovídají.
15.3.5. Pravděpodobný mechanismus (radiační) onkogeneze
Vznik zhoubných onemocnění (onkogeneze) je vícestupňový proces, který se
uskutečňuje na buněčné úrovni a jehož základem je změna DNA kódu (genetická změna).
Jednotlivý stupeň představuje: (i) změnu uvnitř jednotlivé buňky a (ii) následný vznik klonu
změněných buněk, který je terčem pro další stupeň procesu. Nelze vyloučit, že některé stupně
onkogeneze jsou však způsobeny změnou exprese genu(ů) bez genetické změny (tzv.
epigenetický mechanismus onkogeneze). Jednotlivé stupně onkogeneze nejsou přesně známy;
naše znalosti se však v poslední době enormně rozšířily a jejich objem narůstá doslova
každým dnem.
Jednou z etap, která významně přispěla k pochopení onkogeneze, bylo období
identifikace onkogenů a tumor-supresorových genů (viz např. Rabbitts 1994). Mechanismus
působení onkogenů může být různý: mohou přispívat ke vstupu buněk do buněčného cyklu,
inhibovat apoptósu (programovanu buněčnou smrt) nebo měnit povrchové vlastnosti buněk a
přispívat tak ke vzniku metastáz. Tumor-supresorové geny naopak blokují cestu ke vzniku
zhoubných onemocnění, např. tím, že navodí apoptózu buňky při vážném poškození genomu.
Ukázalo se, že aktivace onkogenu nebo inaktivace tumor-supresorového genu může vést ke
vzniku zhoubného nádoru. Tyto změny jsou následkem poškození genomu, které lze
v některých případech pozorovat cytogenetickými metodami, zejména jako delece,
138
translokace nebo inverse. Delece je typickým příkladem genetické změny, která může vést
k vyřazení tumor-supresorového genu z funkce. Naopak translokace a inverse se uplatňují při
aktivaci onkogenů. Aktivace se uskutečňuje tak, že daný onkogen (nebo jeho část) se
v důsledku genetické změny ocitne v blízkosti jiných genetických elementů, ať už na stejném
nebo jiném chromosomu, které způsobují jeho intenzívní expresi. Existuje celá řada příkladů:
aktivace c-MYC genu u Burkittova lymfomu přenesením do blízkosti IGH genu (IGH je
intenzívně transkribován, neboť zabezpečuje imunitní odpověď buněk); c-ABL gen se
aktivuje u CML po t(9;22) translokaci; BCL2 gen se rovněž aktivuje přenesením do blízkosti
IGH atd.
Je zřejmé, že vícestupňový charakter onkogeneze souvisí právě s překonáním
vícenásobných bariér, kterými se organismus jistí proti jejímu vzniku. Poškození tumorsupresorových
genů nebo aktivace onkogenů jsou v tomto procesu nejdůležitější. Nepřímým
potvrzením hypotézy o rozhodující roli genetických poškození při vzniku zhoubných
onemocnění je korelace mezi mutageny a kancerogeny. Rozsáhlými testy bylo ověřeno, že
látky, které působí mutagenně, tj. poškozují DNA buněk, jsou také účinnými kancerogeny a
naopak. Onkogeneze zahrnuje kromě genetických změn také pomnožení jednotlivých
buněčných populací, které v důsledku genetických změn mohou měnit své vlastnosti (rychlost
dělení, povrchové vlastnosti, způsob růstu apod). Jednou z nejdůležitějších změn, které jsou
pozorovány, je genetická nestabilita nádorových populací. Dochází v nich s vysokou četností
k dalším genetickým změnám, které již nevyžadují působení kancerogenů. Z toho plyne, že
řada vnějších faktorů může ovlivnit tyto procesy.
Klasicky se rozlišují následující fáze onkogeneze: iniciace, podpůrná fáze a progrese.
Pojmy iniciace a podpůrná fáze byly zavedeny na základě výsledků experimentů, ve kterých
působení jednoho agens (např. záření) bylo nedostatečné při určitých dávkách pro vyvolání
nádoru, zatímco v kombinaci s dalším agens (které samostatně nádor nevyvolávalo) vedlo k
měřitelné úrovni onkogeneze. Synergické působení záření jako iniciačního agens a
specifického promočního činidla bylo zjištěno pro řadu různých buněčných systémů a tkání.
Další výzkumy však ukázaly, že některá promoční činidla také vyvolávají poškození DNA,
zejména prostřednictvím indukce volných radikálů, a také chromosomové aberace. Zdá se
tedy, že procesy iniciace a podpůrná fáze nelze vždy přesně oddělit, a že celý proces
onkogeneze je tím více spojen s kumulací poškození DNA. Tomu odpovídá také skutečnost,
že záření a také některé chemické kancerogeny jsou účinné také v jedné dávce, jestliže je
dostatečně vysoká nebo při opakované aplikaci, a mohou tedy "zastoupit" promoční činidlo.
Na druhé straně, iniciace vždy nestačí na vyvolání zhoubného onemocnění, neboť existují
139
látky, které mohou potlačit maligní fenotyp buňky, která je geneticky již změněná (např.
retinová kyselina u akutní promyelocytické leukémie).
Pod pojmem progrese se obvykle myslí nabytí agresivity (malignity) u již existujícího
nádoru v důsledku genetické nestability; mezní formou progrese je konverze benigního
charakteru nádoru na maligní. O záření je známo, že může přispět k progresi nádoru (urychlit
jeho vývoj). Uvedené dělení vývojových stupňů onkogeneze nemá obecnou platnost a přesné
vymezení. Jednotlivé fáze nelze přiřadit všem druhům zhoubných nádorů.
Málo je známo o úloze tzv epigenetických faktorů v onkogenezi. Těmito faktory se
někdy mylně rozumí vlivy prostředí (dieta, životní styl, stresy apod). V odborné literatuře se
pod pojmem epigenetické faktory rozumí vymezené jevy, ve kterých je exprese genů
ovlivněna dědičně jinak než změnou genomu. Je to (i) metylace DNA, (ii) acytylace histonů,
(iii) struktura chromatinu a (iv) lokální kontrola exprese genů. Tyto faktory spolu souvisí a
víme, že metylace DNA (deacetylace histonů, kondenzace chromatinu) vede k inaktivaci genů
uvnitř změněné oblasti a může vést také k vyřazení tumor-supresorového genu z činnosti a
přispět tak ke vzniku zhoubného onemocnění. Charakter metylace genomu se může přenášet
z buňky do jejího potomstva při dělení, což umožňuje vznik klonu. Nakupení epigenetických
změn s časem se tak jeví možným mechanismem evoluce nádoru. Vzhledem k argumentaci
uvedené výše je však zřejmé, že základní příčinou vzniku nádorů je (alespoň v drtivé většině
případů) genetická změna, tj aktivace onkogenů nebo inaktivace tumor-supresorových genů.
Epigenetické faktory mohou přispět nejspíše ve stádiu podpůrné fáze a progrese.
Období hledání jednotlivých onkogenů a postupné zkoumání mechanismů jejich
působení se však stalo minulostí, lze říci minulým stoletím. Biologická revoluce postoupila
nevídaným tempem kupředu.
15.4. Perspektivy dalšího výzkumu - technologie nového tisíciletí
S nástupem nového století (a také tisíciletí) bychom očekávali další důležitou etapu; ta
skutečně přišla a s nečekaným rozmachem. Bylo dokončeno sekvenování lidského genomu
(určení posloupnosti nukleotidů ve všech chromosomech). Byly stanoveny sekvence
prakticky všech genů a už v průběhu sekvenace bylo možné dosažené výsledky využít pro
hledání nových onkogenů (s překvapením bylo zjištěno, že celkový počet genů je pouze 30-
40, 000).
Význam znalosti primární struktury všech genů se však vynořil teprve v okamžiku,
kdy přišla na scénu robotika na mikroskopické úrovni, která otevřela cestu k výzkumu
140
velkého počtu molekul současně. Vznik technologie DNA-čipů nebo „DNA-microarrays“
umožňuje na malém prostoru zkoumat prakticky současně všechny lidské geny, jejich
varianty, jejich poškození a funkci. V kostce řečeno, funkce genomu v konkrétní buněčné
populaci se touto metodou dá přenést na jedno sklíčko. V čem spočívá metoda DNA-čipů?
Populárně vysvětleno se DNA sekvence mnoha genů nanesou na jedno sklíčko do matice
např. 100x100 bodů, v každém bodě je nanesena robotem DNA pouze jednoho genu. Taková
sklíčka (DNA čipy) se pak prodávají, takže si je laboratoře mohou koupit. Z buněk se dá
izolovat látka, která po nanesení na sklíčko způsobí barevnou reakci v místě každé tečky, a to
tím silnější, čím více je exprimovaný (používaný) gen, jehož DNA v daném bodě je.
Vyhodnocení sklíčka se provádí skenerem v automatickém režimu a výsledkem je obrovské
množství údajů o buňce. Tento soubor může být v určitém smyslu vyčerpávající (úplný) a
tvoří tedy profil buňky nebo tkáně ("signature"). Uvedené úspěchy společně s rozvojem
proteomiky a bioinformatiky jsou velmi nadějné. Rozbíhají se nové projekty, jako je např.
„Cancer Genome Anatomy Project“, které si kladou za cíl identifikovat molekulární podstatu
různých zhoubných onemocnění.
Další velmi důležitou technologií jsou vizualizační techniky optické mikroskopie,
které rovněž prodělávají prudký vývoj. Ještě jsme nestačili zužitkovat výhody „standardní“
konfokální mikroskopie, když se objevují nečekané cesty ke zvýšení rozlišení pod optickou
mez (0.2-0.3 µm), jako je dvoufotonová mikroskopie, spektrální mikroskopie nebo
mikroskopie založená na stojaté vlně. Kromě toho, zvyšování výkonu výpočetní techniky
vedlo k vývoji nových digitálních přístupů v optické mikroskopii. Na rozdíl od elektronové
mikroskopie má optická mikroskopie řadu výhod. Kromě relativně nízké pořizovací ceny je to
zejména snadná manipulace s biologickým objektem. Bouřlivý vývoj zaznamenaly metody
přípravy biologických vzorků pro pozorování. Pro ilustraci uvedeme tzv. FISH techniku, která
umožňuje zviditelnit v jádře buňky jednotlivé geny a chromosomy při prostorovém zachování
struktury jádra. V současnosti existují technologie umožňující pozorovat strukturální detaily
in vivo - v živé buňce.
Co se dá očekávat v oblasti onkologie? Kromě identifikace poškození genů je očividně
důležité vědět, jak tato poškození buňku ovlivňují, tj. které geny se v důsledku poškození
„zapínají“ a které „vypínají“. Poznání těchto následných změn by nám pak mohlo umožnit
identifikaci místa vhodného pro ovlivnění procesu onkogeneze – navržení léčby. První
výsledky ukazují, že změny funkce genů v nádorech jsou velmi široké, tj. velký počet genů
mění svou expresi. Tak např. u akutní promyelocytické leukémie vzniká v důsledku
translokace PML/RARα genů a následně působením tzv. fúzního proteinu dochází k aktivaci
141
genů chromosomu X (Xq28 band), 16 (16q24.1-3), a naopak utlumení genů na q-ramínku
chromosomu 22, v okolí centromery chromosomu 17 a na chromosomu 19 (19p13.3-
19p13.2). Seznam konkrétních genů je velmi dlouhý. DNA-čipy umožní dále sledovat
kinetiku těchto změn a jejich ovlivnění léčebnými prostředky. Mechanismy interakce
jednotlivých proteinů jsou předmětem proteomiky. Vizualizační techniky pak mohou přispět
vyjasněním prostorových vztahů mezi interagujícími molekulami, které jsou důležité z toho
důvodu, že reakce v jádře buňky silně závisí na prostorovém uspořádání.
142
XVI Další literatura
Amundson S.A., Do K.T., Fornace A.J 1999, Induction of stress genes by low doses of gamma rays. Radiat.Res.
152, p.225-231.
Bauchinger M., Schmid E., and Braselman H. 2001, Time-course of translocation and dicentric frequencies in a
radiation accident case. . Int. J. Radiat. Biol. 77, 553- 557.
Bauchinger M., Schmid E., Zitzelsbereger H., Braselman H., and Nahrstedt U. 1993 Radiation-induced
chromosome aberrations analysed by two-colour fluorescence in situ hybridization with composite whole
chromosome-specific DNA probes and a pancentromeric DNA probe. Nomenclatures. Int. J. Radiat. Biol.
64, 179-184.
Bártová E., Kozubek S., Kozubek M., et al. (2000a). The influence of the cell cycle, differentiation and
irradiation on the nuclear location of the abl, bcr and c-myc genes in human leukemic cells. Leukemia
Research 24: 233-241.
Bártová, E., Kozubek, S., Jirsová, P., Kozubek, M., Lukášová, E., Skalníková, M., Cafourková, A., Koutná, I.,
Paseková, R. (2001) Higher-order chromatin structure of human granulocytes. Chromosoma, 110, 360-
370.
Běgusová M. DNA radiolysis. Experimental study and theoretical modelling of the effects of DNA structure and
ligands. PhD thesis, Université d’Orléans, 1999.
Beninson D., Lloyd D.C., Natarajan A.T., Obe G., Preston R.J., and Sasaki M.,1986, Biological Dosimetry:
Chromosomal Aberration Analysis for Dose Assessment. Technical Reports Series no. 260, IAEA,
Vienna.
Boudaiffa B., Cloutier P., Hunting D., Huels M.A. and Sanche L. 2000 Resonant formation of DNA strand
breaks by extremely low energy electrons. Science 287, p.1658-1660.
Boudaiffa B., Hunting D. Cloutier P., Huels M.A. Sanche L. Induction of single and double strand breaks in
plasmid DNA by 100 to 1500 eV electrons. Int.J.Radiat.Biol. 76, p.1209-1221, 2000b.
Boveri TH. , 1914 Zur Frage der Entstehung maligner Tumoren, Jena, Germany.
Boyle S., Gilchrist S., Bridger J.M., et al. (2001). The spatial organization of human chromosomes within the
nuclei of normal and emerin-mutant cells. Hum. Mol. Genet. 10, 211-219.
Cafourková A., Lukášová E., Kozubek S., et al. (2001). Eschange aberrations induced with gamma-rays among
11 chromosomes of human lymphocytes. Int.J.Radiat.Biol., 77, 419-429.
Cheng K.C., Lawrence A.L. 1993 Genomic instability and tumor progression: Mechnistic considerations.
Adv.Cancer.Research 60, p.121-156.
Curtis SB., Luebeck EG, Hazelton WS, Moolgavkar SH. 2001, The role of promotion in carcinogenesis from
protracted high-LET exposure. Physica Medica 17, p.157-160.
el Deiry W.S., Tokino T., Velculescu V.E., Levy D.B., Parsons R., Trent J.M., Lin D., Mercer W.E., Kinzler
K.W., and Vogelstein B.,1993, WAF1, a potential mediator of p53 tumour suppression. Cell 75, 817-825.
Hollander M.C., Alamo I., Jackman J., McBride O.W., and Fornace A.J. Jr., 1993, Sequence conservation and
DNA damage-responsiveness of the mammalian gadd45 gene. J. Biol. Chem., 268, 24385-24393.
Ikushima T., 1987, Chromosomal responses to ionising radiation reminiscent of an adaptive response in cultured
Chinese hamster cells. Mutation Research , 180, 215-221.
Ito T. 1995, Induction of BCR-ABL fusion genes by in vivo X-irradiation. Jpn.J.Cancer Res. 84, p.105-110.
Jirsová P., Bártová E., Kozubek S., Kozubek M., Lukášová E., Cafourková A., Koutná I., Skalníková M. Nuclear
distribution of the centromeric heterochromatin and the p53 gene of human leukemic cell lines after
irradiation. Radiation Research, 155, 311-319, 2001
Kastan M.B., Zhan Q., el-Deiry W.S., Carrier F., Jacks T., Walsh W.V., Plunkett B.S., Vogelstein B.,and
Fornace A.J. Jr., 1992, A mammalian cell cycle checkpoint utilizing p53 and GADD45 is defective in
ataxia telangiectasia. Cell 71, 587-597.
143
Kellerer A.M. and H. H. Rossi, A generalized formulation of dual radiation action. Radiat. Res. 75, 471–488
(1978).
Kozubek S., Lukášová E., Rýznar L., et al. (1997) Distribution of ABL and BCR genes in cell nuclei of normal
and irradiated lymphocytes. Blood 89: 4537-4545.
Kozubek S., Lukášová E., Rýznar L., et al. (1999a) The topological organization of chromosomes 9 and 22 in
cell nuclei has a determinative role in the induction of t(9,22) translocations and in the pathogenesis of
t(9,22) leukemias. Chromosoma 108: 426-435.
Kozubek S., Lukášová E., Jirsová P., et al. (2002) 3D Structure of the human genome: Order in randomness.
Chromosoma (in press).
Lambin P., Marples B., Ferth B., Malaise E.P., Joiner M.C. 1993, Low dose radiation response of human tumour
cell lines of different intrinsic radiosensitivity. In B.R. Paliwal, T.J. Kinsella and J.F. Fowler (eds),
Prediction of Response in Radiotherapy: Radiosensitivity and Repopulation (New York: Institute of
Physics), pp. 311-319.
Little MP, Wakeford R. 2001 Dec. The bystander effect in C3H 10T cells and radon-induced lung cancer: Radiat
Res; 156(6):695-9.
Lucas J.N., Awa A., Straume T., Poggensee M., Kodama Y., Nakano M., Ohtaki K., Weier D., Pinkel and
Littlefield G., 1992 Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionising
radiation. Int. J. Radiat. Biol. 62, 53-63.
Lukášová E., Kozubek S., Kozubek M., et al. (1999). Chromosomes participating in translocations typical of
malignant haemoblastosis are also involved in exchange aberrations induced by fast neutrons. Radiat.
Res. 151, p.375-384.
Lyng FM., Seymour CB. and Mothersill C Initiation of apoptosis in cells exposed to medium from the progeny
of irradiated cells: A possible mechanism for bystander-induced genomic instability? Radiat.Res., 157,
p.365-370, 2002
Marples B. and Joiner M.C. 1993, The response of Chinese hamster V79 cells to low radiation doses: evidence
of enhanced sensitivity of the whole cell population. Radiation Research, 133, 41-51.
Marples B. and Joiner M.C. 1995, The elimination of lowdose hypersensitivity in V79-379A cells by pretreatment
with X-rays or hydrogen peroxide. Radiation Research, 141, 160-169.
Marples B., Joiner M.C. Modifiaction of survival by DNA repair modifiers: a probable explanation for the
phenomenon of increased radioresistance. Int.J.Radiat.Biol. 76, p.305-312, 2000
Marples B., Lambin P., Skov K., and Joiner M.C., 1997, Low dose hyper-sensitivity and increased
radioresistance in mammalian cells. International Journal of Radiation Biology, 71, 721-735.
Miyashita T., Krajewski S., Krajewska M., Wang H.G., Lin H.K., Liebermann D.A., Hoffman B., and Reed J.C.,
1994, Tumor suppresor p53 is a regulator of bcl-2 and bax gene expression in vitro and in vivo. Oncogene
9, 1799-1805.
Morgan W.F. et al., 1996 Genomic instagility induced by ionizing radiation. Radiat.Res. 146, p.247-258.
Mothersill C., Seymour C.B. and Joiner M.C. 2002 Relationship between radiation-induced low-dose
hypersensitivity and the bystander effect. Radiat.Res. 157, p.526-532.
Muckerheide J. Low level radiation health effects: Compiling the data. Radiation, Science, and Health, Inc.,
http://cnts.wpi.edu/rsh/data_docs/execsum98.html.
Natarajan A.T., Santos S.J., Darroudi F., Hadjidikova V., Vermeulen S., ChatterjeeS., Berg M.V.D., Grigorova
M., Sakomoto-Hojo E.T., and Curado M.P. 1998, 137
Cs-induced chromosome aberrations analyzed by
fluorescence in situ hybrization: eight years follow up of the Goiania radiation accident victims. Mutat.
Res. 400, 299-312.
Nikiforova M.N., Stringer J.R., Blough R., et al. (2000). Proximity of chromosomal loci that participate in
radiation-induced rearrangements in human cells. Science 290: 138-142.
Nowell P.C. 1976 The clonal evolution of tumor cell populations. Science 194, p.23-28,
144
Olivieri G., Bodycote J., and Wolff S. 1984, Adaptive response of human lymphocytes to low concentrations of
radioactive thymidine. Science, 223, 594-597.
Parshad R., Price F.M., Bohr V.A., Cowans K.H., Zujeweski J.A., and Sanford K.K. 1996, Deficient DNA repair
capacity, a predisposing factor in a breast cancer. Br. J. Cancer 74, 1-5.
Pawliuk, R. Eaves C. and R. K. Humphries, Evidence of both ontogeny and transplant dose-regulated expansion
of hematopoietic stem cells in vivo. Blood 88, 2852–2858 (1996).
Podesta, M. Piaggio, G., Frassoni, F., Pitto, A, Zikos, P., Sessarego, M. Abate, M., Teresa, V.L., Berisso G. and
A. Bacigalupo, The assessment of the hematopoietic reservoir after immunosuppressive therapy or bone
marrow transplantation in severe aplastic anemia. Blood 91, 1959–1965 (1998).
Prased A.V., Mohan N., Chandrasekar B., and Meltz M.L., 1995, Induction of transcription of „immediate early
genes“ by low-dose ionizing radiation. Radiation Research, 143, 263-272.
Pressl S., Romm H., Ganguly B.B., Stephan G., 2000, Experience with FISH-detected translocations as an
indicator in retrospective dose reconstruction . Radiat. Prot. Dosim. 88, 45-49.
Prise K.M., Belyakov O.V., Folkard M., and Michael B.D., 1998, Studies of bystander effects in human
fibroblasts using a charged particle microbeam. Int. J.Rradiat. Biol. 74, 793-798.
Radivoyevitch T. and D. G. Hoel, Biologically-based risk estimation for radiation-induced chronic myeloid
leukemia. Radiat. Environ. Biophys. 39, 153–159 (2000).
Radivoyevitch T., Kozubek S., Sachs R.K., (2001). Biologically based risk estimation for radiation-induced
CML. Inferences from BCR and ABL geometric distributions. Radiat. Environ Biophys. 40, 1-9.
Radivoyevitch T., Kozubek S., Sachs R.K., (2002). The Risk of Chronic Myeloid Leukemia: Can the DoseResponse
Curve be U-Shaped? Radiat. Res. 157: 106-109.
Roberts, A.W., DeLuca, E., Begley, C.G., Basser, R., Grigg A.P. and D. Metcalf, Broad inter-individual
variations in circulating progenitor cell numbers induced by granulocyte colony-stimulating factor
therapy. Stem Cells 13, 512–516 (1995).
Roberts S.A., Spreadborough A.R., Bulman B., Barber J.B.P., Evans D.G.R. and Scott D. 1999, Heritability of
cellular radiosensitivity: A marker of low-penetrance predisposition genes in a breast cancer? Am. J.Hum.
Genet. 65, 784-794.
Samson L. and Schwartz L.J. 1980, Evidence for an adaptive DNA repair pathway in CHO cells and human skin
fibroblasts cell lines. Nature (London), 287, 861-863.
Sawant SG, Randers-Pehrson G, Geard CR, Brenner DJ, Hall EJ. 2001 Mar. The bystander effect in radiation
oncogenesis: I. Transformation in C3H 10T1/2 cells in vitro can be initiated in the unirradiated neighbors
of irradiated cells. Radiat Res; 155 (3):397-401.
Scott D., Barber J.B.P., Spreadborough A.R., Burill W., and Roberts S.A., 1999, Increased chromosomal
radiosensitivity in breast cancer patients: A comparison of two assays. . Int. J. Radiat. Biol. 75, 1-10.
Selleri, C., Maciejewski, J.P., De Rosa, G., Raiola, A. Risitano, A.M. Picardi, M., Pezzullo, L. Luciano, L., Ricci
P. and B. Rotoli, Longlasting decrease of marrow and circulating long-term culture initiating cells after
allogeneic bone marrow transplant. Bone Marrow Transplant. 23, 1029–1037 (1999).
Selvakumaran M., Lin H.-K., Miyashita T., Wang H.G., Krajewski S., Reed J.C., Hoffman B., and Liebermann
D.A., 1994, Immediate early upregulation of bax expression by p53 but not TGFβ1: A paradigm for
distinct apoptic pathways. Oncogene, 9, 1791-1798.
Seymour C.B., and Mothersil C., 2000, Relative contribution of bystander and targeted cell killingto the lowdose
region of the radiation dose-responsse curve. Radiat. Res. 153, 508-511.
Shadley J.D. 1994, Chromosomal adaptive response in human lymphocytes . Radiation Research, 138, S9-12.
Short S.C., Kelly J., Mayes C.R., Woodcock M., and Joiner M.C., 2001, Low-dose hypersensitivity after
fractionated low-dose irradiation in vitro. Int. J. radiat. Biol., 77, 655-664.
Singh B., Arrand J.E., Joiner M.C. 1994, Hypersensitive response of normal human lung epithelial cells at low
radiation doses. International Journal of Radiation Biology, 65, 457-464.
145
Terzoudi G.I., Jung T., Ham J., Vrouvas J., Margaritis K., Donta-Bakoymanni C., Makropoulus V., Angelakis
P.H., and Pantelias G.E. 2000, Increased G2 chromosomal radiosensitivity in cancer patients : The role of
cdkl/cyclinB activity levelin the mechanism involved. . Int. J. Radiat. Biol. 76, 607-615.
Thomas A., and White E.,1998, Suppression of the p300-dependent mdm2 negative-feedback loop induces the
p53 apoptic function. Genes Dev., 12, 1975-1985.
Tucker J.D., Lee D.A. and Moore D.H., 1995, Validation of chromosome painting. II A detailed analysis of
aberrations folowing high doses of ionozing radiation in vitro. Int. J. Radiat. Biol. 67, 19-28.
Tucker J.D., Ramsey M.J., Lee A.D. and Minkler J.L. 1993, Validation of chromosome paining as a
biodosimeter in human peripheral lymphocytes following acute exposure to ionising radiation in vitro.
Int. J. Radiat. Biol. 64, 27-37.
Ward J.F. 1995 Radiation mutagenesis: The initial DNA lesions responsible. Radiat.Res. 142, p.362-368..
Wolff S. 1992, Faila Memorial Lecture: Is radiation all bad? The search for adaptation. Radiation Research,
131, 117-123.
Wouters B.G. and Skargard L.D., 1994, The response of a human tumour cell line to low radiation doses:
evidence of enhanced sensitivity. Radiation Research, 138, S76-80.
Wouters B.G. and Skargard L.D., 1997, Low dose radiation sensitivity and induced radioresistance to cell killing
in HT-29 cells is distinct from the “adaptive response“ and cannot be explained by a subpopulation of
sensitive cells. Radiation Research, 148, 435-442.
Youngblom J.H., Wiencke J.K., and Wolff S. 1989, Inhibition of the adaptive response of human lymphocytes to
very low doses of ionising radiation by the protein synthesis inhibitor cycloheximide. Mutation
Research, 227, 257-261.
Zhan Q., Bae I., Fornace A.J. Jr., and Creig R.W., 1997, Induction of Bcl-2 family member Mcl-1 as an early
response to DNA damage. Oncogene, 14, 1031-1039.
Zhan Q., Fan S., Bae I., Guillouf C., Liebermann D.A., O Ćońnor and Fornace A.J., 1994, Induction of BAX by
genotoxic stress in human cells correlates with normal p53 status and apoptosis. Oncogene, 9, 3743-3751.
Zhou H, Randers-Pehrson G, Waldren CA, Vannais D, Hall EJ, Hei TK. 2000 Feb, Induction of a bystander
mutagenic effect of alpha particles in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA 29;97(5):2099-104
146