—Stopa -biologický materiál (co vyprodukovala příroda) na místě činu, který má souvislost s TČ – stane se součástí zkoumání -v podstatě cokoliv (KSSMTK x směs) -pro genetiku – nutnost obsahu DNA — —Srovnávací vzorek -biologický materiál odebraný osobě známé totožnosti x mrtvola neznáme totožnosti je stopa -poškozený -podezřelý -domácí osoba -eliminační vzorek — BIOLOGICKÝ MATERIÁL vše, co bylo či je součástí nebo produktem živého organismu krev sperma sliznice Lidské / zvířecí chlupy části rostlin BIOLOGICKÁ STOPA biologický materiál zajištěný v souvislosti s kriminalisticky relevantní událostí – například na místě činu stěr moči sliny na nedopalku —nutno zjistit původ materiálu —orientační testy a specifické testy — —ORIENTAČNÍ: —Orientační zkouška, která vyšla pozitivně, udává, že se může jednat o daný materiál, ale taky nemusí. Tyto zkoušky jsou velmi rychlé a levné. Jsou založeny na detekci přítomnosti určitých chemických látek nebo to jsou zkoušky s fyzikální podstatou, jako je užití světla. U orientačních zkoušek se vyskytují falešně negativní výsledky s nízkou frekvencí ovšem s vyšší frekvencí falešně pozitivní výsledky. — —SPECIFICKÉ: —Pozitivní výsledek specifické zkoušky indikuje, že se téměř určitě jedná o daný materiál. Specifické zkoušky poskytují vysokou pravděpodobnost, že se jedná o daný materiál. Existují i výjimky, kdy se může jednat o falešně pozitivní výsledek, ovšem tato pravděpodobnost je často zanedbatelná. Tyto zkoušky jsou založeny na detekci přítomnosti specifických bílkovin, hormonů atd. — —Určení druhu biologického materiálu se provádí u stop, kdy je tohoto materiálu dostatek a neohrozí se případné stanovení genetického profilu osoby, které by po odebrání určitého množství materiálu už nebylo možné stanovit v potřebné kvalitě. — - výsledek = „nejspíš se nejedná o krev“ C T C T + výsledek = „pravděpodobně se jedná o krev“ - výsledek = „s jistotou se nejedná o sperma“ + výsledek = „s jistotou se jedná o sperma“ SPECIFICKÁ ZKOUŠKA ORIENTAČNÍ ZKOUŠKA pozitivní výsledek indikuje, že by se mohlo jednat o daný biologický materiál —neprůhledná tekutina červené až červenohnědé barvy — —další typy lidské krve, které lze odlišit: —- pupečníková krev — krev nenarozeného dítěte, která obsahuje velké množství krvetvorných kmenových buněk, obdobně jako kostní dřeň —- menstruační krev — krev obsahující tkáň a výměšky děložní sliznice lLuminol – orientační test -C8H7N3O2 (IUPAC: 5-Amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione; o-Aminophthaloyl hydrazide, o-Aminophthalyl hydrazide, 3-Aminophthalhydrazide 3-Aminophthalic hydrazide) -všestranná chemikálie známá svojí chemoluminiscencí při smíchání s vhodným oxidačním činidlem v podobě modrého záření v tmavé místnosti -bílá až světle žlutá krystalická látka rozpustná ve většině organických rozpouštědlech, ale nerozpustná ve vodě -složení reakční směsi: 3-amino-ftalhydrazid (luminol), Na2CO3, destil. H2O, perborát sodný (podle Grodského z roku 1951) nebo 3-amino-ftalhydrazid (luminol), NaOH (nebo KOH), H2O2 (podle Webera z roku 1966) -v buněčné biologii využíván pro detekci mědi, železa a kyanidů -pomocí reakce luminolu s hemoglobinovým železem je možné detekovat i stopové množství krve (ředění až 107) Þ modré záření trvající cca 30 s -může ovlivnit množství a kvalitu DNA ve stopě — -BlueStar® Forensic (BlueStar) – orientační test -test na bázi luminolu -detekce krevních stop pouhým okem neviditelné (vyprané, vyčištěné skvrny apod.) -schopnost detekce při ředění až 1:10000 -intenzivnější a delší luminiscence -pro detekci není třeba úplná tma -možná opakovaná aplikace -falešně pozitivní reakce: brambory, rajčata, červená cibule, fazole, křen, kyselina askorbová, 5% bělidlo, CuSO4, Fe2(SO4)3, sloučeniny chlóru a niklu — -Hemascein® (Abacus Diagnostics) – orientační test -slouží k odhalení latentních krevních stop na bázi redoxní reakce -neobsahuje luminol -zkouška na bázi fluoresceinu -nevyžaduje úplnou tmu -fluorescence až 10 minut -bez interakce s DNA -zdraví nezávadný -falešně pozitivní reakce: brambory, krev jiného živočišného druhu, některé oleje — lvětšina orientačních zkoušek se zaměřuje na detekci přítomnosti hemoglobinu. lKastle – Meyerův test – orientační test -poprvé popsán roku 1930 -detekce hemoglobinu fenolftaleinem -zkouška založená na peroxidázové aktivitě hemoglobinu katalyzovat oxidaci fenolftaleinu Þ světle růžové zabarvení -reakce hemoglobinu a peroxidu vodíku, při kterém se spotřebovávají elektrony; fenolftalein se v této reakci chová jako dárce elektronů, dochází k redukci, mění tak svoji klasickou formu na fenolftalin a mění své prostředí na alkalické lZkouška peroxidem vodíků (H2O2) – orientační test -explozivní reakce - krev slouží jako katalyzátor při štěpení H2O2 na vodu a kyslík Þ typické „zašumění“ vzorku -ničí DNA !!! lAdlerův test - orientační test -krevní test založený na reakci benzidinu, Na2O2 a ledové kyseliny octové Þ modro zelené zbarvení -vysoká citlivost (možná detekce vzorku při ředění 1:500000) — -Bertrandova zkouška – specifický test -Hb za přítomnosti MgCl2 tvoří s kys. octovou při tepolotě 120 ºC červenohnědě krystaly acetchlorheminu kosodélníkového či kosočtverečného tvaru - -Teichmannova zkouška – specifický test -důkaz krve pomocí heminových krystalů -objev roku 1853 – L. Teichmann -zahřátí směsi vzorku krve, chloridu sodného a kyseliny octové Þ hnědé kosodélníkové krystalky, někdy ve formaci křížů nebo hvězdic -nemusí se podařit nalézt krystalky u vzorku vystaveného teplotě kolem 140 ºC — -Takayamova zkouška – specifický test -specifická hemochromogenová zkouška pro určení krve ve skvrně -hemochgromogen = rozpadový derivát Hb s denaturovanou globinovou částí a dvojmocným železem -vhodná k průkazu krevních skvrn starých, poškozených hnilobou, teplem, kyselinami nebo alkáliemi -objev roku 1912 – Masao Takayama -krevní skvrna na podložním sklíčku + reagens (glukóza, NaOH, pyridin, dest. H2O) + krycí sklíčko + zahřátí nad plamenem -Fe z hemoglobinu reaguje s pyridinem za vzniku oranžovo – červených krystalků -vyžaduje velké množství materiálu — -SERATEC® HemDirect test (SERATEC) – specifický test -test založený na imunochromatografii -detekce lidského hemoglobinu na základě specifické reakce antigen – protilátka -test původně vyvinutý pro účely detekce krve ve stolici Þ časná detekce rakoviny tlustého střeva -falešně pozitivní reakce: krev primátů a fretky — Obsah obrázku elektronika Popis byl vytvořen automaticky Hexagon OBTI - -využíván k detekci lidské krve - -detekce lidského hemoglonbinu (hHb) – monoklonální protilátka anti-human Hb - -reaguje při naředění 1 : 2,000,000 (cca 250 červených krvinek - 0.05 µg/ml hemoglobinu) - -falešně pozitivní reakce: primáti (gorilla) a fretkovití (lasička, jezevec) - -nereaguje s kráva, prase, ovce, koza, kůň, králík, kuře, kachna, husa, morče, jelen, kočka, pes - - -HemaTrace® (Abacus Diagnostics) – specifický test -detekční limit pro hemoglobin: 0,07 μg/ml -specifita pro lidskou krev, krev vyšších primátů a krev fretky - -RSID™ - Blood (Rapid Stain Identification) (Independent Forensics) – specifický test -využití dvou monoklonálních protilátek proti specifickému proteinu – glykoforin A – specifický membránový protein erytrocytů (místo protilátek proti hemoglobinu) Þ vyhnutí se křížové reakci s krví fretky, skunka, vyšších primátů apod. -schopnost detekce < 1 μl krve — Extract (μl): 0 0.2 1 5 20 100 Blood (μl): 0 0.01 0.05 0.25 1.0 500 —PMB test (SERATEC) —kombinace detekce lidského hemoglobinu a D-dimeru —D-dimer je fibrin degradující produkt přítomný v krvi, resp. krevní sraženině, a je degradován fibrinolýzou —obsahuje dva zesítěné D fragmenty fibrinového proteinu, ze kterého je odvozen název D-dimer (menstruace je spojena s aktivací koagulačních a fibrinolytických drah) —rozvoj akutního a/nebo chronického nadměrného srážení krve (trombotickou příhodou) jako hluboká žilní trombóza (HŽT), plicní embolie (PE), nebo diseminovaná intravaskulární koagulace (DIC) —citlivost: hemoglobin: 20 ng/mL; D-dimer: 400 ng/mL – tři proužky —falešně pozitivní: primáti a fretky —falešně negativní v pozdější fázi menstruace —Amyláza – enzym štěpící škrob na jednodušší cukry —- první enzym, který byl nalezen a izolován (1833) -α-amyláza produkovaná slinnými žlázami = ptyalin – štěpí α-glykosidickou vazbu obsaženou v polysacharidech za vzniku menších jednotek – dextrinů —Lugolův roztok (Lugolovo činidlo) - roztok elementárního jodu a jodidu —draselného ve vodě — - používaný pro důkaz škrobu (jod se váže do molekuly škrobu) Þ tmavě modré zbarvení — - v přítomnosti slin (obsahují α-amylázy), dojde ke štěpení α-glykosidické vazby, a tím k degradaci škrobu na menší jednotky Þ jod se nemá kam vázat Þ žluto – hnědé zbarvení — Roztok škrobu s Lugolovým činidlem bez slin Roztok škrobu s Lugolovým činidlem se slinami —AmylasePaper (SERATEC) —- k detekci skvrn slin, do 10 min. —- citlivost: pod 125 mIU/mL —https://www.youtube.com/watch?v=JBTOeRjK0TU —https://youtu.be/JBTOeRjK0TU — —SERATEC® AmylaseTest -k detekci α-amylázy -citlivost: ředění 1:1000 -do 10 min. -není falešně pozitivní s tělními tekutinami a se slinami domácích a užitkových zvířat —https://youtu.be/Iuk3eayaPEI - lRSID™ - Saliva (Rapid Stain Identification) (Independent Forensics) – specifický test -specifický test pro detekci lidské slinné α-amylázy -metoda založená na imunochromatografii se dvěma monoklonálními protilátkami -test specifický pro lidský slinný (AmyA) antigen Þ bez zkřížené reakce s krví, spermatem, močí, vaginálním sekretem, menstruační krví a zvířecími slinami -detekční limit: < 1 μl — Extract (μl): 0 1 5 10 20 Saliva (μl): 0 0.05 0.25 0.5 1.0 -Fast Blue B – sůl C14H12N4O2Cl2 · ZnCl2 - orientační test -(průkaz kyselých fosfatáz (roztok připraven dle protokolu v laboratoři)) -detekce kyselé fosfatázy – glykoprotein produkovaný mužskou prostatou Þ transport do seminální tekutiny – koncentrace až 400x vyšší než v jiných tělních tekutinách -PAP (prostatic acid phosphatase) – 1. celosvětově využívaný tumorový marker -pomocí filtračního papíru přenesení zvlhčené skvrny - zkoumané místo nejprve vizuálně prohlédněte - textilie vykazují na podezřelých místech tužší krepovitou strukturu, pod UV světlem mají stopy modravou, bílou nebo žlutavou fluorescenci -k místu se přidá detekční činidlo přidání několik kapek monohydrátu α-naftylfosfátu sodného a roztoku Fast Blue B ke vzorku Þ purpurové zabarvení indikující přítomnost PAP, nutno provést zkoušku na ověřeném materiálu, moč, sekret, sliny reakci neovlivňují - — —Phosphatesmo KM -reaguje s kyselou fosfatázou, kterou obsahuje sperma -zkoumané místo nejprve vizuálně prohlédněte - textilie vykazují na podezřelých místech tužší krepovitou strukturu, pod UV světlem mají stopy modravou, bílou nebo žlutavou fluorescenci -místo navlhčit, přiložit testovací plochou po dobu cca 15 s a je-li přítomno sperma, po několika sekundách se objeví výrazné fialové skvrny - -SERATEC® PSA Semiquant test (SERATEC) – specifický test -využití monoklonální protilátky proti specifickému proteinu – PSA (prostatický specifický antigen) = p30 = γ-seminoprotein – glykoprotein produkovaný prostatou a sekretovaný do ejakulátu -umožnění detekce spermatu i u jedinců s azoospermií nebo po vazektomii -metoda založená na imunochromatografii -původně vytvořený pro detekci rakoviny prostaty — -ABAcard® p30 test (Abacus Diagnostics) – specifický test -využití monoklonální protilátky proti specifickému proteinu – PSA (prostatický specifický antigen) = p30 = γ-seminoprotein – glykoprotein produkovaný prostatou a sekretovaný do ejakulátu -umožnění detekce spermatu i u jedinců s azoospermií nebo po vazektomii -metoda založená na imunochromatografii — -RSID™ - Semen (Rapid Stain Identification) (Independent Forensics) – specifický test -využití dvou monoklonálních protilátek proti specifickému proteinu – semenogelin – hlavní složka lidské seminální tekutiny Þ vyhnutí se křížové reakci se spermatem kozla, berana, prasete, býka, psa, koně, myši, kocoura -metoda založená na imunochromatografii -Þ bez zkřížené reakce s lidskou krví, slinami, močí -detekční limit: < 1 μl lidského spermatu — Extract (μl): 0 1 5 25 100 Semen (μl): 0 0.05 0.25 1.25 5.0 —specifický důkaz přítomnosti spermatu, jeden z nejcitlivějších způsobů, mikroskopicky histologické barvení —barvící roztok: krystalvioleť, erytrosin se čpavkem, eosin s roztokem azuru —skarifikát podloží kalhotek, či jiného místa s výskytem —pozitivní nález jedné celé spermie — -SPERM HY-LITER™ (Independent Forensics) – specifický test -využití derivované monoklonální myší protilátky proti spermatickým hlavičkám -detekce lidských spermií z míst sexuálních útoků s využitím fluorescenčního mikroskopu -možné detekovat jedinou spermii -Þ bez zkřížené reakce s epiteliálními buňkami, krvinkami a spermatem zvířat — -RSID™ - Urine (Rapid Stain Identification) (Independent Forensics) – specifický test -využití dvou polyklonálních králičích specifických protilátek proti THP proteinu (Tamm - Horsfall protein) – nejhojnější protein v lidské moči Þ vyhnutí se křížové reakci s lidskými slinami, spermatem, krví, vaginální tekutinou nebo menstruační krví; močí želvy, gorily, koně, kočky -reakce s močí psa !!! -metoda založená na imunochromatografii -detekční limit: < 10 μl lidské moči — -Paul Uhlenhuth (1870-1957) -průkaz lidské krve na základě precipitační zkoušky umožňující odlišit lidskou krev od krve jiného živočišného druhu – kontaktní metoda (výstup do 10 min) -předpoklad: krev různých živočišných druhů obsahuje unikátní proteiny; s použitím příslušných protilátek je možné krev jednotlivých druhů odlišit - -Imunoprecipitace (Ouchterlony) - specifický průkaz lidské krve volnou difuzí na gelu — —Průkaz lidského původu lze provést samostatně imunologickými metodami (reakcí lidské bílkoviny se specifickou protilátkou), častěji ale průkaz lidského původu vyplyne „samovolně, jako vedlejší produkt“ z výsledku genetického zkoumání. —Většina forenzně genetických testů užívaných k analýzám lidského biologického materiálu totiž poskytuje standardní pozitivní výsledek právě jen a pouze u lidského materiálu – říkáme, že tyto testy jsou druhově specifické. —Poskytne-li analýza stopy pozitivní výsledek, lze zpětně konstatovat, že stopa obsahovala s jistotou lidský biologický materiál. Z tohoto důvodu se od imunologického průkazu lidské bílkoviny většinou upouští, a to zejména u stop s předpokládaným malým či velmi malým množstvím využitelného biologického materiálu. — — BUKÁLNÍ STĚR PERIFERNÍ KREV dle stavu těla, tj. pokročilosti degradace: SVALOVÁ TKÁŇ KOST, ZUB MRTVOLY EMBRYA, PLODY dle situace: POTRATOVÝ MATERIÁL CHORIOVÉ KLKY PLODOVÁ VODA PUPEČNÍKOVÁ KREV —Podle vztahu jejich zůstavitele k objasňované události ostopy pocházející z organizmu pachatele o stopy pocházející z organizmu oběti o stopy pocházející z organizmu jiné (nezúčastněné) osoby o směsné stopy – pocházející z organizmů nejméně dvou osob — —Podle místa nálezu —- na místě činu —- na předmětech a nástrojích, kterými mohl být spáchán trestný čin —- na oděvních součástkách a těle pachatele —- na oděvních součástkách a těle oběti —- na vozidlech —- na dalších předmětech a místech (se spácháním trestného činu nemusí souviset ) — —Stopy viditelné okem – drobné biologické stopy — - krevní kapky, otěry — - zaschlý nosní sekret — - vlasy, stopy slin na skleničkách atd. — —Stopy okem neviditelné – odhalitelné s použitím speciálních pomůcek či postupů (orientační či specifické zkoušky, monochromatické forenzní světelné zdroje – forenzní „baterky“) — —Stopy latentní – nemožnost detekce ani okem, ani screeningovými testy (Diamond™Nucleic Acid) — - zajišťují se „naslepo“ — - odebírány v místech, kde výskyt — biologického materiálu předpokládáme — - nástroje, oblečení, předměty — —zdroj DNA- celý povrch těla – epiteliální buňky, fragmenty buněk, volná DNA —přenos/transfer primární, sekundární a terciární —množství DNA: vnější a vnitřní faktory — - vnitřní: věk a pohlaví jedince, onemocnění pokožky, — hygienické návyky, „trusič“ x „netrusič“ — - vnější: vlhkost, UV záření, povrch (poréznost, — mikroorganismy) —- intenzita otlaku, způsob zajištění ldetekce založena především na morfologickém porovnání na dvou úrovních: —1) odlišení lidského trichologického materiálu od materiálu jiného živočišného druhu —2) odlišení: vlasy – kožní ochlupení – pubické ochlupení – axilární ochlupení kutikula kůra dřeň anagenní katagenní telogenní (růstová) fáze (přechodná) fáze (klidová) fáze -manipulace s TM - speciální entomologiká pinzeta —detekujeme: délku, šířku, tvar (rovné, mírně zvlněné, zvlněné, vlnité, kudrnaté, fil fil), barva (artificiální, depigmentovaná, světle – tmavě plavá, světle – středně –tmavě hnědá, černohnědá), pigment (difuzní, malé – střední – velké shluky), dřeň (chybí, souvislá, přerušovaná, ostůvkovitá) —poškození: fyzikálně-chemické (dle destrukce stvolu), biologické faktory, genetické (alopecie a hypertrichózy, syndromy) — — C:\Users\hs312876\Desktop\Bio + tricho\Trichos\Trichos II\right\defect\trichorrhexis2.jpg Trichorrhexis nodosa Trichoptilosis Trichonodosis střelná poškození poškození způsobené skleněnými střepy C:\Users\hs312876\Desktop\Bio + tricho\Trichos\Trichos I\right\defect\tlak3.jpg stlačení úderem tupé strany sekery tepelná poškození stlačení pinzetou poškození způsobená konc. NaOH — poškození keratofilními plíšněmi a houbami poškození způsobené různými keratofilními živočichy mykózy C:\Users\hs312876\Desktop\Bio + tricho\Trichos\Trichos II\right\defect\bamboo.jpg Trichorrhexis invaginata C:\Users\hs312876\Desktop\Bio + tricho\Trichos\Trichos II\right\defect\24.jpg Pili bifurcati Monilethrix představuje autosomálně dominantní dědičný defekt vlasového stvolu způsobený mutací genů pro keratin typ II (HB1 a HB6), klinicky se projevující alopeciemi a folikulárními papulemi. C:\Users\hs312876\Desktop\Bio + tricho\Trichos\Trichos II\right\animal\jelen1.jpg C:\Users\hs312876\Desktop\Bio + tricho\Trichos\Trichos II\right\animal\kralik.jpg C:\Users\hs312876\Desktop\Bio + tricho\Trichos\Trichos II\right\animal\mravenecnikvelky1.jpg C:\Users\hs312876\Desktop\Bio + tricho\Trichos\Trichos II\right\animal\potkan.jpg — určení data/času úmrtí u mrtvoly (post mortem čas) —znalost počastí, teploty, pokryv těla mrtvoly, příčina smrti, lokalita, dostupnost, nadmořská výška, nekrofágní fauna —dle společenstva hmyzu: nekrofágní (čerstvá mrtvola), saprofágní (biochemicky aktivní), dermatofágní (vysychající), keratofágní (dehydratovaných zbytcích) —dle rozkladu mrtvoly: čerstvá, nadmutá, bioch. aktivní, pokročilý rozklad, vysychání a zbytky —odběr reprezentativního vzorku živých i mrtvých larev, kukel a dospělců z těla a lože mrtvoly, dochovat larvy a kukly do stádia dospělce a určit o jaký druh šlo, odpočet délky zpětně do období nakladení vajíček —časově zákonitý sled nekrofágního hmyzu —s délkou doby pobytu mrtvoly v terénu je stejně zákonitě spjato i vývojové stádium každého hmyzu —každý nekrofágní hmyz nalezený na mrtvole má svůj identifikační význam —genetika: nevhodně odebraný vzorek, nepodařilo se určit druh hmyzu — JUDr. Ladislav Dušek: Možnosti využití entomologie v kriminalistice, 1990 — určení data/času úmrtí u mrtvoly (post mortem čas) —znalost počastí, teploty, pokryv těla mrtvoly, příčina smrti, lokalita, dostupnost, nadmořská výška, nekrofágní fauna —dle společenstva hmyzu: nekrofágní (čerstvá mrtvola), saprofágní (biochemicky aktivní), dermatofágní (vysychající), keratofágní (dehydratovaných zbytcích) —dle rozkladu mrtvoly: čerstvá, nadmutá, bioch. aktivní, pokročilý rozklad, vysychání a zbytky —odběr reprezentativního vzorku živých i mrtvých larev, kukel a dospělců z těla a lože mrtvoly, dochovat larvy a kukly do stádia dospělce a určit o jaký druh šlo, odpočet délky zpětně do období nakladení vajíček —časově zákonitý sled nekrofágního hmyzu —s délkou doby pobytu mrtvoly v terénu je stejně zákonitě spjato i vývojové stádium každého hmyzu —každý nekrofágní hmyz nalezený na mrtvole má svůj identifikační význam —genetika: nevhodně odebraný vzorek, nepodařilo se určit druh hmyzu —metody extrakce: DEP-25 DNA extraction Kit, Lego DNA kit, buffer a QIAamp DNA Mini kit —co detekuji: mtDNA – cytochrom C podjednotky I a II (COI a COII), polymorfní oblati mtDNA a rRNA (28S a 16S) —metodika: PCR-RFLP techniky — - pyrosekvenování, RT PCR, microarray, analýza hetroduplexů (detekce bodových mutací v dsDNA ) —vyhodnocení: daný program s využitím BLASTu a tvorby fylogenetických stromů s využitím statistiky (LR, …), GenBank databáze —databáze vzorků pro daný region —biologie: původ biologického materiálu —pouze a jedině znalec totiž může určit, zda stopa má skutečně povahu biologického materiálu či nikoli — —1) vyhledat —2) zajistit —3) otestovat —4) odebrat na genetiku —