—Separační metody založené na pohybu nabitých částic ve stejnosměrném elektrickém poli, přičemž různé částice mají různou elektroforetickou mobilitu (tj. pohybují se v poli rozdílnou rychlostí). —Na základě této rozdílné pohyblivosti tak doje k separaci jednotlivých typů částic. — — + _ + _ Vzorek obsahuje směs DNA fragmentů různé délky Po vložení napětí se fragmenty začnou gelem pohybovat k anodě Fragmenty se v gelu rozdělí podle své délky — Vzorek DNA nanesen do malé jamky v gelovém plátu (vodorovný nebo svislý) ponořeném v pufru mezi elektrodami. — Agarózový gel (AGE) — Polyakrylamidový gel (PAGE) — Výsledek: proužky (bandy) — Velikostní standard (žebříček) – uměle připravená směs fragmentů několika známých délek — — —vzorek elektrickým pulzem nabrán na začátek tenké skleněné kapiláry naplněné polymerem lineárního akrylamidu nebo polydimethylamidu — detekce fragmentů prováděna v průběhu času: každý fragment je již před analýzou označen fluorescenční barvou (zpravidla začleněním označeného primeru v průběhu PCR) —při průchodu fluorescenčně značených fragmentů spec. okénkem laserový paprsek vybudí silnou fluorescenci, která je zaznamenána CCD detektorem — vnitřní standard (žebříček) – přidáván přímo do analyzovaného vzorku —čím kratší fragment je, tím dříve doputuje k okénku v kapiláře —délka fragmentu určena podle relativní doby, kterou fragment potřebuje k dosažení okénka kapiláry (na základě porovnání s velikostním standardem). — [USEMAP] [USEMAP]Obsah obrázku text Popis byl vytvořen automaticky — + _ + _ Vzorek s fluorescenčně značenými DNA fragmenty různé délky putuje skleněnou kapilárou naplněnou polymerem Při průchodu fragmentu detekčním okénkem vyvolá laser silnou fluorescenci, která je zaznamenána CCD detektorem čas T1 čas T2 čas T3 T1 T2 T3 V časovém záznamu elektroforézy – elektroforetogramu – se zvýšení fluorescence projeví jako tzv. pík + _ — è PCR amplifikace – multilokusová; několik párů primerů (jeden primer z každého páru označen fluorescenční barvičkou) + pár primerů pro PCR specifického úseku v genu pro amelogenin (určení pohlaví) è Kapilární elektroforéza – PCR produkt spolu s vnitřním standardem napipetujeme do zkumavky s formamidem (silně denaturující účinek), resp. HiDi formamid+vnitřní standard a pak přidám vzorek — 100 bp 120 bp 200 bp 180 bp 140 bp 225 bp 80 bp 60 bp 158 bp 194 bp Monoplex – analýza jediného STR lokusu Multiplex – analýza několika STR lokusů lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4 lokus 5 lokus 6 —délkový polymorfismus – nerozpoznám bodové mutace —- příklad: AAGT AAGT AAGT AAGT AAGT AAGT AAGT AATT AAGT AAGT AAGT AAGT AAGT —Delece -příklad: TH01 9.3 – TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCA -TCAT TCAT TCAT TCA TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT -důležitý je počet písmenek dělitelný 4-mi -malý peak před „reálnou“ alelou -o právě jedno opakování kratší (min. výška u Pent D a E – výhoda u směsí -dobře hodnotitelný u jednoduchých profilů DNA -u směsného profilu se nutně nemusí jednat o stutter, ale o alelu minoritního zůstavitele - -Adenylace - ‘+A’ forma amplikonu -Taq polymerase, používaná na PCR, přidává na 3´konec produkt kopírující templátové vlákno -většinou právě adenosin -výsledkem je vlákno o jeden nukleotid delší -řešením je přidat další krok o teplotě 60°C nebo 72°C po ukončení cyklů -jedna alela je v daném binu a druhá se vymyká -pokud již byla pozorována, výrobce kitu jí zařadí do „ladderu“ a systém ji označí velikostí (číslem) -úplná novinka je mimo biny a systém ji označí jako off-ladder a je potřeba dopočítat velikost a v každém případě pro jistotu zopakovat od kroku amplifikace —Alela se nezobrazí, protože: -zájmová oblast je poškozená (není zde repetice) -poškození v prostoru před zájmovou oblastí - místo nasedání primeru je poškozené (mutované, degradace) —v lokusu se objevuje více jak dva píky —v lokusu jsou píky různé výšky se zjevnou imbalancí mezi jednotlivými píky —jedná se o stutter více jak 15% (až 25 %) výšky vedlejšího píku — lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4 lokus 5 lokus 6 nerovnováha píků u heterozygota alelický drop-out lokusový drop-out zvýšení stutteringu alelický drop-in -velikostní standard (Sice standard) -žebříček (Ladder) -pozitivní kontrolu -