Plant Cell Biology Department of Experimental Biology, MU 10. Buněčné dělení a ontogeneze rostlin ► Buněčný cyklu (The cell cycle) ► Regulace buněčného cyklu ► Mitóza ► (pre-)profáze, (pro-)metafáze, anafáze, telofáze ► Zvláštnosti cytokineze buněk vyšších rostlin ► Meióza (redukční dělení) ► Radiální symetrie ► Root apical me r i stem (RAM) ► Shoot apical meristem (SAM) ► Polární transport auxinů ► Vývoj mnohobuněčných organizmů ► Stavba těla dvouděložných rostlin Embryogenéze: původ polarity Apikálně-bazální polarita Rostlinné formy pocházející z nepředurčený (indeterminate) růstových procesů Vývoj rostlin na rozdíl od živočichů odráží strategie ■v -v • t r přežiti: ► Rostlina neschopná pohybu vs. živočišné mechanismy mobility. ► Rostliny fotosyntetické vs. živočichové heterotrofní. ► Rostliny se spoléhají na flexibilní vzorce růstu, které jim umožňují přizpůsobit se životu na místě. Vegetativní růst rostlin není typicky předem určený a je vystaven změnám bez daných konečných bodů. Rostlinné buňky jsou totipotentní! Strom sekvoje starý 2500 let vs Arabidopsis (životní cyklus dokončen za několik měsíců) Buněčný cyklus (the cell cycle) ► Jediný způsob, jak vytvořit novou buňku, je duplikovat buňku, která již existB (všechny živé organismy, od jednobuněčných bakterií po mnohobuněčné savcj ► Buněčný cyklus popisuje změny, ke kterým dochá v průběhu životního cyklu buňky. daughter cells 3 CELL DIVISION 1 CELL GROWTH AND CHROMOSOME REPLICATION 12 CHROMOSOME SEGREGATION 1 Je ovlivněn podmínkami prostředí (vnitřní a vnější signály) c také cirkadiánnín rytmy (střídáním dne a nocřV Buněčný cyklus eukaryot se skládá ze 4 fází G1, S, G2 (společně nazývané interfáze) a M fáze ► S fáze - dochází k hlavním chromozomálním událostem, chromozomy jsou duplikovány. ► M fáze - duplikované chromozomy jsou segregovány do páru dceřiných jader (v mitóze), načež se samotná buňka rozdělí na dvě (cytokineze). ► Fáze G1 a G2 (sap) - poskytují buňkám čas k růstu a zdvojnásobení množsví jejich proteinů a organel. M PHASE | mitosis ' (nuclear ! division) G2 PHASE cytokinesis (cytoplasmic division) S PHASE (DNA replication) PHASE Most differentiated cells spend the majority of^ their life in G1 cytoplasm nucleus — chromosome duplication MITOSIS CYTOKINESIS TD CD Kontrolní systém buněčného cyklu ► Spouští a koordinuje buněčný cyklus, reaguje na různé intracelulární a extracelulární signály a v případě potřeby jej může zastavit. ► Centrální složkou jsou cyklin-dependentní kinázy (Cdks) a cykliny. cyclin cyclin-dependent kinase (Cdk) Cyklin tvoří komplex s Cdk, která se aktivuje (fosforylací), bez cyklinu je Cdk neaktivní. J_m cyclin inhibitory phosphate Wee1 kinase Cdc25 phosphatase Cdk activating phosphate ACTIVE INACTIVE ► Regulace aktivity Cdk inhibiční fosforylací: Další mechanismy řídící aktivity komplexů cyklin-Cdk: Fosforylace a defosforylace klíčových aa v Cdk proteinech. Jj^^M ► Syntéza a degradace cyklinů (v každém buněčném cyklu, zato hladina Cdks je konstantní). Změny v transkripci genů kódujících regulátory Cdk. ► Vazba Cdk inhibitorových proteinů (CKI), ubikvitylace a poté destrukce regulačních proteinů. Regulace buněčného cyklu u vakulovaných buněk tabáku Cyklin-dependentní kinázy jsou klíčové enzymy, které řídí přechody mezi fázemi b. cyklu. protein kinázy fosforylující proteiny pomocí ATP Cdk závisí na regulačních proteinech cyklinech ► 3 základní cykliny: Cykliny G1IS (Cyklin D) aktivní pozdě v G1. Cykliny typu S (Cyklin A) aktivní v pozdní S fázi. Cykliny typu M (Cyklin B) spouští mitotickou fázi. Kinetochore Polar microtubule Chromosome Kinetochore microtubules Astral microtubules Cyclin A CDK A Spindle poles with ER membranes containing nuclear envelope proteins Divided vacuole Cydin D CDK A S phase-DNA synthesis Cell wall Plasma membrane Nucleus Cytoplasm Cortical E R network phase Longitudinal cortical microtubule Transvacuolar strand Tono plast -ER Transverse cortical microtubule Mitóza Proces jaderného dělení následovaný dělením buněk (cytokineze). Vyskytuje se pouze u eukaryot. U prokaryot jsou genomy segregovány růstem plazmatické membrány mezi body připojení dvou replikovaných molekul DNA Základní fáze: (pre-)profáze, (pro-)metafáze, anafáze, telofáze. interphase mitosis cytokinesis metaphase-to-anaphase transition prophase prometaphase metaphase anaphase telophase DNA replication ► Mitotický index je procento buněk podstupujících mitózu ve stejnou dobu (-10 %). Mitóza Přestože vyšší rostliny nemají pár kolmých centriol, dělicí rovina je vytvořena pásem mikrotubulů a aktinových filament (preprophase band) a vzniká mitotické vřeténko. Profáze začíná kondenzací chromatinu do chromozomů, které se snadněji pohybují cytoplazmou. Nástup prometafáze se vyznačuje rozpadem jaderného obalu ► Vlákna vřeténka (mikrotubuly) se připojují k viditelně zúžené oblasti chromozomů známé jako primární zúžení, kinetochor nebo centromera. Metafáze začíná, když se chromozomy seřadí v rovině uprostřed mezi dvěma póly. Anafáze začíná náhle, když se spárované kinetochory každého chromozomu rozdělí. Telofáze začíná, když dekondenzující dceřiné chromatidy dorazí k pólům, kinetochorové mikrotubuly zmizí a jaderný obal se zreformuje kolem dekondenzujících chromozomů a vytvoří dvě dceřiná jádra. Higher plants do NOT have centriols! DNA tát V microtubules -A % Á A cell plate TELOPHASE 50 |im Mitosis of Lilium croceum Flemming, 1882 Structure of a metaphase chromosome Centromere region of chromosome Cohesin Replicated chromosome Kinetochore microtubules Inner kinetochore (centromeric proteins, chromosome and nucleosome binding) Outer kinetochore (microtubule binding, microtubule motors, checkpoint control) Chromatid Fáze mitózy v meristematické rostlinné buňce Preprophase Determination of future plane of division by the preprophase band Cell wall Plasma membrane Nuclear envelope Nucleus Preprophase band of microtubules Cytoplasm LUVacuoles /^Cortical ER network Preprophase band m ■^B^Nuclear envelope Prophase Disappearance of preprophase band, condensation of chromosomes Condensing chromosomes (sister chromatids held together at centromere) Prophase spindle Spindle pole develops Jaderný obal se rozDoda! PHOSPHORYLATION OF LAMINS AND ^NPC PROTEINS phospho related Iamiri5 P ■ nuclei r envelope fragment Fáze mitózy v meristematické rostlinné buňce Nuclear envelope resorbed into a polar ER network Metaphase Alignment of chromosomes at metaphase plate Chromosomes Anaphase Chromosome segregation, spindle elongation Kinetochore microtubules shorten Polar- microtubules slide to increase spindle size Separated chromatids are pulled toward poles Polar microtubules Fáze mitózy v meristematické rostlinné buňce Telophase Phragmoplast formation Chromosomes start decondensing Nuclear envelope re-forms Endoplasmic reticulum Nuclear envelope re-forms Phragmoplast micro tubules Phragmoplast (network of microtubules, ER, and membrane vesicles) Membrane vesicles Cytokinesis Cell plate formation Chromosomes completely decondensed Two cells formed Zvláštnosti cytokineze buněk vyšších rostlin Dělící rovina je vytvořena preprofázím pruhem (z mikrotubulů a aktinových filament) v M fá^ V telofázi, po segregaci chromozomů, se uvnitř buňky na rovníku starého vřeténka začne ukládat nová buněčná stěna (BS). Interpolární mikrotubuly mitotického vřeténka začínají tvořit fragmoplast uprostřed buňky. Vezikuly odvozené z Golgi naplněné materiálem pro BS jsou transportovány podél těchto mikrotubulů a spojují se za vzniku nové BS, která roste směrem od středu, aby dosáhla PM a původní BS. PM a membrána obklopující novou BS se spojí a oddělí dvě dceřiné buňky. Orientace buněčné destičky je také závislá na cytoskeletu a buněčné dělení je důležité pro buněčnou diferenciaci a vývoj rostlinných orgánů. preprophase band of microtubules remains of interpolar cortical array of and actin filaments spindle microtubules interphase microtubules Tvorba bunecne desticky z fragmoplastu a ER Telophase Phragmoplast formation ■ • \ . Mid-stage of cell plate formation in Phaseolus vulgaris. Tradescantia (~ 30mm) Dělení organel Plastidy, mitochondríe a pravděpodobně ER jsou semiautonomní organely, jejichž ztráta během dělení by byla fatální. Naproti tomu Golgiho aparát, plazmatická membrána, endosomální a vakuolární kompartmenty jsou odvozené organely a mohou být regenerovány z ER. \ ► Všechny organely jsou typicky distribuovány do dceřiných buněk. * ► Aktin a další pohyblivé proteiny zprostředkovávají dělení plastidů ^ mitochondrií, další organely nejsou známy... Meióza (redukční dělení) Forma jaderného dělení: ► jedna duplikaci chromozomů ► poté dvě segregace chromozomů ► počet chromozomů snížen na polovinu Dochází ke genetické rekombinaci (cross-over). Organismy jsou obecně diploidní: ► obsahují dvě mírně odlišné kopie (homology) každého chromozomu Pohlavní rozmnožování závisí na meióze, kdy se produkují haploidní buňky nesoucí pouze jednu kopii každého chromozomu. V mnoha organismech se haploidní buňky diferencují na specializované reprodukční buňky zvané gamety (u většiny druhů vajíčka a spermie). mjriHrut \ DNA RÍPUCAT1QM IftJWlC A \~- C-.lHE-ING OvEP OF 3U=tlCA-SD HQMO.OG5 -OMOLOG PAKE Ľ ^ E W ON TM SPINDLE SEGREGATION* OF HOMOLQGS AT AfíAFÍWSE I E-FGP EGATIGN OF SÍTI K ĽHHQMATMH V ANAPHASE • □HA. REPLICATION | DUPlKATíď CHROM OS OMEL HNE UP IHDMDUA.lt ON THESPINDLE E-E-S^E GÍTIO1! OF Ei RTE R O-ROFAATIDS *T A/íArv-ASE dlptula nj j^Iildi *HS Vývoj mnohobuněčných organismu Živočichové i rostliny začínají svůj život jako jediná buňka - oplodněné vajíčko nebo zygota. ► ► Během vývoje se tato buňka opakovaně dělí, tyto buňky rostou a množí se a organizují do stále složitějších struktur. Pro vývoj jsou zásadní tyto procesy: ► ► 1) buněčná proliferace, která produkuje mnoho buněk z jedné 2) buněčná specializace nebo diferenciace, která vytváří buňky s různými vlastnc na různých pozicích ist m i 3) interakce buňka-buňka, které koordinují chování každé buňky s chováním jejích! sousedů 4) pohyb buněk, který přeskupuje buňky tak, aby vytvořily strukturované tkáně a\ orgány ~ pouze u živočichů! Rostlinné buňky nejsou schopny migrovat nebo se pohybovat nezávisle po embryu! O oooo oooo lili omoo * I \ \ OéoO CELL PROLIFERATION CELL SPECIALIZATION CELL INTERACTION Figure 21-1 The four essential eel! processes that allow a multicellular organism to be made. CELL MOVEMENT ONLY animals! Stavba těla typické dvouděložné rostliny (eudicot) Meristémy jsou klíčovými prvky pro adaptivní růst. Meristémy Obsahují Axillary bud with meristem rezervoáry buněk, jejichž vývoj není předurčen. Leaf Leaf primordia Shoot apical meristem Prostřednictvím regulované proliferace a diferenciace těchto buněk jsou rostliny schopny produkovat různé komplexní formy přizpůsobené místnímu prostředí. ► Apikální meristémy ► Shoot apical meristem (SAM) ► Root apical meristem (RAM) Vývoj postranních orgánů umožňuje propracovanou architekturu rostlin. Soil line Lateral root Taproot Root hairs Hlavní fáze vývoje sporofytů Embryogenéze = proces, při kterém se jedna buňka (zygota) přemění na základní ale polární organizaci, která obsahuje blíže neurčené buňky v SAM a RAM. Vegetativní vývoj - architektura nadzemní části a kořenů ► fotosyntéza Reprodukční vývoj - vegetativní SAM jsou přeprogramovány tak, aby produkovaly květní orgány. Embryogenesis Vegetative cnapter 1/ shoot apical development meristem Chapters 18, 19 Root apical meristem Mature embryo/ seedling Adult, nonreproductive plant Reproductive development Chapter 20 Adult, reproductive plant Fertilization Chapter 21 Embryogenéze: Původ polarity Vývojové procesy během embryogenéze morfogeneze (vypracování forem) organogeneze (tvorba funkčně organizovaných struktur) ► a diferenciace buněk vytváří anatomicky a funkčně odlišné pletiva (histogeneze). Období prodloužené nečinnosti embrya (dormance) je ukončeno klíčením, po zachycení environmentálních signálů, a dochází k obnovení růstu rostlin. Etapy embryogenéze Arabidopsis Apical cei ► charakterizované Basaiceii přesným buněčním dělením: ► Zygotické stadium (A) ► Polarizovaný růst zygoty následovaný asymetrickým příčným dělením ► Globulámí stadium (B-D) ► Srdcovité stadium (E-F)Coty!edon ► Torpédovité stadium (G) ► Zralé stadium (H) i/^Protoderm (future epidermis) 25 |jm 25 |jm 25 pm 25 um Shoot apex ^-Cotyledon -Root apex 50 pm 50 pm 50 pm 50 pm Pattern formation během embryogenéze Arabidop Antipodes /Ö-CX Polar nuclei ^/ \ Synergids Egg ce Embryo sac Lens-shaped cell Late globular 1 Apical daughter cell Basal daughter, cell Vacuole Zygote 1-Cell Transition Apical embryo region Central embryo region Hypophysis' Suspensor- 8-Cell 16-CeII Cotyledons Shoot apical meristem Early globular Hypocotyl Primary root^ Quiescent center and central root cap Late heart Seedling Klonálně příbuzné skupiny buněk (lze vysledovat až ke společnému progenitorovi) jsou označeny odlišnými barvami, např. hypophysis - initials (stem cells) v QC Apikálně-bazální polarita je určena v raném embryu! ► Jednobuněčná zygota se asymetricky dělí a vzniká krátká cytoplazmatická apikální buňku (embryo) a delší vakuolizovaná bazálni buňka (suspenzor). Embryo se postupně více polarizuje podél dvou os: apikálně-bazální osy (probíhá mezi špičkami výhonku a kořene) a radiální osy (od středu ven), kolmé k apikálně-bazální ose. Shoot Root Radial axis Apical-basal axis ► Periklinální buněčné dělení (nové BS se tvoří paralelně s povrchem). ► Antiklinální buněčné dělení (nové BS se tvoří kolmo k povrchu tkáně). Inside Periclinal division Apical-basal axis Radial axis Outside Anticlinal division ► ► Mezibuněčná signalizace hraje roli v embryogenezi V morfogenezi embrya určují buněčný osud (cell fote) mechanismy závislé na poloze v embryu (position-dependent mechanisms). Komunikace mezi buňkami embrya se často odehrává přes plasmodesmata. Analýza mutantů identifikuje geny pro signální procesy nezbytné pro normálj apikálně-bazální morfologii. Wild type Mutant Wild type např. GNOM kóduje faktor GEF, který umožňuje směrový transport auxinu polární distribucí PINů Auxin funguje jako mobilní chemický signál během morfogeneze (morphogen). Mutant Radial patterning řídí tvorbu pletiv Late heart cross section Late heart ► Radiální kořenový vzor Cortex wooden leg (wol) Cortex + endodermis ► Prokambiální prekurzory pro cévnil pletiva leží ve středu radiální osy (stélé Mutanti ukazují prostorově definované funkce specifických genů. Např. WOODEN LEG (WOL) ~ encodes cytokinin receptor. scarecrow (ser) Cortex short-root (shr) Kořenová špička má čtyři vývojové zóny ► Kořenová čepička (root cap) ► Nejvzdálenější část kořene. ► Chrání RAM před mechanickým poškozením. ► Vnímání gravitace k umožnění gravitropismu. ► Vylučování sloučenin, které pomáhají kořínku pronikat do půdy. ► Meristematická zóna (meristematic zone) ► Obsahuje iniciály a okolní buňky, které se rychle dělí s charakteristickou polaritou, expandují a diferencují se do různých pletiv. ► Zóna prodlužovací (elongation zone) ► Rychlé a rozsáhlé prodlužování buněk. ► Rychlost dělení klesá k nule. ► Zóna zrání, diferenciace (differenciatin zone) ► Buňky získávají své rozmanité vlastnosti. ► Začíná kořenovými vlásky, vznikají zde laterální kořeny. Emerging— lateral root Maturation V zone Elongation 4 zone Meristematic zone Root Původ různých kořenových pletiv lze vysledová^^™ ke konkrétním počátečním buňkám (iniciálám) V ► Všechny pletiva v kořeni Arabidopsis jsou odvozeny z malého počtu iniciál v kořenovém apikálním meristému (RAM): ► columella, epidermal-LRC, cortical-endodermal, stele initials ► QC ~ low rate of cell division (B) Cortex Epidermis Stele initial Quiescent center cell Pericycle /Endodermis Cortical-endodermal initial Columella initial -v- Columella of root cap Epidermis Lateral root cap Epidermal-lateral root cap initial ~~7 Tvorba a vývoj laterálních kořenů ► Závisí na endogenních a exogenních signálech Laterální kořenové primordia (lateral root primordia, LRP) jsou iniciovány v pericyklu ► Antiklinálníděleníy buňkách Epidermís pericyklu předchází periklinálnímu dělení. •Cortical celts ► LRP pokračuje v dělení a expanzi Endodermis Pericycle Stele buněk, dokud se neobjeví nový laterální kořen skrz kortikální a epidermální buněčné vrstvy. Oblasti vznil laterálních kořenů odpoj oblastem maj auxinu, častoj místa ohybu. - v VI Pericycle—^ f Endodermis VII Cortical-endodermall initial Root cap-epidermal initial Quiescent center Root cap 'C pEXPA1::nlšGFP EXPA1:mCh|erry Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) ► lze jej analyzovat z hlediska cytologických zón nebo buněčných vrstev: CZ- central zone (podobná root QC) PZ- peripheral zone (laterární orgány) RZ- rib zone (vnitřní pletiva) L1 (epidermis) & L2~ anticlinální dělení L3~ náhodné dělení Stem cells Rapid cell division Centra! tissues of the stem ► SAM ~ se vztahuje konkrétně na iniciály a deriváty vs shoot apex- zahrnuje vrch^ ► Pletiva prýtů/ výhonků jsou odvozeny z několika samostatných sad apikálních iniciál, jejich identity jsou určeny mechanismy závislými na poloze (napr. pokud se buňka L2 dostane do L1, přijme epidermální identitu). Ve vrcholech výhonků ošetřených kolchicinem obsahuje jedna z buněčných vrstev zvětšená polyploidní (8N) jádra, což dokazuje přítomnost klonálně odlišných vrstev v apikálním meristému výhonku. Control 2N, 2N, 2N SN, 2N, 2N 2N, 8«, 2N 2N, 2N, 8N Tvorba apikální oblasti zahrnuje definovanou sekvenci genové exprese Late heart Induction of expression of CĹV3 16-Cell Early globular Late globular WUS gene expression Transition Seedling shoot meristem Peripheral zone Peripheral ■ zone WUS' 'ANT © CUC2/STM CLV3 ANT T^Abaxial Adaxial 5TM> XUC2 ► Homeostatic regulation (keeps the size of RAMif A Feedback loop udržující iniciály v SAMu WUS udržuje identitu apikálních iniciál a podporuje jejich aktivitu, u mutantů vede k diferenciaci apikálních iniciál. ► Geny CLAVATA (CLV1, CLV2, CLV3) omezují apikální počáteční aktivi^ jejich mutanty výrazně zvětšily SAM. WUSCHEL (WUS) homeobox TF ► CLV1 kóduje leucin-rich repeat (LRRK) receptorovou kinázu signální kaskády. ► CLV3- faktor regulace signálu ► Homeostatic regulation (keeps the size of RAM!) An increase in the number of stem ceils promotes transcription of CLV3. As stem cell number decreases, the level of CLV3 is reduced, allowing the expression of WUS, which causes an increase in stem cell number. CLV3, a small peptide, binds to CLV1 and suppresses the expression of WUS. WUS is required for the maintenance of stem cell number. Regulační interakce mezi malými peptidy a WOX transkripčními faktory ► WOX geny (for WUSCHEL homeobox) TFs hlavní role v SAM, RAM, cambiu, (A) Shoot apical meristem (SAM) Central zone Peripheral stem cells \ zone Organizing sRib zone center Stem ceil Stem cell fate ir CLV1 (J U CLV2 L (B) Root apical meristem (RAM) Quiescent center (QC) Quiescent center eel fr X5J- Sterr ~~1 fate i cell í CLE40 ^ ACR4f~j Columella stem celjy (C) Procambium/cambium Procambium. .Phloem fr í Stem cell fate Procambium cell fr Phloem cell Místa tvorby listů souvisí se vzory polárního transportu auxinu PIN (auxin efflux carrier proteins) přenašečové proteiny auxinového efluxu, polárně lokalizovány ~ nachází se na PM pouze na jednom konci buňky. Rodina proteinů PIN je pojmenována podle špendlíkovitého květenství mutantu pin1 Lokalizace PIN1 na bazálním konci vodivých buněk stonku Arabidopsis L! i: • ! U- t pin1 PLANT PHYSIOLOGY AND DEVELOPMENT 6e, Figure 17.12 (Part 1} •:-:> 2015 Sinauer Associates, Inc. SEM Site of next primordium Most recently formed primordium, which has radial symmetry at this stage Primordium -elongates in the proximal-distal axis Primordium begins to flatten, developing an adaxial-abaxial axis Lokalizované zóny akumiilac auxinu podporují iniciaci listů. 200 um Alternate Decussate (Opposite) Spiral Phyllotaxy _ Polarita rostlin je udržována polárním tokem auxinu ► Transportní proteiny PIN (a ABCB) řídí auxinovou efluxní složku polárního transportu auxinů v Arabidopsis. ► Směr pohybu auxinu je spojen s pletivově specifickou distribucí PINů (efflux carriers). Pohyb auxinu (IAA) je závislý na PIN 1 během raných fází embryogenéze. Cotyledons Maximum auxin Maximum auxin 2-Cell stage Globular embryo Maximum auxin Early heart stage Auxin transport: PIN proteiny Prof. Jiří Friml (A) Plasma- membrane Permease H^-cotransport- \ \ , IAA" vN Direction of auxin transport Vacuole- K y * -V * 1. IAA enters the cell either passively in the undissociated form (lAAH) or by secondary active cotransport in the anionic form (IAA"). Cell wall Cytosol 2. The cell wall is maintained at an acidic pH by the activity of the plasma membrane H+-ATPase. 3. In the cytosol, which has a neutral pH, the anionic form (IAA") predominates, 4. The anions exit the cell via auxin anion efflux carriers that are concentrated at the basal ends of each cell in the longitudinal pathway. Auxin transport: ABCB proteiny 1. The plasma membrane H+-ATPase (purple) pumps protons into the apoplast. The acidity of apoplast affects the rate of auxin transport by altering the ratio of IAAH and IAA" present in the apoplast. 2. IAAH can enter the cell via proton symporters such as AUX1 (blue) or diffusion (dashed arrows). Once inside the cytosolf IAA is an anion, and may only exit the cell via active transport. 3. ABCB proteins are localized (red) nonpolarly on the plasma membrane and can drive active (ATP-dependent) auxin efflux. 4. Synergistically enhanced active polar transport occurs when polarly localized PIN proteins (brown) associate with ABCB proteins, overcoming the effects of back-diffusion. Auxin gradient Auxin back diffusion PIN protein