Plant Cell Biology Department of Experimental Biology, MU GENOMIKA (GENOMICS) ► Zásadní pro buněčnou a molekulární biologii ► Analýza a manipulace s DNA: ► DNA amplif ikace (pomocí PCR) ► Štěpení DNA (na specifických místech rest r i kč nimi nukleázami) ► Ligace DNA ► Klonování DNA ► Syntéza DNA ► Sekvenování DNA (nebo RNA) ► Hybridizace DNA (nebo RNA) ► Transkriptomika ► Proteomika ► Další „omiky" c DNA replication DNA repair etic recombination DIVA 5 3' 3r 5' RNA synthesis (transcription) RNA 5'..................... 3' protein synthesis (translation) PROTEIN H2N COOH amino acids Jak vyrobit transgenní rostlinu? Kroky při tvorbě transgenní/GMO rostliny 1. Výběr genu (např. z databáze) 2. Navržení klonovací strategie a primerů (= oligos) 3. PCR a klonování genu do plazmidu (= vektoru) ► 4. Transformace E. coli a replikace plasmidu 5. Izolace plazmidu 6. Sekvenování genu (DNA) 7. (Re-klonování do binárního vektoru pro trasformaci rostlin) 8. Transformace Agrobacteria ► 9. Transformace rostlin ► Arabidopsis - "f loral dip" ► Tabák, rýže - techniky tkáňových kultur ► Transientí exprese 10. Selekce transf ormantů fLAKT t€Li Proč vyrobit transgenní rostlinu? Proč vyrobit transgenní rostlinu nebo GMO?^ ► Pro studium exprese a funkce genu ► Kdy a kde je gen exprimován? ► Role promotoru a reportérových genů ► Co se stane, když zvýšíme expresi genu? ► Chemicky regulovatelné transkripční aktivační systém1 ► Co se stane, když snížíme expresi genu nebo jej vyřadíme z funkce? ► amiRNA, CRISPR/Cas9 ► Pro zlepšení vlastností rostlin ► Klasické šlechtění a domestikace divoké trávy teosinte (vlevo) vedly po stovky let k plodině Zea mays (kukuřice, vpravo). Zlatá rýže" byla vyrobena vložením 2 cizích genu zapojených do syntézy p-karotenu (A) Geranylgeranyl-PP ^ Phytoene synthase (B) Golden Rice Phytoene + 2 pyrophosphate ^ crt1 ^-carotene ^ crt1 i Lycopene Lycopene cyclase ct-carotene i ß-carotene ► Go\óer\ Rice je nutričním zdrojem pro-vitaminu A, který zlepšuje imunitní odpověď Člověka na běžná onemocnění a významně snižuje dětskou slepotu, jejíž hlavní příčinou je nedostatek vitamínu A. ► Byla získána již před 20 lety, ale stále je zakázána. Studium genové exprese a funkce ► Klasická genetika začíná mutantem, tedy narušením buněčného proc< náhodnou mutagenezí. ► ► ► Genetické skríninky identifikovaly mutanty se specifickými abnormalitami. ► Byly vytvořeny komplexní knihovny mutantů v různých modelových organism< včetně 5. cerevisiae, C. elegans, Ďrosophila, Arabidopsis a dokonce i myši. Reverzní genetika začíná známým genem a určuje, které buněčné procesy vyžadují jeho funkci. Tento přístup obrací tradiční směr genetického objevování - postupuje od genů k mutacím, tedy reverzní genetikou. 6enom organismu je záměrně pozměněn specifickým způsobem, tento přístup se také nazývá genomové inženýrství nebo editace genomu. ► Zisk funkce (gain of function) ► Ztráta funkce (loss of function), např. amiRNA, CRISPR/Cas9 Technologie rekombinantní DNA Schopnost přesně manipulovat s DNA ve zkumavce nebo v organismu ► Geneticky modifikovaný organismus (GMO): bakterie, houby, rostlina, živočich Techniky rekombinantní DNA umožňují experimentální přechod z genu na protein a z proteinu na gen... Studium genové exprese a funkce ► Klasická genetika začíná mutantem, tedy narušením buněčného proc< náhodnou mutagenezí. ;u ► Genetické skríninky identifikovaly mutanty se specifickými abnormalitami. ► Byly vytvořeny komplexní knihovny mutantů v různých modelových organism< včetně 5. cerevisiae, C. elegans, Ďrosophila, Arabidopsis a dokonce i myši. Reverzní genetika začíná známým genem a určuje, které buněčné procesy vyžadují jeho funkci. Tento přístup obrací tradiční směr genetického objevování - postupuje od genů k mutacím, tedy reverzní genetice. 6enom organismu je záměrně pozměněn specifickým způsobem, tento přístup se také nazývá genomové inženýrství nebo editace genomu. determine amino acid sequence of a peptide fragment using mass spectroscopy X-RAY OR NMR ANALYSIS TO DETERMINE THREE-DIMENSIONAL STRUCTURE BIOCHEMICAL TESTS TO DETERMINE ACTIVITY PROTEIN search DNA database for gene sequence synthesize DNA primers for PCR clone by PCR GENE or cDNA d introduce into E. coli or other host cell to produce protein insert protein- / — coding region of gene into expression vector (from cDNA clone) MANIPULATE AND INTRODUCE ALTERED GENE INTO CELLS OR ORGANISM TO STUDY FUNCTION Reportérové geny odhalují, KDY a KDE je gen exprimován a to je dáno promotorem ► Fluorescenční proteiny (např. 6FP, RFP), GUS ((3-glucuronidase, uidA) (A) 5TARTING DNA MOLECULES normal coding sequence for protein X c/s-regulatory DNA sequences that determine the expression of gene X start site for RNA synthesis coding sequence for reporter protein Y EXPRESSION PATTERN OF GENE X cells 'A B C D E F ■ pattern of normal gene X expression cells ' A B C D E F pattern of reporter gene Y expression ► Transcripční vs translační fúze s FP ► Promotor + FP Promotor + GENE + FP 46e-ll v T 81b * 80e \ ' 1 třřé 466-Í 67e 105d Pv, • ■• •"•TT/ • W * , 1 2iy Promoter EXPA nls eGFP Promoter EXPA At EXP A mCherry ~~|^^ Chemicky indukovatelná genová exprese Regulovaná genová exprese genu v určitém vývojovém stádiu a po určitou dobu, pomoci chemických induktorů, např. pOpó/LhGR systém AC IV TO DNA - transcription binding d. activation d. promoter GR I HSP90 complex i Tkáňově specifické j promotory aktivátoru! X X lac TATA REP operators box Gene of interest Q INDUCER (dexamethasone) RNA pol II DNA I I E Transcription Ph-miRNA I I T Pre-miRNA i-1 Nucleus 1. Primary rniRNA (pri-miRNA) is transcribed, folds into a hairpin structure (pre-miRNA), and is processed. 2. Processed double-stranded (ds) RNA is bound to the RNA-induced silencing complex (RISC), containing the catalytic ARGONAUTE (AGO) protein. RNA interference (RNAi) se používá k umlčování genů „knock - down" mutant i ► short interfering (siRNA) RNAs - exogenous ds RNA Mature 5ÍRNA HASTY (EXPORTIN5) 3. One strand of the dsRNA is removed and the complex is exported into the cytoplasm, where it either degrades the target mRNA or halts its translation. Ribosome The RNAi pathway in plants micro-RNA (miRNA) - single-stranded RNA ► endogenní, z nekódující oblasti RNA ► blokuje translaci genu ► destabilizuje mRNA artifical micro-RNA amiRNA) RNA interference se používá k umlčování gen RNA pol II DNA i r L Transcription ^knock-down" mutant i ► short interfering (siRNA) RNAs - CAC PGR CACC < 3 IX Ei ta 1 > DCL1 amiR Cytoplasm HASTY (EXPORTIN5) 3. One strand of the dsRNA is removed and the complex is exported into the cytoplasm, where it either degrades the target mRNA or halts its translation. The RNAi pathway in plants micro-RNA (miRNA) - single-stranded RNA ► endogenní, z nekódující oblasti RNA ► blokuje translaci genu ► destabilizuje mRNA artifical micro-RNA amiRNA) Bakteriální systém CRISPR/Cas9 byl přizpůsob k editaci genomu různých druhu ~ genetické nůžky ► Schopnost Cas9 (nukleáza) zacílit specifické místo genomové DNA 2020 Nobelova cena za chemii udělena E. Charpentier a J. Ďoudna ► Příklad použití CRISPR/Cas9 ► narušení ORF a vytvoření KO „knock-out" mutanta CRISPR/Cas9 guide RNA fjjy^-mm........Ki ........I I I I I I v 1 I I -i PMílsiH <•"*<•> RAM site Double-stranded DNA break 7K im 11111 m i li ........1111 i i \y Bodová NHEJ^-^*^\^ HDR h mutace TTTTTT-^^O Dun urex Lerr.il DNA III II ill .^j/ x .....i..............l>^N|, .{JyX. .......m............. CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats https: 11 www. youtube. com/watch?v=4YKFw2KZA5o&ab_channel=naturevideo Expected {guideRNA sequence CCCATGTGCAGGTTGTTAACACAAGAC TT TTATAT CACCCAT G Wl GCSGGTT GTTAACACAA GACGT ) 60 a 70 80 91 TRANSKRIPTOMIKA (TRANSCRIPTOMICS) ► Analýza mRNA pomocí: ► microarrays, ► kvantitativní RT-PCR ► nebo RNA-sekvenování (RNAseq) ► poskytuje obraz genové exprese. DNA microarrays se používají k analýze produkce tisíců různých mRNA v jediném experimentu. ► Použití cluster analýzy vede k identifikaci sad genů, které jsou koordinovaně regulovány. mRNA from sample 1 convert to cDNA, labeled with red fiuorochrome mRNA from sample 2 convert to cDNA, labeled with green fiuorochrome HYBRIDIZE TO MICROARRAY \ VASH; SCAN FOR RED AND GREEN FLUORESCENT SIGNALS AND COMBINE IMAGES wound-healing genes cell-cycle genes cholesterol biosynthesis _genes_ small region of microarray representing 676 genes Kvantitativní real-time PCR (RT qPCR) Expresi jednotlivých genů lze měřit pomocí kvantitativní RT-PCR (real time-qPCR) ► Měřená fluorescence je generována barvivem (např. SYBR Green I), které fluoreskuje pouze tehdy, je-li navázáno na dsDNA produkty qRT-PCR. ► např. červený vzorek - vyšší koncentrace mRNA, vyžaduje méně cyklů PCR k dosažení maximální dsDNA ► RT-qPCR se používá v diagnostických aplikacích ► např. COVID-19 PCR testování rare HIV particle in plasma of infected person blood sample from infected person ) -■ EXTRACT RNA RNA REVERSE TRANSCRIPTION AND PCR AMPLIFICATION OF HIVcDNA j—plasma REMOVE CELLS BY CENTRIFUGATION control, using blood from non infected person 1_I_ GEL ELECTROPHORESIS í RNAseq analýza genové exprese RNA fragments obtained from RNA sample Library with adaptors Aligned reads OJ "O .Q £ Ei 3 u_ Sequenced reads (-100 bp long) Genome scaffold I I I I ■ATCGGO ■CCGAT- •GCATTCA- ..... 1 iL JJ_L INI Nucleotide position PROTEOMIKA (PROTEOMICS) ► Klonování DNA umožňuje produkovat jakýkoliv protein ve velkém množství ► DNA sekvence kódující protein jsou naklonovanány do expresního vektoru a transformovány do buněk. ► E. coli - např. produkce inzulínu ► Kvasinkové buňky - např. etanol ► Tabákové buňky BY2 - (Bright Yellow 2, nediferencované meristematické buňky) např. HIV protilátky ► Savčí buňky - např. výroba vakcín expression vector C T promoter sequence CUT DNA WITH RESTRICTION NUCLEASE INSERT PROTEIN-CODING DNA SEQUENCE C INTRODUCE RECOMBINANT DNA INTO CELLS overexpressed mRNA overexpressed protein Purifikace proteinů Buňky mohou být rozděleny Buněčné extrakty poskytují na jednotlivé frakce systémy pro studium centrifugací. buněčných funkcí sag cell homogenate LOW-SPEED CEWTRIFUGATIOrJ t pellet -contains whole cells nuclei f cytoskeletons SUPERNATANT S U EJECTED TO MEDIUM-SPEED CENTRIFUGATION pellet -contains mitochondria lyiosomes * perOKÍEOÍTlEE SUPERNATANT SUBJECTED TO HIGH-SPEED CENJTRIFUGATLON pellet contains microsomes * small vesicles SUPERNATANT SUBJECTED TO VERY-HIGH-SPEED CENTRI FUG AT10 N pellet-contains rib oso rmes viruses * large m aero molecules VELOCITY SEDIMENTATION I CENTRIFUGATION - sample stabilizing shallow - sucrose gradient (e.g., 5-20%) slow-sedimenting component - fast-sedimenting component FRACTIONATION EQUILIBRIUM SEDIMENTATION ►sample steep sucrose gradient (e.g., 20-70%) low-buoy ant-component ».X:!^?.— hEgh-buoyant-density component Proteiny jsou separovány chromatografií ► Purifikované bezbuněčné systémy umožňují přesnou analýzu molekulárních fu ► Geneticky upravené značky (tags) poskytují snadný způsob pro čištění proteinů kcí gene for protein of interest INSERT DNA ENCODING PEPTIDE . EPITOPE TAG 1 INTRODUCE 1 r INTO CELL epitope-tagged protein i rapid purification of tagged protein and any associated proteins COLUMN CHROMATOGRAPHY solvent continuously applied to the top of sample column from a large applied reservoir of solvent i H fractionated molecules eluted and collected I • •• . positively i^— charged + #- bead bound negatively - charged molecule free positively charged • •• - porous bead retarded " small molecule unretarded large molecule \ I 1 •aj i ě bead with covalently attached substrate bound , enzyme molecule (A) ION-EXCHANGE CHROMATOGRAPHY (B) GEL-FILTRATION CHROMATOGRAPHY / \ (C) AFFINITY CHROMATOGRAPHY Proteiny jsou separovány podle velikost ► Separace proteinů pomocí SDS polyacrylamide-gel electrophoresis (SDS-PAGE (A) sample loaded onto gel by pipette cathode e plastic casing (6) protein with two subunrts, A and B, joined by a disulfide bridge © anode buffer 3 2 T3 r+ O 3- 5 z O——O—n—n—n—n—n—n—n—n—n—n—n—n »» fT> II IIXIIXIIIIľĽX Denaturací proteinů a poskytnutím jim záporného náboje je možné je oddělit na základě jejich velikosti, během migrace směrem ke kladné elektrodě. <£—n —n—o i i i i HEATED WITH SDS AND MERCAPTOETHANOL sinctle-subunit protein 3> negativeíy charged SDS molecules ,~. ! POLYACRYLAMIDE-GEL ELECTROPHORESIS slab of Polyacrylamide gel Separace bílkovin na základě velikosti a pl ► Two-dimensional (2D) gel electrophoresis 2D-PAGE bask stable pH gradient acidic Poskytuje lepší separaci proteinů ^ pl = isoelectric point Obrazovou analýzou se\ zjistit počet proteinů exprimovaných, např. v určitých pletivech. Specifické proteiny lze detekovat pomocí protilátek (WESTERN BLOT analysis = immunoblotting) Mass Spectrometry (MS) je vysoce citlivá metoda pro identifikaci neznámých proteinů Proteiny ve vzorku nejprve štěpeny na krátké peptidy proteázou, např. trypsinem! (A) STANDARD MASS SPECTROMETRY (MS) peptide mixture ■ ■ i—ifřvk ion source mass analyzer detector 1SOO 2000 mass-to-c h arg e ratio (m/z) 2500 (EJ TANDEM MASS SPECTROMETRY (MS/MS) 100 peptide mixture ■ .• ll_ MSI inert gas -hr- MS2 •* n_n ion source mass fragmentation mass filter analyzer (precursor ion (product ion selection) analysis) i ;■ detector 8 ta ■n c n IŮ u -■ 200 iL T-1 600 . 1 1000 mass-to-charge ratio {míz) Iontové zdroje závisí na technice matrix-assisted laser desorption ionization (AAALDI). / Ä I ► MALDI je spojen s time-of-flight (TOF) analyzátorem, což je dlouhá komora, kterou jsou ionizované peptidy urychlovány elektrickým polem směrem k detektoru. Jejich hmotnost a náboj určují dobu, za kterou se dostanou k detektoru^ Struktura proteinu muže být stanovena pomocí rentgenové krystalografie (x-ray crystallograph Hlavní technika používaná k objevování 3D struktury molekul v atomovém rozlišení. SSSSasaSS*^ Nuclear magnetic resonance (NMR) spektroskopie, lze použít ke stanovení struktury proteinu v roztoku, není potřeba krystalický vzorek. ► Struktura proteinu a sekvence uložené v databázích poskytují vodítka o funkci proteinu. ► BLAST - program pro zarovnání sekvencí. Fluorescenční mikroskopy a fluorescenční proteiny (FP) Proteiny mohou být fluorescenčně označeny v živých buňkách geneticky kódovaným markerem = fluorescenčním proteinem. O i- ti O 0 O) OJ c