Biologie rostlinné buňky 3. Plasmatická membrána (PM) ► Vnější hranice buněk ► Historie objevu a složení PM ► Izolace PM ► Techniky pro studium struktury PM ► Chemické složení PM - lipidy, proteiny ► Propustnost PM a membránový potenciál ► Typy membránového transportu ► Membránové transportní proteiny ► Kanály, přenašečové proteiny, pumpy ► Aquaporiny Plasmodezmata umožňují volný pohyb molekul mezi ► Výskyt, složení, struktura, permeabilita Hranice buňky ► Plazmatická membrána (PM) odděluje „živý" prostor od prostom „bez života ► PM nesmí být absolutně neprůchodná, ale musí umožnit vstup živin do buňky a vylučování odpadních látek z buňky. ► PM nesmí být ani otevřená, ani uzavřená, ale selektivně propustná. ► PM snímá změny ve vnějším prostředí, tak aby buňka mohla reagovat, ► např. světlo, gravitace, hormony, změny slanosti, opylení, napadení patogť U mnohobuněčných rostlin zahrnuje vnější prostředí také všechny ostatní buňky v rostlině, které jsou propojeny chemickými signály nebo fyzikálními silami! ► Důkaz existence PM: plazmolýza buněk řas (1844) *eny. Plazmatická membrána je vnější hranice buněk ► Plazmatická membrána (PM) = plasmalema ► Obklopuje živou cytoplazmu rostlin, živočichů, hub a bakterií Cytoplazma = všechny organely + cytoskelet v cytosolu. Cytosol = ve vodě rozpustná a koloidní fáze uvnitř PM (ale nezahrnuje nukleoplazmu). Rostliny (a houby) mají buněčnou stěnu! Protoplast nemá BS! Tubular smooth endoplasmic reticulum Cisternal rough endoplasmic reticulum Cortical microtubules Nucleus Cortical actin microfilament Peroxisome Chloroplast Primary wall Middle lamella Golgi body 1 Plasmodesmata Transvacuolar strand Compound middle lamella R i bosom es Plasma membrane Oil body Mitochondrion Plasmatická membrána rostlinných buněk ► Nachází se těsně pod buněčnou stěnou TEM, cryofixed plant cells Objevy složení PM Wilhem Pfeffer (1877) pojmenoval PM; protože se PM barvila jódem nebo rtutí, dospěl k závěru, že se skládá, alespoň částečně, z proteinů.\M V roce 1899 Ernest Overton zkoumal propustnost živých rostlinných a živočišných buněk (včetně kořenových vlásků, vláken řas, svalových buněk a červených krvinek) pro asi 500 sloučenin a přišel se sérií zobecnění, někdy nazývaných Overtonova pravidla. ► Ze svých studií plazmolýzy zjistil, že cukry, aminokyseliny, neutrální soli organických kyselin a glycerol se sotva dostávají do živých buněk, zatímco alkoholy, aldehydy, ketony a uhlovodíky rychle pronikají. ► Došel k závěru, že přítomnost nabité nebo polární funkční skupiny (COO", OH, NH2) v chemické látce snižuje její schopnost pronikat do živých buněk. Overton dále ukázal, že barviva, která byla rozpustná v lipidech, pronikala buňkou rychleji než ta, která nebyla, což dokazuje, že PM musí být složeny z lipidů. Mikrofotografie zmrazené frakce PM mezofylové buňky (1980). Měřítko 100 n m. O 100 let později!!! Ceil wall Biologické membrány jsou fosfolipidové dvojvrstvy, které obsahují proteiny ► Model fluidní mozaiky: všechny biologické membrány se skládají z dvojité vrstvy (dvojvrstvy) lipidů, do které jsou zabudovány proteiny. Plasma membrane Hydrophilic region Hydrophobic -< region Hydrophilic region ► Fosfolipidy jsou nejvýznamnejsimi lipidy v rostlinných membránách Proteiny: 3 hlavní typy ► Integrální ► Periferální ► Ukotvené (anchored) > Phospholipid bilayer Cytoplasm Integral protein Izolace PM Ve většině buněk PM tvoří méně než 5 % buněčných membrán. ► Proto musí být oddělena od všech ostatních membrán v buňce. Rostlina se musí homogenizovat, přefiltrovat a zcentrifugovat ► aby se odstranily celé buňky a buněčné stěny a ► organely se oddělily na základě rozdílných rychlostí sedimentace Filtrát se odstřeďuje při 10 000 g 15 min, aby se získal supernatant bez jader, plastidů a mitochondrií. Supernatant (malé částice) se centrifuguje při 100 000 g 30 min, aby se oddělily membrány od většiny cytosolických proteinů. Pelet se resuspenduje a PM se izoluje pomocí: ► (A) centrifugace s vyvážným hustotním gradientem (equilibrium density-gradient), např. sacharóza ► (B) vodní dvoufázové dělící centrifugace (aqueous two-phase partitioning), např. dextran je hydrofilnější, polyethylenglykol (PEG) je hydrofóbnější ► (C) elektroforéza s volným průtokem (free-flow electrophoresis) rozdělení podle různé hustoty náboje ► Jedním z principů buněčné biologie je analyzovat vlastnosti (PM) in vitro a použít je k pochopení vlastností in vivo/ (B) (C) 1.14g/mL 1.16g/mL Techniky pro studium struktury PM Pohyby membránových molekul (rychlost laterální difúze) lze pozorovat technikou známou jako fluorescence recovery after photobleaching FRAP. ► Fluorescenčně značené molekuly po vybělení difundují zpět. ^ -íjf--ijí-^ ^ ^ ^ -íjí- -íjř- -íff- -tjí- MIMI I M I HI BLEACH WITH LASER BEAM UMU I II I I H L .1 bleached area RECOVERY ■íjf-^ cp -jji- -íjf- ^ cp -Sjf- ^Jf- y -iff-lllllllllllll Mobilitu jednotlivých proteinů PM lze také pozorovat pomocí techniky single* particle tracking, závisí na počítačově vylepšené mikroskopii. Je termodynamicky nepravděpodobné, že by lipid nebo protein přecházely^ jeckié , vrstvy do druhé „flip-flop" (vysoká energetická potřeba k vytvoření kontaktu mezi I hydrofilními a hydrofobními molekulami). ► Pohyb lze monitorovat značením membránových molekul molekulou, která obsahuje nepárový elektron (tj. spinovou značkou, a spin label), a pozorovat jej pomocí elektronového spinového rezonančního spektrometru. Chemické složení PM - lipidy ► Membránové lipidy tvoří asi 30 % hmotnosti PM ► fosfolipidy, glykolipidy a steroly ► Amf i f Hni molekuly: hydrofilní „head" hydrofobní „tail" ► Amfipatická podstata membránových lipidů umožňuje spontánní tvorbu dvouvrstev: shape of molecule packing of molecules in water water MtMMIMt """MJP mm IMIIIIIHM micelle lipid bilayer ENERGETICALLY UNFAVORABLE lanař phospholipid bilayer with edges exposed to water pi X w C sealed compartment formed by phospholipid bilayer ENERGETICALLY FAVORABLE Chemické složení PM - fosfolipidy a glykolipi Phospholipidy obsahuji molekulu glycerolu s fosfátovou skupinou připojenou přes esterovou vazbu k jednomu uhlíku a dvěma uhlovodíkovým (mastným kyselinám) ► K fosfátové skupině je připojena proměnná skupina (serin, cholin, inositol),hydrofilní vysoce polární oblast ► Mastné kyseliny, hydrofobní nepolární oblast Glykolípídy jsou polární, obsahují jednu nebo více cukerných skupin. ► Buď glycerolová kostra (glyceroglykolipidy) nebo sfingosinovou kostra (sfingolipidy). V PM plastidech jsou lipidové složky téměř zcela deriváty ga laktózy (galaktolipidy) Galactose Glycerol O CH,—CH —CH. II O O c=o c=o Glucose Sphingosíne OH O .1 , 1] CH — CH —CH, ľ I CH NH II I CH C = 0 Fatty acid - 1 Fatty acids Phospholipid r~ Fatty acids Ga I acto sy I g lyce ride Glucocerebroside r H3C H3C^| H 1 ^H Hydrophilic-i region H o- H, is Hydrophobic - Cytoplasm Vacuole Plasmodesma Plasmodezmata a související buněčné stěny ► Primární plasmodezmata se tvoří během buněčného dělení v primární B ► Sekundární plasmodezmata se vytvoří, po dokončení buněčného dělení primární a sekundární BS, natrávením malých oblastí BS enzymy a PM sousedních buněk a spojí se za vzniku kanálku. ► ER je také spojeno a prochází skrz, tvoří tzv. desmotubule. Primary simple Middle plasmodesmata lamella Vacuole Nucleus Endoplasmic reticulum Secondary Primary wall Plasma membrane Primary branched plasmodesma Secondary branched plasmodesma mary simple plasmodesmata Jednoduchá plasmodezmata = jeden kanál Větvená plasmodezmata = spojená dohromady Výskyt a složení palsmodezmat ► jsou trubicovité, membránou lemované kanály 40-50 nm. ► Vyskytují se u všech hlavních skupin rostlin od řas až po vyšší rostliny, podobná struktura. Distribuovány buď rovnoměrně po celé buňce, nebo se vyskytují v agregátech. Počet a hustota v buňce jsou přesně určeny, ale mohou se v průběhu času měnit. ► VE zralosti ztrácejí průduchy a tracheami elementy všechna plasmodesmatální spojení se sousedními buňkami! ► Obsahují proteiny: ► protein podobný connexinu (po celé délce), myosin, aktin, proteinkinázy, protein vážící kalózu a další. ► Obsahují lipidy: často mohou být přítomny jako lipidové rafty. Nemají celulózovou syntázu, PM H+-ATPázu a aquaporiny. Struktura plasmodezmat ► ► Vystlány PM a cytoplasmou, uvnitř je ER (desmotubule). Vnější proteiny desmotubule a vnitřní povrch PM jsou spojeny vláknitými proteiny (paprsky) rozdělujícími cytoplazmatický rukáv na mikrokanálky. Ventilovité nástěnné límce, složené z polysacharidu kalózy, obklopují hrdla kanálku na obou koncích a slouží k omezení velikosti pórů (depozicí kalózy uzavření, degradace =otevření). Cytoplasmic sleeve Desmotubule Cell wall Wall collar Cytoplasm Central rod Lumen of endoplasmic reticulum Spoke protein Plasma membrane protein Plasma membrane Plasma membrane protein Spoke protein Desmotubule Central rod Desmotubule protein Wall collar Permeabilita plasmodezmat ► Nízkoodpórová dráha mezi buňkami, kterou mohou velké hydrofilní molekul] cestovat rychleji, než kdyby musely projít skrz PM. Hydrofobní molekuly mohou také procházet jejich lipidovými dvojvrstvami. ► Přibližně 10 OOOkrát propustnější než PM pro barviva s molekulovou hmotností menší než 700 Da, pro > 1000 Da, propustnost stejná jako PM. Změny během vývoje buňky, regulované tlakem, intracelulárním Ca2+\ aktinovými mi krofi lamenty. Pohyb proteinů přes plazmodesmata může vyžadovat, aby se protein rozvinul a znovu se složil při výstupu. ► Také plasmodezmatální proteiny mohou změnit konformaci pomocí molekulárních chaperonových proteinů (zvýší se limit velikosti vyloučení). 1 Viry a další patogeny (napr. houby) se mohou siřit z buňky do buňky prostřednictvím plasmodezmat ► (viry modifikují a rozšiřují průměr na 60-80 nm), small RNAs, virová DNA .