4. Endomembránový systém a transport ► Definice a hlavní směry transportu ► Endoplasmatické retikulum (ER) - drsné a hladké ER, izolace E ► Funkce ER ► ER proteiny obsahují signální peptid (sp) ► Golgiho aparát (GA) - objev, struktura, polarita ► Funkce G A ► Vakuola - objev, struktura, biogeneze, složení ► Vacuolar sorting signál ► Funkce vakuol ► Intracelulární membránový transport ► Sekreční a endocytická dráha ► Vezikulární transport - Rab, SNARE, PIP proteiny ► Transport z PM a z BS ► Objev a studium transportu PCR ? SI \ *__-? Nl / *?/ ? Endomembránový systém a transport ► Endoplasmatické retikulum (ER) tvoří základ endomembránového systéi ► Endomembránový systém = membrány a organely (jaderný obal, PM, G; vakuoly, endosomy...) které si vyměňují molekuly buďlaterální difúzi nebo transportem specializovaných vezikul = endomembrane trafficking] ER-plasmodesma (desmotubule) Cell wa Plasma membrane Transvacuolar strand 71 ER-tonoplast . ER-chloroplast ER-peroxisome ER-mitochondrion ERES = ER exit sites ER-golgi (ERES) ER-oil body Internal ER ER encircling mitochondrial fission site ER-plasma membrane Cortical ER ER je také vstupní branou do sekreční dráhy (secretory pat Endomembránový systém a transport ► Kortikální ER je napojeno na PM, prochází plasmodesmaty (desmotubulel ► Vnitřní ER se prochází transvakuolárními kanály; ER je kontinuální s jaderným obalem; ER je spojeno s Golgiho aparátem, mitochondriemi, chloroplasty, peroxisomy a olejovými tělísky. ER-plasmodesma (desmotubule) Cell wall Plasma membrane Transvacuoíar strand ER-tonoplast , ER-chloroplast Nucleus / ER-nuclear envelope gates (coextensive) ER-peroxisome ER-mitochondrion ERES = ER exit sites ER-golgi (ERESK ER-oif body Internal ER ER encircling mitochondrial fission site ER-plasma membrane Cortical ER ► ER je také vstupní branou do sekreční dráhy (secretory pathway) Studium membránového transportu v praxi Kirchhelle et a/., Developmental Cell, 2016 Chow et a/., Plant Cell, 2008 Hlavní směry endomembránového transportu Nuclear envelope I Anterograde Plasma membrane/ cell wall Exocytosisl Endocytosis Endoplasmic reticulum (ER) transport t Golgi ' Retrograde transport apparatus Golgi-associated frans-Golgi network (TGN) Free frans-Golgi network (TGN) Endocytosis Multivesicular body (MVB) Multivesicular body (MVB) Storage vacuole Lytic vacuole ► Klasická sekreční dráha: ER -> GA -> BS nebo vakuola ► Anterograde transport ► Endocytická dráha ► Retrograte transport Evoluce a objev endomembránového systém Eukaryotická rostlinná buňka je přibližně 1000x větší než původní prekurzor. ► nemožné provádět všechny požadované procesy pouze na PM. S vývojem větších buněk, docházelo k invaginaci PM, odštěpení a vytvoření měchýřků (vezikul) vázaných na membránu. Všechny vnitřní membrány, souhrnně známé jako endomembránový systém (ER, Golgiho aparát, vakuolární kompartmenty, vesikuly). i ► ER se zahrnuje více než polovinu všech membrán buňky. Integrovaná studie kombinující elektronovou mikroskopii a biochemii vedla k Nobelově ceně udělené George Paladeovi (1975) za objevy oblasti strukturální a funkční organizaci buňky. ER viděno 1 elektronovoui mikroskopií v 1940th (left) 6t řezy pomocí I ultramicrotomu v 1950th (right). ER tvoří síť vnitřních membrán ► ► ER je komunikační síť mezi organelami v buňce ER je velmi dynamické a mění se během vývoje buňky a v průběhu buněčného cyklu ► Lze barvit lipofilním, aniontovým, fluorescenčním barvivem, DiOC6 (č/b obrázek) nebo značit fluorescenčními proteiny sp GFP HDEL ER tvoří síť vnitřních membrán ER je hlavním zdrojem membránových fosfolipidů a poskytuje proteiny další náklad (cargo) pro komponenty endomembránového systému. ► ER je místem syntézy a dodávání lipidů a proteinů. ► ER se skládá z rozsáhlé sítě tubulů a zploštělých cisteren. Tubule triple junction 3D rekonstrukce ER v suspenzních kulturách tabákových buněk ► Kortikální ER těsně pod, možná připojené k, PM; pokud je odděleno, je vnitřní ER. Reticulony ~ proteiny, které tvoří ER tubuly z membránových listů při expanzi buňky Drsné a hladké ER (rough and smooth ER) (A) Rough ER {surface view) polyribosome = strings of ribosomes (C) Smooth ER (tubules in cross section) a* 500 nm 100 nm Drsné ER (rough ER, RER) má na rozdíl od hladkého ER (smooth, SER) mnoho membránově vázaných ribozomů ► Drsné ER - cisternové ► Hladký ER - trubicovité Většina ER má schopnost vázat ribozomy, protože ER obsahuje translocony (slouží k translokaci peptidů skrz membránu) (B) Rough ER {stacked cisternae in cross section) ŕ 3 100 nm Isolace ER (RER a SER) Homogenizace a poté centrifugace v gradientu hustoty sacharózy. ► Zahrnutí EDTA k chelataci iontů Mg2+ pomáhá izolovat čisté membrány ER. ► Kontrola čistoty pomocí markerové enzymy (často cytochoromy) např. spektrofotometricky měřením enzymové aktivity. rough ER oOo homogenization j*. S% ' rough and smooth microsomes smooth 0 n ER 16% sucrose centri-fugation OOO oo 000 48% ^1 Hustota okolí odpovídá hustotě organel smooth microsomes have a low density and stop sedimenting and float at low sucrose concentration rough microsomes have a high density and stop sedimenting and float at high sucrose concentration (B) sucrose tube with gradient of increasing sucrose concentration Funkce ER - syntéza proteinu a lipidu ► První krok v biosyntéze membrán začíná na ER, kde jsou syntetizovány ► proteiny (RER) ► lipidy (hlavně SER). ► Strukturální specializace vyplývá z funkce! ► Syntéza proteinů - proteiny se sp jsou translatovány na ER ribozomech ► Proteiny syntetizované na ribozomech připojených k ER ► importovány do ER hned když jsou syntetizovány = kotranslačně ► Proteiny syntetizované cytosolickými ribozomy vstupují do ER posttranslačně Rough ER (RER) t. n • '»» Smooth ER (SER) ER proteiny obsahují signální peptid (sp) ► Syntéza proteinů - proteiny se sp jsou translatovány na ER ribozomech ► Signální peptid je hydrofobní sekvence (18-30aa), zodpovědná za translokad proteinů do ER; obsahuje specifické místo pro štěpení signální peptidázou ► A signal recognition^ particle (SRP) V_yM|- Ribosome NH2 terminus of nascent protein Translocon ^ „ srp receptor^ Lumen ► tvořená proteinem a RNA ► váže se na signální peptid a ribozom, čímž přeruší translaci, dokud není rozpoznána ER membránovými SRP receptory a translokony\ skrz které je nový protein provlečen Gunter Blobel získal Nobelovu cenu (1999) za fyziologii a medicínu, když ukázal, že nově syntetizované proteiny mají zabudovaný signc sp a KDEL proteinové sekvence tm GFP HDEL mRNA SRP Translocon (closed) ER lumen Higher H-concentration (lower pHi, peptide binding Missorted KDEL ER-resident peptide protein n-;-Gr»Et|i network KDEL receptor ER-to-Golgi transport rv\ vesicle Lower H concentration {higher pHJ, peptide release COP II coat - Retrieval of ^^^SxiwJJ KDEL-bearing (glukóza)^ přidán k aminoskupině asparaginu (N): sekvence aminokyselin N-X-Ser/Thr Tak vznikají N-vázané glykoproteiny - proteiny s kovalentně vázanými cukernými řetěz pomocí enyzmu oligosacharyltransferázi oligosaccharyJ transferase CYTOSOL ER LUMEN lipicMinked oligosaccharide anchored in ER membrane \ protein with A/-glycosylation site Než nově vytvořený glykoprotein opustí ER, odštěpí se 3x glukózový (a 1 mannózový) zbytek, čímž vzniká glykoprotein s vysokým obsahem manózy. Funkce ER ► Syntéza lipidů - ER produkuje většinu lipidů potřebných pro syntézu membP ► tvorba fosfatidylcholinu z molekuly glycerol-3-fosfátu (z cytosolu), molekuly CDP-cholinu a dvou mastných kyselin-koenzymu A (z plastidů) ► K syntéze dochází na cytoplazmatickém straně) membrány ER (hladké, flippasy (fosfolipidové translokátory specifické pro skupinu „hlavy") je mohou „překlopit" přes membránu (1/100 s) ► Regulace obsahu Ca2+v cytosolu ► ER, stejně jako PM, pomáhá řídit iontové složení cytosolu. ► ER má Ca2+ATPázu pumpující Ca2+z cytosolu do lumenu ER ► Calreticulin je protein vázající Ca2+ s nízkou afinitou a vysokou kapacitou (až 25 molekul vápníku!) ► Syntéza fenylpropanoidů a flavonoidů Fenylpropanoidová dráha zapojená do syntézy flavonoidů je součástí rostlinné aromatické dráhy s hlavními enzymy zabudovanými v ER. ► Enzymy spojené s cytosolickou stranou membrány ER. ► Syntetizované flavonoidy jsou uloženy ve vakuole. ► Začíná aa fenylalanin, který je prekurzorem fytoalexinů (obranných med flavonoidy (barvy rostlin); lignin; kumarin (vůně čerstvě posekané trávy). ATP ADP + P, Objev Golgiho aparátu (GA) Camillo Golgi (1898) vizualizoval síťovité retikulum vláken v Purkyňových buňkách sovy, nazval to „internal reticular apparatus" GA má polymorfní vzhled, i mnoho názvů, např. v rostlinách diktyozóm (dictyosome) ► U obratlovců se GA obvykle jeví morfologicky jako vláknitá síť, zatímco u bezobratlých a rostlin se jeví jako samostatné prvky. ► Až v 1957 bylo dokázáno, pomocí elektronového mikroskopu, že rostliny mají GA! Kazda tečka = N Rostlinná bunka Struktura G A ► Golgího aparát se skládá ze všech Golgi tělísek (Golgi stacks) v buňce! ► Architektura GA se liší od buňky k buňce a v průběhu života buňky:\ ■ ► až 100 Golgiho tělísek v Golgiho aparátu (meristémové buňky). ► Typicky 4-7 zploštělých cisteren (< 20 pozorovaných) nebo 1-2 u řas a hub ► Golgiho tělísko je polární seskupení cisteren: \ V ► c/s strana (plošší cisterny) a trans strana (zahrnuje trans Golgi network, TGN). Elektronová mikroskopie, barvení zinc iodide-osmium 2D tomograf ický model GA je organela, která vykazuje polaritu ► cis strana ~ dynamické asociace s ER prostřednictvím vezikul a tubulárních s trans strana ~ TG N z/do různých destinací, včetně PM, vakuol ► typicky anterográdni (anterograde) pohyb cis-to-trans ► také retrográdní (retrograde) pohyb z trans-to-cis\ ► Polarita GA je zachována, ► přestože membrány neustále protékají! trans Golgi network (TGN) trans cisternae medial cisternae cis cisternae COP la vesicle flp COP II vesicle Golgi —> ■ - * COP II coat /'"-•'^COP II scaffold ■ >í^8*f" cop lb vesicle Golgi-associated TG N FroeTGN \ ffl I w |tGN separation 0.5 [JIT Golgi scaffold/ matrix TG N scaffold Residual membrane fragment with scaffold Clathrin-coated vesicle Secretory vesicle with scaffold with scaffold Funkce GA = továrna na sacharidy ► GA jsou pohyblivé organely, které využívají aktomyosinový systém. ► Mnoho buněk rostlin a hub má specializovaný typ polarizovaného růstu (tip growth), kde jsou vezikuly odvozené od GA směřovány do jediného místa. ► Golgiho tělíska se mohou dělit štěpením nebo se mohou vytvářet z ER. ► Jejich počet reguluje sekreci během růstu a diferenciace. ► Různé cisterny v jednom Golgiho těle mají různé enzymy. ► Zpracovávají polysacharidy pro BS nebo glykoproteiny pro BS a vakuoly. ► např. modifikace N-vázaných glykoproteinů, glykosylace -OH skupin hydroxyprolinu, serinu, threoninu a tyrosinu (O-vázané oligosacharidy) O Glc OGIcNAc □f)1,4-Gal <]«1,6-Fuc 4a1,3-Fuc O Man ONeuAc □ [M,3-Gal <«1,4-Fuc 0(31,2-Xyl Glykoproteiny a polysacharidy určené k sekr jsou zpracovávány v GA ► Zpracování sekretovaných i jiných glykoproteinů ► Vysokomannosové glykoproteiny z ER a jejich oligosacharidy jsou dále zpracovávám různými glykosylázami za vzniku komplexních glykoproteinů. O-vázané glykosylační reakce připojují cukry k hydroxylové (OH) skupině Ser nebo T\ např. proteiny bohaté na arabinogalaktan v BS ► Např. enzymy degradující BS při abscisi, hydrolázy potřebné při klíčení a trávicí enzymy u hmyzožravých rostlin ► Syntéza sacharidů a jejich sekrece do BS ► V rostlinách jsou hlavními sekrece produkty téměř všech buněk komplexní polysacharidy, včetně pektinů a hemicelulóz, které jsou vylučovány do BS ► komplexní polysacharidy: rozvětvené, složené z > 12 různých monosacharidů, což naznačuje, že mohou být potřeba stovky specifických glykosyltransferáz ► enzymy jsou lokalizovány odděleně v různých cisternách a vezikulách GA ► Např. pektiny jsou iniciovány a prodlužovány v c/s-Golgiho cisternách, methyl esteri f i kovaný v mediálních Golgiho cisternách a postranní řetězce jsou přidány v frons-Golgiho cisternách ► Transport cukrů z cytosolu ► GA obsahují transportéry (dolicholy nebo proteiny), které přenášejí nukleotidy aktivované cukry (schopné účastnit se glykosylačních reakcí) do lumenu GA Objev vakuol ► ► Kontraktilní vakuoly („stars") byly poprvé pozorovány u prvoků v 18. století. Matthias Schleiden (1842) pozoroval, že většina rostlinných buněk obsahuje nápadnou centrální oblast, která se ve světelném mikroskopu jeví jako prázdná, z latiny vacuole = „prázdná" 1 ► Vakuolární šťáva (vacuolar sap) (voda a rozpuštěné látky) uzavřená^ propustnou vakuolární membránou (tonoplast). Hugo de Vries (1880) pozoroval epidermální buňky Tradescantia a všiml si že buněčné stěny se vyboulily, když byly buňky umístěny do čisté vody. Struktura, biogeneze a dynamika vakuol ► ► Vakuolární systém = všechny vakuoly obsažené v buňce během vývoje. Vakuoly se liší velikostí a vzhledem, např. jedna centrální vakuola vs. mnoho malých vakuol v meristematických buňkách v v. w Vakuolární systém kořenových buněk ječm Většina vakuol se tvon z membrán TGN. zbarvených neutrální červení (neutral red). Nově vytvořené vakuoly se spojí (MVB, multi'-vesicular bodies) a vytvoří větší vakuoly. Provakuola (nebo fagofor) se může tvořit de novo z PM např. během fagocytózy. ► Minimálním požadavkem je syntéza tonoplastu (vakuolární membrány), který obsahuje transportéry nezbytné ke zvýšení osmotického tlaku v lumenu. Vakuoly se mohou tvořit také přímo z ER, tzv. protein-body ER, dává vzniknout přímo vakuolám pro ukládání proteinů. Složení vakuol Nespecifické hydrolytické enzymy, které mají typicky kyselé pH optimum, ► např. proteázy, esterázy (např. fosfatáza), fosfodiesterázy (např. RNáza a DNáza) a acylesterázy (např. lipáza). ► a-mannosidáza se používá jako marker Lipidy vakuolární membrány jsou podobné, ale ne totožné, s ostatními membránami. ► podobná funkce bariér Transport přes vakuolární membránu ► Proton-translokační pumpy (V-ATAáza, H+-PPáza ) ► ABC transportéry (neboli transportní ATPázy) ► Vakuolární kanály ► Vakuolární přenašeči Vacuolar sorting signals (VSS) ► VSS (žlutý box) - odstraněn z pro-peptidů post-translačně, když je^ dopraven do vakuoly. ► Může být N-terminálni (ntVSS), C-terminální (ctVSS) nebo interní VSS. Někdy VSS není odstraněn (unremoved VSS), potom je exponován na\ povrchu složeného proteinu a může být tvořen různými částmi polypeptidu sp ntVSS SP SP internal VSS SP unremoved VSS ctVSS ► Signal peptide (sp) - u všech sekrečních proteinů nezáviste na finální lokaci ► odstraněn co-translacněll ► nemá vliv na vacuolar sorting Vakuoly mají v rostlinných buňkách různé funkce p Vir. ► Role v expanzi buněk - až 95 % celkového objemu buněk, typicky >60 % ► umožňuje rostlině dosáhnout velké rozměrů s minimální investicí do energeticky náročných sloučenin (celulóza, nebo proteiny), místo toho je vakuola naplněna vodou ► velká centrální vakuola vytlačuje cytoplazmu do stran, kde je vzdálenost od atmosféry (02, C02) k chloroplastu nebo mitochondriím minimální ► Role v generaci turgoru ► V důsledku přítomnosti rozpuštěných látek v buňce, rozdílné permeability PM a tuhosti BS, voda vstupuje do buněk a vytváří turgorový tlak: je hnací sílou pro další expanzi a formování buněk. Rostliny rostoucí v prostředí s vysokým osmotickým tlakem (daný přítomností solí) musí produkovat dostatečný osmotický tlak ve svých buňkách, aby umožnily příjem vody nezbytné pro život a růst. ► V závislosti na buňce glycerol, trehalóza, betainy a prolin mohou zvyšovat osmotický tlak cytosolu nebo organely. Osmotický tlak vakuoly a cytoplazmy musí být stejný. ► Složky, které obvykle nejvíce přispívají k osmotickému tlaku vakuoly, jsou Na+, K+ a Cľ Sk Vakuoly mají v rostlinných buňkách různé funkce Proteolýza a recyklace '<^^^| ► Lytické vakuoly ~ role v přeměně proteinů na aa, které jsou recyklovány. ► Autofagozómy ~ specializované lytické vakuoly spojené s programovanou buněčnou smrtí (autofagie při hladovění, buňky recyklují vlastní protoplazmu)! ► Selektivní autofagie umožňuje recyklaci dysfunkčních proteinů a organel (jako jsou chloroplasty poškozené UV světlem nebo peroxisomy H202). ► Skladovací prostor a homeostáze ► udržování buněčné homeostázy (ionty, voda a aminokyseliny) ► udržují hladiny organických a anorganických molekul (mohou být toxické) ► udržují rovnováhu vody s cytosolem, aby mohly probíhat enzymatické reakce ► Vakuoly jsou typicky kyselé (pH 5), zásobárna H+ ► pro regulaci pH mohou být zásadité (výměna Na+/H+) ► Skladování živin (P04, ionty, aa, cukry, malát) ► sekundárních metabolitů (alkaloidy) ► pigmentů (anthokyaniny) ► bílkovin = protein bodies v semenech Intracelulární membránový provoz CYTOSOL NUCLEUS PEROXISOMES I ENDOPLASMIC RETICULUM GOLGI LATE ENDOSOME LYSOSOMÍ EARLY ENDOSOME SECRETORY VESICLES CELL EXTERIOR KEY: - gated transport = transmembrane transport = vesicular transport Vesicular trafficking Transportní vezikuly vyrazí z jednoho oddělení (donor) a spojí se s druhým (target). Vezikuly přenášejí materiál (cargo) z lumenu, stejně tak jako membránu z dárcovského do cílového oddělení (compartment). Procesy pučení (budding) a fúze. Proteiny i lipidy si zachovávají svou orientaci!!! lipid bilayer , membrane protein lumenal contents DONOR COMPARTMENT BUDDING FUSION budding vesicle with contents selected for transport transport vesicle in cytoplasm TARGET COMPARTMENT Sekreční a endocytická dráha "cestovní mapa" ENDOPLASMIC RETICULUM CYTOSOL I GOLG1 I LATE ENDOSOME I VACUOLE EARLY ENDOSOME I RECYCLING 1 ENDOSOME 1 r EXTRACELLULAR SPACE I EXTRACELLULAR SPACE plasma membrane SECRETORY VESICLES nuclear envelope endoplasmic reticulum plasma membrane ► Sekreční dráha (secretory pathway) červené šipky ► Endocytická dráha (endocytic pathway) zelené šipky ► Zpětný tok komponentů (retrieval) modré šipky Fusion vs Fission ~ nová membrána se může oddělit od stávající membrány!!! Vesikulární přenos je zprostředkovaný ^ 3 typy obalových proteinů (coat) ► clathrin-coated vesicles COPI-coated vesicles Anterogate transport (COPII) Retrograte transport (COPI) Membrane recycling (clathrin) COPII-coated vesicles The assembly and disassembly of a clathrin coat $ Fission! donor membrane Sil [A * COAT ASSEMBLY AND CARGO SELECTION cargo molecules BUD FORMATION membrane-bending and fission proteins VESICLE FORMATION Prior to fusion UN COATING 1. COPII-coated vesicles bud from the ER and are transported to the as face of the Golgi apparatus. 2. Cisternae progress through the Golgi stack in the anterograde direction, carrying their cargo with them. 3. Retrograde movement of COPI-coated vesicles maintains the correct distribution of enzymes in the as, medial, and trans cisternae of the stack. 4. Uncoated vesicles bud from the trans Golgi membrane and fuse with the plasma membrane. 5. Endocytotic clathrin-coated vesicles fuse with the prevacuolar compartment. 6. Uncoated vesicles bud off from the prevacuolar compartment and carry their cargo to a lytic vacuole. 7. Proteins destined for lytic vacuoles are secreted from the trans Golgi to the prevacuolar compartment via clathrin-coated vesicles, and then repackaged for delivery to the lytic vacuole. 8. Endocytic clathrin-coated vesicles can also uncoat and recycle via the early recycling endosome. Vesicles produced Plasma membrane u Early recycling endosome \ ) ® Cldthrin HS COPI prevacuo|ar v compartment | Lytic vacuole Rough endoplasmic reticulum Anterogate transport (COPII) Retrograte transport (COPI) Membrane recycling (clathrin) Transport uvnitř endomembránového systém ► ► ► ► Sekrece proteinů z buněk začíná v hrubém ER, v ERES (ER exit sites) Pohyb vpřed (anterograte) z ER, do Golgiho, od cis k trans přes cisternám zráním (cisternal maturation), k PM nebo prevakuolárním strukturám. ► Existuje klesající pH gradient organel ER (pH7,5) vakuoly (pH 6). Některé rezidentní proteiny v lumenu ER mají K/HDEL sekvenci, proteiny vázané na membránu mají KK nebo KXK. ► Tyto 3 sekvence jsou rozpoznávány receptorovými proteiny v cis Golgi, vazba na něj umožňuje retrográdní transport zpět do ER. Některé proteiny nikdy neopouští GA (neví se jak). Zpětný pohyb (retrograde) recyklace membránových vezikul z PM, z trans do cis membrány GA, nebo z GA do ER. clathrin-coated retrieval vesicle Golgi frans Golgi cisterna network immature secretory vesicle mature secretory vesicle (A) CARGO CONCENTRATION vesicular tubular cluster or Golgi apparatus soluble ER resident protein empty KDEL receptor secretory protein KDEL receptor protein soluble ER resident protein (A) (B) cis cis, medial, and trans Golgi trans Golgi Golgi network cisternae network Rabs navádějí transportní vezikuly k jejich cílov Rab proteiny a Rab efektory nasměrují vezikuly do specifických míst na správné cílové membráně._ ane cargo receptor cargo RAB, je GTP vázající protein s isoprenoidní kotvou, která se vloží do membrány vezikuly s daným v-SNARE a poté se váže na specifický receptor v cílové membráně s daným t-SNARE. Rabs jsou malé GTPase (A.t. cca 96) ze super rodiny Ras, která zahrnuje také Arf, Ran, Ras & Rho. target membrane trans-SNARE complex Rabs navádějí transportní vezikuly k jejich cílov ane ► SNARE proteiny a jejich regulátory zprostředkovávají fúzi lipidových dvojvrsB ► Ke specifickému cílení dochází, protože každá vezikula má specifický v-SNAR| a každá cílová membrána (target) má 3 specifické t-SNARE, které umožňují dodání na správné místo a ve správný čas. homotypic membrane STEP 1 STEP 2 Po spojení v-SNARE a t-SNARE se vezikula spojí s cílovou membránou, ► GTP je hydrolyzován Rab-GTPázou na GDP ► dojde k uvolnění Rabu... Fosfoinositidy (phosphoinositides) označují organely a membránové domény ► Ačkoli inositol-fosfolipidy tvoří méně než 10 % celkových fosfolipidů v membráně, mají důležitou regulační funkci. ► Mohou podstoupit rychlé cykly fosforylace a defosforylace v polohách 3', 4' a 5' jejich hlavových skupin inositol-cukrů za vzniku různých typů fosfoinositidů (fosfatidylinositol-fosfátů nebo PIP). ► Vzájemná konverze fosfatidylinositolu (Pl) a PIP je vysoce kompartmentalizovaná: ► různé organely v endocytické a sekreční dráze mají odlišné sady PI a PIP kináz a PIP fosfatáz. constitutive exocytosis KEY: PI(3)P PI{4)P PI(4,5)P, PI(3,5)P, PI(3,4,5)P Transport z PM do endomembrány Endocytóza ~ buňky pohltí malé objemy vnějšího média a internalizují PM (např. fagocytóza, pinocytóza atd.), ► přebytečná nebo PM stará membrána je buď recyklována odesláním zpět do PM, GA, nebo je znehodnocena odesláním do vakuoly. ^^^^ l_1 0.1 nm Transport makromolekul do rostlinných buněk různými mechanismy plasma membrane CYTOSOL O CYTOSOL ► Fluid-Phase Endocytosis ► Klasická cesta: PM - klatrinové vezikuly - rané endozomy - multivezikulámí tělíska (MVB) - vakuola ► Když je rostlinná buňka napadena patogenem, MVB se sloučí zpět s PM a uvolní vezikuly, známé jako exozómy, do BS (biotické a abiotické proteiny, odezvy na stres, nemají signální peptid!) ► Mnoho symbiontů a patogenů vstupuje do buňky endocytózou. ► Receptor-Mediated Endocytosis ► vazba extracelulárních ligandů (např. hormonů, lektinů, protilátek) na receptory v mikrodoménách PM, poté je ligand a jeho receptor endocytován do buňky. ► Piggyback Endocytosis ► vitamíny rozpustné ve vodě, jako je biotin, mají receptory v PM a makromolekuly připojené k biotinu (biotinylace) mohou pronikat PM. ► Exocytóza Endocytóza Objev a studium transportu V roce 1870 Rudolf Heidenhain studoval sekreční proces v exokrinních buňkách slinivky břišní savců. Pokroku bylo dosaženo v 50. letech díky technikám elektronové mikroskopie a buněčné frakcionace. V letech 1980-90 Schekman použil kvasinkové buňky, které vylučují řadu enzymů, např. ošetřili je chromanem a našli mnoho sekrečních mutantů. ► Rostliny maji vysoce vyvinuté sekrecni systémy, někdy ve velice specializovaných buňkách např. nektar, žahavé buňky kopřiv, masožravky... U rostlin biochemické, morfologické a farmakologické studie identifikovaly homology] genů zapojených do membránového transportu nalezených u kvasinek a savců. Rostliny mají mnohem více izoforem některých sekrečních genů než kvasinky Rostlinné geny zapojené do sekreční dráhy byly zmutovaný, navázány na FP... ► Najít specifický inhibitor zapojený do specifické dráhy je obtížné... ► např Mock treated BFA BFA treated (6 hrs) washout (4 hrs)