Biologie rostlinné buňky 6. Cytoskelet ► Objev aktomyosinu Rostlinný cytoskelet a jeho funkce cytoskeletu ► Aktin ► Biochemie aktinu ► Časo-prostorová lokalizace aktinu v rostlinných buňkách ► Rozmanité funkce proteinů vázajících aktin (ABP) ► Cytoskeletální motorické proteiny ► Rostlině myosiny ► Pohyby zprostředkované aktinem a myosinem ► Objev mikrotubulů ► Struktura mikrotubulů ► Dynamická nestabilita mikrotubulů ► Časo-prostorová lokalizace mikrotubulů ► Charakterizace motorických proteinů asociovaných s mikrotubuly (MAPprote ► Pohyby zprostředkované tubu li nem ► Mikrotubuly a tvar buňky Objev aktomyosinu ► Pohyb je jednou z nejsnáze rozlišitelných charakteristik života ► améboidní pohyb prvoků ► pohyb v rostlinách např. cytoplazmatické proudění Engelhardt a Ljubimowa (1939) při studiu svalu zjistili, že myosin, „strukturální" protein, je také enzymem schopným hydrolyzovat ATP ► Schopnost myosinu přeměňovat chemickou energii ATP na mechanickou práci Szent-Gyórgyi (1940s) zopakoval práci „starých mistrů", vysrážel vlákna myosinu, položil na sklíčko a sledoval je pod mikroskopem. Pak přidal na sklíčko ATP a ona se stáhla (contracted)l ► Proteinový kontaminant (zbytek zbytků po extrakci myosinu) aktivuje ATPázovou aktivitu myosinu asi 10x, Bruno Straub nazval tento proteiny aktin, protože způsobil, že se myosin dostal do akce. Hanson a Huxley (1953) naznačili, že kontraktilní proteiny aktomyosin nebyly vůbec kontraktilní, ale kloužou kolem sebe, když způsobily zkrácení svalu. Rostlinný cytoskelet Dynamická, 3D síť vláknitých proteinů ► Poskytuje nejen strukturu ale i pohyblivost a usnadňuje tok informací ► Síť zajišťuje prostorovou organizaci organel, slouží jako lešení pro jejich pohyb, hraje roli při dělení buněk, ukládání buněčných stěn, tvaru a diferenciaci buněk. \ 1 ► Skládá se ze 2 makromolekulárních celku: mikrotubuly (A) a mikrofilamenta (B (intermediate filaments, např. keratin pouze v živočišných buňkách!) ► Mikrotubuly ~ duté válce (25 nm) ► složené z tubulinu (heterodimer a- a p-tubulin) uspořádané do sloupců zvaných protof i lamenta. ► Mnohem tužší než aktinová vlákna. ► Mikrofilamenta ~ šroubovicové polymery ► z monomerního globulárního aktinu (G-aktin), který polymerizuje za vzniku řetězců (7nm) (filamentní F-aktin). Flexibilní, tvoří lineární svazky (bundles), 2D sítě a 3D gely. (A) Lattice seam Tubulin subunits (a and |3) Protofilament G-actin subunit 8 nm 25 nm —— Aktin, tubulin a jejich polymery jsou v neustálé ► Tubulinové a aktinové podjednotky existují jako zásoba volných proteinů v dynamické rovnováze s jejich polymery. ► Mikrotubuly i mikrofilamenta jsou polarizované, to znamená, že oba konce jsou odlišné: pomaleji rostoucí je mínus konec; aktivnější konec je plus koné ► ► Free subunit Polymerized subunit Minus end: Less dynamic )')))) )~T~Tľ) I i ))))))))))) Plus end: More dynamic 1 (-) "pointed end" \ 1 (+) "barbed end" Cyklus polymerace a depolymerizace je důležitý pro život. Každý z monomerů obsahuje navázaný nukleotid: ► ATP nebo AD P v případě aktin u ► GTP nebo GDP v případě tubulinu. Poločasy mikrotubulu a mikrofilament se počítají v minutách a jsou určeny pomocnými proteiny: ► actin-binding proteins (ABPs) ► microtubule-associated proteins (MAPs). ► ABP a MAP plní různé funkce, regulují dynamiku ) NDP) NDP) NDPj NTPJ NT P I JDP N ^ NDP^) NDP^) NDP) ŇĎT) Základní funkce cytoskeletu Ukotvení (anchorage) ► organela makromolekulárních komplexů, např. ribozómů ► Pohyb (motility) ► intracelulární pohyb buněčných komponentů ► Polarita (polarity) ► dána polaritou vláken, informační obsah, např. tip growth Aktin ► U eukaryot je mimořádně dobře konzervovaný (90% identita aa sekvencí).! ► Každá aktinová podjednotka (G-aktin) je 375-aminokyselinový Polypeptid nesoucí těsně asociovanou molekulu ATP nebo ADR actin molecule jfe plus end 37 nm f i minus end minus end (A) (B) (Q ► Aktinové podjednotky jsou asymetrické a sestavují se head-to-tail, aby vytvořily flexibilní, polárni vlákna. 1 Aktin je jedním z nejrozsirenejsich proteinů na světě (druhý s RUBISCO). F-actin (closed) polymerized trímer G-actin subunils (open) Biochemie aktinu ► Polymerace aktinu je doprovázena hydrolýzou koncového fosfátu navázaného ATP (Uvolněná energie není nutná pro polymeraci!) ► Aktinová mi krofi lamenta se mohou tvořit a růst in vitro. ► Po vytvoření nukleačního místa nebo rimeru (pomalý krok) probíhá polymeraa rychle z primem přidáním monomerů. Rychlost polymerace aktinu závisí na koncentraci monomerů a rychlostní konstantě (dána difúzí monomerů) ■ ► Kinetika polymerace aktinu bez ABP (aktin-vazebných proteinů) G-actin (ATP form) O o JÍ => o ys> q. Nucleation Elongation (+) end F-actin microfilament (steady state) (-) end Nucleation ^0-*^ Elongation Steady state ->- Time O o G-actin {ADP form) ► Cytochalasiny, houbové metabolity váží se na + konec filament, brání dalšímu růsti (podobné účinky toxin latrunculin). Faloidin, toxin produkovaný Amanitou, naopak stabilizuje aktinová filamenta, takže nemohou depolymerizovat^ Caso-prostorová lokalizace aktinu v rostlinnýc ► Aktinový cytoskelet je velice dynamická struktura ► Jedinečné uspořádání v každé buňce, ale podobné ve všech během buněčného cyklu, např. ► ve fragmoplastu během tvorby buněčné destičky Když se buňky přestanou dělit a začnou se prodlužovat, aktinová vlákna jsou typicky podélně orientovaná ► Uspořádání aktinového cytoskeletu v epidermálních buňkách koreluje se schopností buněk prodlužovat se Vizualizace: imunoznačení (immunolabeling), fluorescenční rhodamin-faloidin (Amanitatoxin), který se specificky váže na filamentní aktin (čb. obr.) ch Lifeact GFP (actin binding protein-GFP) Rozmanité funkce proteinů vázajících aktin ► Motorové proteiny (myosin) Regulace rovnováhy mezi G- a F-aktinem (profiliny, udržují zásobu snadno dostupného ATP-nabitého aktinu v buňce). ► Mikrofilamenta však mohou být stabilizována zesíťováním do svazků spojením s proteiny (villin a fimbrin). ► Větvení filamentů (pod určitým úhlem) na spojích tvořených nukleátorem (Arp2/3). ► Stříhání aktinového vlákna na kousky, (aktinový depolymerizační faktor (ADF). ► Tvorba mikrofilamentů (formin a fimbrin) Side-binding protein Capping protein Cross-linking (bundle-forming) Cross-lin mesh-fo Nucleating protein Severing Creation of single and bundled actin microfilaments by formin and fimbrin Formin O (+) end G-actin F-actin Fimbrin Actin cable or bundle Cytoskeletální motorické proteiny ► Rostliny mají dva typy motorů: myosiny a kinesiny Myosiny (v rostlinách myosiny VIII a XI) jsou ABP reverzibilně se vázající na mikrofilamenta, obecně se pohybují směrem k plusovému konci ► Kinesiny jsou AAAP vázající mikrotubuly, pohybují se v obou směrech ► Oba motory mají oddělenou doménu hlavy, krku a ocasu 1 5 IM Kinesin c Elektronové mikrografy motorových proteinů Dynein E Minus Minus Plus Microtubule Plus Minus Actin filament Plus Stavba rostlinných my osi n ů ► Myosiny jsou APB, schopny generovat sílu podél a kti nových vláken v důsledku své schopnosti hydrolyzovat ATP (mechano-chemické transduktorové proteiny). Jednotlivá molekula myosinu je polární vláknitá struktura. Rostlinné myosiny jsou dimery složené z monomerů: ► S hlavovou doménou (motor) vázající aktin, hydro lyžující ATP ► připojenou ke krku (páka) ► a ocasní doménou vázající náklad, např. organely nebo vezikuly. (A) Unfolded sequence of domains in myosin XI Tail _A Head Coiled-Neck coil Cargo III 1 500 1000 Number of amino acids (B) Folded dimer configuration of myosin XI 1500 Globular head motor domain Neck region Coilect-coii rod domain Globular cargo domain A II ! Rostlině myosiny - VIII a XI ► ► V každé eukaryotické buňce koexistují desítky různých m| **'ľ!\ľt- * V rostlinných a živočišných buňkách existuje nej méně P*f^*§í • W*. různé formy se specializují na vytváření nebo udržováiT3í*|l$ *" pružnosti v buňce nebo na tažení konkrétního nákladu^* a daným směrem. Rostliny mají převážně myosin VIII and XI směřující k p i* X Myosin VIII byl lokalizován na plazmatické membráně, v plasmodesmatech, v endozomech a ve vznikající buněčné destičce. Myosin XI byl lokalizován v mitochondriích, plastidech a ER (hybná sílu k prodloužení ER tubulů). ► Knockout mutanti naznačují, že myosin XI je zapojen do motility GA, peroxisomů, mitochondrií, plastidů a jádra. motor domain r myosin overall type structure I ÄECC) V VI VII XI XIV 1000 amino acids Myosinem řízený pohyb organel ► Myosin využívá energii získanou z opakovaných cyklů hydrolýzy ATP k pohybu podél aktinového vlákna. (C) Movement of cargo and powerstroke of myosin XI Actin filament Ocas se váže na organelu prostřednictvím své cargo domény a receptorového komplexu na mem Dvěo hlavy mají ATPázovou a motorickou aktivitu tak, že změna v konfiguraci krční oblasti vytváří „chůzi" podél aktinového vlákna během nějž je ATP hydrolyzován na ADP a anorganický fosfát (Pi). Náklad se při každém kroku posune o 25 nm. Po uvolnění Pi se dimer „resetuje" do stavu před zapnutím napájení. Pohyby zprostředkované aktinem a myosine ► ► ► ► Cytoplazmatické proudění (streaming) Aktin a myosin působí společně s cytoplazmou a vytvářejí tohoto pohybu. ► lépe nazývané řízený pohyb organel, protože organely se mohou pohybovat v opačných směrech, ukotvovat se k sobě navzájem, k cytoskeletu nebo PM Organely (mitochondrie, peroxisomy, GA) jsou v rostlinných buňkách extrémně] dynamické. Tyto částice (cca 1 \irr\) se pohybují rychlostí 1-10 |um/s! vyskytuje se téměř ve všech rostlinných buňkách, usnadňuje transport mnohem rychlejší než difúze; míra a organizace souvisí s velikostí buňky ► Nej pomalejší v malých buňkách, se zvětšují se velikostí se rychlost pohybu zvyšuje. ► Buňky střední velikosti s transvakuolárními řetězci mají rychlejší proudění oběhu ► Vysoce organizované a rychlé streamování fontány, např. pylové lácky. Cytoplazmatické proudění je ovlivněno rostlinnými hormony, elektřinou, gravitací; používá se jako indikátor životaschopnosti buněk. Hnací síla vyplývá z přeměny chemické energie | na mechanickou energii aktomyosinem a odpor proti proudění závisí na viskozite cytoplazmy. i ' — ■v 2 v: ■ - |Pollen tubes Pohyby zprostředkované aktinem a myosine ► Pohyby chloroplastů ► světlem stimulované reakce v rostlinných buňkách (agregace, akumulace a uhýbání se), pravděpodobně za účelem optimalizace fotosyntézy Epidermal cells of Vallisneria gigantea kept under low intensity light (the chloroplasts are along the periclinal walls, left) and in which the ■ chloroplasts have been induced to move to the anticlinal walls ► Reorientace buněčné destičky ► Sekrece vezikul zapojených do růstu špičky a růstu indukovaného auxinem ► Plazmodesmatální transport (např. krční zúžení plazmodesmat) ► Reakce na poranění (ochrana před patogeny) ► Kontraktilní vakuoly ► Polymerizace aktinu Metody studia zapojení aktinu do buněčného! ► Popisná analýza umístění a struktury mikrofilamentů _ ► Demonstrace, že antagonisté aktinu (inhibitory) inhibují pozorovanou odpověď ► Prokázání, že motilita je narušena in vivo za nepermisivních podmínek u podmíněných mutantů aktinu nebo myosinu (RNAi, Crisper/Cas 9\ ► Otestování vlastnosti systému v buněčném modelu ► Izolace proteinů zapojených do procesu ► Rekonstituce funkčního systému Objev mikrotubulů Bičíkovité struktury eukaryotických buněk: ► řasinky (cilia) a bičíky (typicky delší). Zavedení ultramikrotomu umožnilo Fawcettovi a Porterovi (1954) rozříznout je příčně a odhalit strukturu odlišnou od struktury svalu, vyžadují ATP pro pohyb, stejně jako svaly! ► Bičíkový pohyb symetrický hadovitý pohyb. ► Ciliární pohyb je rozšířený u jednobuněčných rostlin, hub a živočichů, vyskytuje se také u mnohobuněčných organismů, i když je omezen na specializované buňky; např. spermie některých mechů, kapradin, cykasů a ginkga. Gibbons (1963) vyizoloval (ze spermatu) protein s ATPázovou aktivitou, nazval jej dynein, z řečtiny pro „silovýprotein" (motorický protein). Ledbetter a Porter (1964) se domnívali, že mikrotubuly by se mohly podílet na regulaci tvaru buněk a byly zapojeny do intracelulární motility. Uspořádánítubulů 9 + Mikrotubul se skládá ze 13 protofilament. \ m Struktura mikrotubulů ► Mikrotubuly jsou duté válce z tubulinu. ► Tubulin je 110-kDa heterodimer, který se skládá ze dvou globulárních podjednotek oc-tubulinu a p-tubulinu (kódovaných dvěma genovými rodinami). Každá podjednotka je spojena s jedním GTP. ► Tubulinové dimery jsou uspořádány ve specifické orientaci tvořící protof i lamenta, ta tvoří dutý válec ► Mikrotubuly jsou polární struktury (dva různé konce) ► Kolchicin jed z podzimního krokusu (Colchicum autumnale), inhibuje mitózu ► protein vázající se na kolchicin izolovaný v roce 1960 byl nazván tubulin. ► rostlinný tubulin je depolymerizován milimolárními koncentracemi kolchicinu, je také velmi citlivý na herbicid oryzalin (na rozdíl od živočišného tubulinu). (Vrubulin Mikrotubuly v přítomnosti GTP vykazují treadmillin Při kritické koncentraci dochází k polymeraci tubulinu na +konci stejnou rychlostí, jako k depolymeraci na -konci, a zatímco jsou tubulinové dimery translokovány podél mikrotubulu z kladného konce na záporný konec, nedochází k žádné čisté změně délka mikrotubulu. ► Stejně jako růst aktinových vláken i růst mikrotubulu vykazuje lag fázi (je potřeba primem). ► Nukleace in vivo může vyžadovat třetí formu tubulinu známou jako y-tubulin. Je zajímavé, že zatímco GTP je nezbytný pro polymeraci, hydrolýza GTP není! (D) Interaction with MAPs, katanin, and MORI generates treadmilling MOR1 stabilizes and inhibits catastrophe cSi ,8 O Katanin cuts at microtubule-microtubule junction — MOR1 moves with growing microtubule Same region Treadmilling: +) end polymerization {-) end depotymerization CO Dynamická nestabilita mikrotubulů Pokud se mikrotubuly sestaví z čistého tubulinu, můžeme vidět, jak se mikrotubuly rychle zmenšují a rostou, zdánlivě náhodným způsobem. ► Zdá se, že rostoucí + konec přepíná mezi těmito dvěma stavy. (A) Rapid polymerization Sheetlike {+) end curls into a tubule as the GTP is hydrolyzed (B) GTP cap diminishes GTP cap on rapidly growing microtubule Lattice seam 7-tubulin y-tubulin accessory protein (C> Rapid-shrinking catastrophe When GTP cap is gone, dimers on (+) end bend outward and individual protofilaments separate, curl, and rapidly depolymerize Časo-prostorová lokalizace mikrotubulů U buněk vyšších rostlin se mikrotubuly vyskytují v kortikální cytoplazmě a mají příčnou orientaci vzhledem k dlouhé ose buňky. ► Orientace se mění při diferenciaci a růstu buněk. ► In vivo mikrotubuly vždy pocházejí z oblastí známých jako centra organizující mikrotubuly (microtubule-organizing center, MTOC). ► V rostlinných buňkách obsahují y-tubulin. ► Samotné MTOC jsou dynamické a pohybují se po celé buňce ► Typicky jsou + konce mikrotubulů distální k MTOC a - konce jsou zabudovány do MTOC (nebo centrozomů) Microtubules in an internodal cell of Nitella tasmanica regrowing from MTOCs following ithe removal of oryzalin. Bar, 20 juliti. MTOC lze identifikovat depolymerizací mikrotubulů různými činidly depolymerujícími mikrotubuly a po odstranění činidla sledovat, kde se mikrotubuly reformují. Charakterizace motorických proteinů spojených s mikrotubuly (MAP proteins) Kinesin je mechanochemický enzym, který přeměňuje chemickou energii ATP na energii mechanickou. ► Velký podlouhlý protein, kde každý monomer obsahuje hlavu, krk a ocas ► Kinesin transportuje vezikuly z -konce na +konec (rychlostí 0,5 u.m/s). ► Dynein je polymerní vysokomolekulárni protein. ► Složen z 1 až 3 těžkých řetězců (které zahrnují motorickou doménu) a různého počtu lehkých řetězců. ► Dynein vyvolává pohyb vezikul z +konce na -konc ► Arabidopsis postrádá geny pro těžký řetězec dyneinu, má jen pro lehké!! Pohyb dyneinu a kinesinu podél mikrotubulů se děje podobným způsobem jako myosin klouže podél aktinového mikrovlákna. ► Znázorněn pohyb kinesinu-1 po povrchu mikrotubulus lagging V^coiled-ajM head \ leading head e © / microtubule surface Pi AD F ADP ADP ADP Pohyby zprostředkované tubulinem ► Role mikrotubulů v pohybu chromozomů během mitózy. ► Těsně před profází, na konci G2, se u většiny rostlinných buněk tvoří unikátní uspořádání mikrotubulů známé jako preprofázní pás (preprophase band). ► Jeho poloha předpovídá místo tvorby buněčné destičky. ► Po jaderném dělení skupina mikrotubulů známých jako fragmoplast organizuje vyvíjející se buněčnou destičku. Nukleární migrace je předpokladem pro asymetrické buněčné dělení a v mnoha rostlinných buňkách jsou mikrotubuly spojeny s migrujícím jádrem. ► Mikrotubuly se podílejí na pohybu organel v buňce; např. GA ► Aktin a myosin jsou typicky zodpovědné za cytoplazmatické proudění. ► Polymerizace/depolymerizace mikrotubulů může také poskytnout hybnou sílu pro cytoplazmatický pohyb. Mikrotubuly a tvar buňky ► Mikrotubuly jsou orientovány paralelně s celulózovými mikrofibrily a pravděpodobně řídí orientaci ukládání celulózových mikrofibril ► Činidla nebo stimuly (např. světlo, gravitace, hormony), které i n h i buj i / ovlivň i polymeraci nebo organizaci mikrotubulů, ovlivňují i orientaci celulózových mikrofib syntetizující celulózu (CESA) jezdí po mikrotubulech nebo mikrotubuly vytvářejí kanálky, kterými se tyto komplexy pohybují. ► Jakmile celulóza zači polymerovat, pokrači ve stejném směru, čír se stává nezávislou ni orientaci mikrotubulí Předpokládá se, že orientace celulózových mikrofibril reguluje směr buněčného růstu ► náhodně uspořádané mikrofibrily v kulovité buňce oproti buňkám s příčně orientovanými mikrofibrilami, které se prodlužuji ve směru kolmém k dlouhé ose mikrofibril a dají vzniknout cylindrickým buňkám Např. apikální meristémy Mikrotubuly a tvar buňky Actin Microtubule Cellulose Epidermis Stomatální buňky mají velmi charakteristickou morfologii buněčné stěny: ► celulózové mikrofibrily jsou uspořádány radiálně kolem buňky (radiální micelace) důležité pro správnou funkci průduchu. ► Mikrotubuly jsou paralelní s celulózovými mikrofibrilami a oba jsou uspořádány radiálně. Cytoskeleton je podílí na tvorbě komplexních tvarů buněk Intermediate filaments ► Tato vlákna mají průměr přibližně 10 nm a jsou tedy mezi aktinovými mikrovlákny (5 nm) a mikrotubuly (24 nm). ► Beven a kol. (1991) naznačují, že v rostlinách může intermediary filamentový protein lamin tvořit síť 10 nm filamentů, která se nachází uvnitř vnitřní membrány jaderného obalu, jako je tomu v živočišných buňkách. \ ► Laminy se podílejí na regulaci velikosti a tvaru jádra, organizaci chromatinu, umisťování komplexu jaderných pórů a jsou součástí linkeru mezi nukleoskeletem a cytoskeletem. ► Avšak zatímco vyšší rostliny obsahují proteiny, které mohou mít analogické funkce jako laminy, chybí jim homologní sekvence DNA pro laminy. 1 Motilita na bázi centrinu ► Některé pohyblivé proteiny jsou ve skutečnosti samotné kontraktilní prvkyj ► Centrin je součástí MTOC nebo pericentriolárního materiálu u řas, prvoku savců a vyšších rostlin: ► např. v pohyblivých rostlinných spermiích Mechanismus pohybu svalů The sliding f i lament model: ► model s posuvným vláknem: Pásmo A (což znamená anizotropní) a dvě nedvojlomné oblasti mezi pásy Z a pásmem A byly pojmenovány pásy I (což znamená izotropní). ► A-pásy ~ tlustá vlákna, myosin ► l-pásy ~ tenká vlákna, aktin. Z u 2 „ .. , One sarcomere FIGURE 10.4 DiaiTTijm oJ Ihe relative movement l>1 acLin and myosin as described by ihe slidiniz Jilamenl hypothec: (A) relaxed and (W) txmlracled of a toad muscle Aktin v nesvalových buňkách ► Aktin se nenachází pouze ve svalových buňkách, ale vyskytuje se také ve všech eukaryotických buňkách. ► Aktin je jedním z nej rozšířenějších proteinů na syěťe^ (druhý s RUBISCO).