ELFO ultracentrifugace Gelová elektroforéza je jednou ze základních metod molekulární biologie GELY - jsou tvořeny síťovitou strukturou polymerních molekul s póry - jako nosič se používá agaróza (100 – 50 000 bp) nebo polyakrylamid (10 – 1 000 bp) Agaróza je lineární polymer, původ z mořské řasy různá čistota –> purifikace (nesmí obsahovat endonukleázy) různé parametry (low melting, EEO, ...) Polyakrylamid = polymer propenamidu a N,N-metylen-bisakrylamidu Princip ELFO pohyb DNA s negativním nábojem v neutrálním gelu a elektroforetickém pufru v elektrickém poli k anodě ELFO pufry: TRIS-acetátový (TAE): 0,04 M Tris-acetát, 0,002 M EDTA, pH 8,2 - separace lineárních molekul DNA TRIS-borátový (TBE): 0,089 M Tris-borát, 0,089 M kyselina boritá 0,002 M EDTA; pH 8,5 - separace molekul menších než 1 kb, déletrvající ELFO, vysoké napětí TRIS-fosfátový (TPE): 0,08 M Tris-fosfát, 0,008 M EDTA, pH 7,5 - separace ssDNA , Pohyb fragmentů DNA v gelu v závislosti na jeho koncentraci Aby vzorek při nanášení do jamky klesal k jejímu dnu, míchá se s nanášecím pufrem. Tento pufr vzorek zároveň obarví a v průběhu ELFO nám putující barvička dává ilustrativní přehled o vzdálenosti, kterou vzorek o odpovídající velikosti urazil. Obvykle bývá 4 – 6 krát koncentrovaný. Může se použít např. 0,25% bromfenolová modř (obarví) 40% (w/v) sacharóza ve vodě (zvýší hustotu) Existuje několik typů nanášecích pufrů, které mohou obsahovat místo sacharózy glycerol nebo Ficol 400. Marker = směs lineárních fragmentů DNA s definovanou délkou, umožňuje určit velikost molekul DNA (amplikony, plazmidy nebo fragmenty DNA po restrikčním štěpení) po proběhnutí elektroforézy porovnáním. 100bp 1kb 1kb Plus 2-log DNA fragmenty v UV světle 302 nm a fotodokumentace ETb Stain G SERVA DNA Stain G 0,3 µl/40 ml agarózy Na gelu vidíte různé proužky téhož plazmidu, tzn. kromě multimerů je délka jejich nukleotidové sekvence totožná. Která forma/proužek umožňuje spolehlivě určit velikost plazmidu? Proč? PFGE ANIMATION 3D OF GEL ELECTROPH ORESIS BETTER EXPLAINED - YouT ube DNA gel electrophoresis 3D animation YouTube What is Gel Electrophoresis? | miniPCR bio™ - YouTube How to Interpret Gel Electrophoresis R esults: Different types of plasmid DNA YouTube ELFO - postup Příprava gelu pro ELFO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Vypočítat objem gelu (výška gelu ≥ 5 mm) Připravit 500 ml 1×TAE pufr ze zásob. roztoku konc. 50× Navážit agarózu a smíchat s 1×TAE pufrem tak aby vznikl 1,5% gel Rozvařit agarózu 10 min/100°C Opatrně promíchat, vytemperovat na 50 °C Nalít do vyrovnaného tvořítka tak, aby nevznikly bubliny Nechat gel ztuhnout (20 min) -> přenést gel i s formou do ELFO vany, hřebínek u katody (-) -> přelít 1x TAE pufrem, hladina cca 3 - 5 mm nad gelem -> po přelití pufrem vytáhnout hřebínek kolmo nahoru Příprava vzorku DNA pro nanášení do gelu nanášecí pufr je 6× koncentrovaný 1/6 roztok DNA 1) 2) 3) 4) DNA s nanášecím pufrem ELFO neštěpená vektorová pDNA: 10 μl (500 µg/ml) + 2 μl NP - každý svůj vzorek štěpená vektorová pDNA: 10 μl (250 µg/ml) + 2 μl NP - každý svůj vzorek štěpená rekombinantní pDNA: 10 μl (250 µg/ml) + 2 μl NP - 1 na prac. skupinu PCR amplikon (inzert): min. 5 μl + 1 μl NP - 1 na prac. skupinu Správně zapojit! nastavit napětí 5 V/cm a spustit elektroforézu - nanášet vzorky s nanášecím pufrem - špička pod hladinou 1× TAE pufru - vhodný marker (5 µl) ZAPSAT SI POŘADÍ! 20 min v roztoku etidiumbromidu (1 µg/ml) ! POZOR - mutagen ! Centrifugace - je separační metoda založená na pohybu částic v tekutém mediu vlivem odstředivého pole, které vzniká otáčením rotoru centrifugy. - během centrifugace působí na částici odstředivá síla F1 = m ω 2 r ω = 2pn n = rpm Ff = frikční (třecí) síla Fods = odstředivá síla m r Fvz = vztlaková síla ω = úhlová rychlost r = vzdálenost částice od osy otáčení m = hmotnost částice ω2r = a (zrychlení) Fods = ma RCF versus RPM Parametry centrifugace se nejčastěji vyjadřují jako: RCF (relative centrifugal force, relativní centrifugační síla) RCF se uvádí v násobcích gravitačního zrychlení g (g = 980 cm/s2) 𝑹𝑪𝑭 = 𝟏𝟏, 𝟏𝟖 × 𝟏𝟎−𝟔 × 𝒓 × 𝒏 𝟐 n = počet otáček rotoru za minutu (rpm) r = vzdálenost místa od středu rotace (typ a velikost rotoru) RCF = je relativní centrifugační zrychlení je číslo bez rozměru – udává RPM (rotations per minute, počet otáček za než minutu) kolikrát je zrychlení vyvolané rotací vyšší gravitační zrychlení Země Nomogram pro přepočet RCF a rpm Nomogram pro přepočet relativní centrifugační síly (rcf) a otáček rotoru za minutu (n) v závislosti na poloměru rotoru (r). Příklad: rmax = 7,2 cm n = 14 000 rpm rcfmax = 16 000 x g Centrifugace • Centrifugace urychlí sedimentaci pevných částic v kapalném prostředí • Na sedimentaci má vliv: • Vlastnosti látek (hmotnost, velikost, tvar, hustota) • Vlastnosti prostředí (hustota, viskozita) • Význam: • Odstranění hrubých částic z roztoku sediment (pelet) x supernatant • Izolace organel a biomakromolekul • Stanovení základních parametrů (MW, hustota, sedimentační koeficient) ZÁKLADNÍ TYPY CENTRIFUGACE diferenciální centrifugace v homogenním roztoku - opakovaná centrifugace zonální centrifugace v hustotním gradientu podle rychlosti sedimentace - gradient se tvoří nanášením vrstev - sedimentační koeficient (S) podle hustoty částic - gradient vzniká při centrifugaci - vznášivá hustota ( ρ) Sedimentační koeficient = dr/dt, tj. charakterizuje rychlost pohybu částice při izokinetické centrifugaci (přepočítává se na standardní sedimentační koeficient) Využití: - charakterizace informačních makromolekul, buněčných organel apod. : hodnoty koeficientu se pohybují v rozmezí 10-11 - 10-13 s, proto se udává ve Svedbergových jednotkách: 1 S = 10-13 sekundy např. 30S = 30 × 10-13 s (dále 23S RNA, 16S RNA, nebo ribozom. podjednotky 30S, 50S) Vznášivá hustota = hustota stanovená izopyknickou centrifugací, částice se nacházejí v oblasti, kde je hustota roztoku stejná jako hustota částic Využití: - separace různých forem DNA - dále výpočet % (G+C): je známo, že na vznášivou hustotu dsDNA má vliv zastoupení jednotlivých typů párů bází, čehož se využívá ke stanovení podílu GC-párů ve vzorcích DNA; platí: % (G+C) = (ρ - 1,660/0,098) .100 ultracentrifuga Beckman Optima XPN-90 Izokinetická centrifugace zakoncentrovaného fágového lyzátu v gradientu CsCl Před centrifugací Po centrifugaci buněčné debris viriony Způsoby konstrukce sacharózového gradientu VZORKY převrstvování 5% 5 15% 4 25% 3 35% 2 45% 1 Vrstvit po 1 ml podvrstvování 5 4 3 1 2 mezivrstvení 5 4 1 3 2 1. 45% sacharóza 2. převrstveni 5% sacharózou 3. mezivrstvení 25% sacharózou 4. mezivrstvení 35% sacharózou 5. mezivrstvení 15% sacharózou