Transformace  1  - KLONOVÁNÍ
KLON    soubor identických buněk (organizmů) pocházejících ze společného předka
KLONOVÁNÍ proces tvorby klonů
DNA Klonování je základem genového inženýrství, tj., vytváření pozměněných nebo nových genů
    a jejich zavádění do genomu organizmů.
DNA klon: molekulární klon = segment DNA vektorem přenesený do hostitelské buňky
a v ní se replikuje.
Cizorodá DNA spojená s vektorem = rekombinantní
                                   DNA
Rekombinantní DNA, která je určená ke klonování se nazývá klonovaná DNA
dolly-sheep-gmo

Tři základní kroky klonování DNA
1. příprava rekombinantní molekuly DNA
2. přenos rekombinantní molekuly DNA do hostitelské buňky
3. selekce klonů obsahujících rekombinantní DNA
Původ (příprava) DNA
•izolovaná z donorového organizmu
•komplementární (cDNA připravená zpětnou transkripcí z mRNA)
•připravená uměle chemickou syntézou

Metody přenosu DNA do prokaryotických buněk
•Chemické – roztoky dvojmocných iontů solí
•                                     + teplota
•
•(Bio)Fyzikální – elektroporace
•
•
•
•Pomocí virů
Electroporation_Diagram

Metody přenosu DNA do eukaryotických buněk
•Chemické – lipofekce, DEAE dextran,
•                    fosforečnan vápenatý, …
•
•(Bio)fyzikální – elektroporace, biolistika,
•                        mikroinjekce
•
•
•
•
•
•Viry – !!!!! Bezpečnost !!!!!!
mikroinjekace_fotka gene%20gun

Způsoby přenosu DNA
Transformace. Přímý přenos DNA izolované
 z donorové buňky přes cytoplazmatickou membránu do buňky recipientní, v jejímž fenotypu se může
vnesená genetická informace projevit. Termín se používá pro prokaryotické buňky (u eukaryot je spíš
nádorová transformace)
Transfekce. Přenos DNA do eukaryotických buněk (lipofekční činidla, elektroporace, viry …)
Transdukce. Přenos DNA – sekvence prostřednictvím viru z buňky donorové do recipientní, v jejímž
fenotypu se může vnesená genetická informace projevit (opět termín spíše pro prokaryota)

VLASTNOSTI   PLAZMIDOVÝCH  VEKTORŮ
Autonomní replikace v bakteriální buňce (schopnost stabilního udržení cizorodé
  DNA při replikaci)
Vhodné spektrum restrikčních míst
•
•
Gen se selektivním znakem
      - beta-laktamáza → rezistence na ampicilin
Plazmid nesmí být konjugativní tj. nesmí mít transferové geny (kódující pilusy)
Co nejmenší velikost
Vícekopiový
•
textpcaspers

Klonování DNA v plazmidu



Příprava kompetentních buněk
Erlenka
kultura E. coli narostlá v 20 ml LB bujonu do OD600 = 0,3
ochladit na ledu  0 °C
centrifugace 10 minut při 3000 rpm/4 °C
Na třepačce
sediment resuspendovat v polovině objemu ledového roztoku 0,05M CaCl2 a ponechat na ledu (v
lednici) přes noc
SUPERNATANT ODLÍT
centrifugace 10 minut při 3000 rpm/4 °C
SUPERNATANT ODLÍT
sediment resuspendovat v 1/10 výchozího  objemu (2 ml) ledového roztoku 0,05M CaCl2
úchova na ledu nebo při -70°C v glycerolu
Kompetentní buňky

TRANSFORMACE SCHÉMA
V Epp. mikrozkumavce je 30 ml kompet. buněk
Opatrně promíchat, nechat stát v ledu 30 min
Na ledu nechat 2 min, přidat 1ml LB bujónu
Inkubace ve vodní třepací lázni při 37°C/45min
Na ledu
Umístit při 42 °C/40 sec nebo 37 °C/3 min
Teplotní šok
Naředit DNA vektoru na 10 ng/ul v TE
K 1 ul přidat 30 ul kompetentních buněk

Transformace pokračování
odlít supernatant
ve zbývajícím medium resuspendovat sediment buněk
suspenzi vyočkovat na LB agar +
100 mg/ml AMP
Naočkované misky
inkubovat dnem vzhůru
při 37 °C/24 hod
centrifugace při 5 000 rpm/ 5 min
Po inkubaci

Stanovení titru bakteriálních buněk
-stejný postup jako předchozí
-
•Ale:
-buňky naředit 104, 105, 106 x
-místo DNA použijeme sterilní vodu
-na závěr buňky vysít na misky bez ampicilinu
•
•
V mikrozkumavce je 30 ml kompet. buněk
Hodnocení:  odečet počet kolonií transformantů
          stanovení účinnosti transformace