Separace molekul nukleových kyselin centrifugací Centrifugace se používá v molekulární biologii k izolaci, čištění a charakterizaci biopolymerů a nad-molekulárních útvarů. Přináší též informace o vznášivé hustotě a sedimentačním koeficientu, pomocí kterého lze za určitých podmínek vypočítat molekulovou hmotnost biopolymerů. Během centrifugace působí na částici odstředivá síla F1 = m □ r □= 2nn n = rpm □- úhlová rychlost n - počet otáček F2 = vztlak F3 = třecí síla (odpor prostředí) d =hustota částice \3 hustota kapaliny dno Relativní odstředivá síla Parametry centrifugace se nejčastěji vyjadřují relativní odstředivou silou RCF. m □ r Qr RCF = - = - (jednotka = g) m . g g RCF se uvádí v násobcích gravitačního zrychlení g nebo počtem otáček za minutu. g = 980 cm/s2 RCF = 1.119.10-5.n2.r Rozdělení centrifugačních technik a) Diferenciální centrifugace - separace směsi heterogenních částic v homogenním roztoku b) Zonální centrifugace separace směsi částic s podobnými vlastnostmi v gradientním roztoku Izokinetická - podle rychlosti sedimentace - stanovení sedimentačního koeficientu Izopyknická - podle hustoty částic - stanovení vznášivé hustoty ZÁKLADNI TYPY CENTRIFUGACE zonální centrifugace v hustotním gradientu diferenciální centrifugace 0 Ty směs látek v roztoku centrifuface při nízkých otáčkách (1 000 g) shromáždění sedimentu centrifugace supematantu při středních otáčkách (20 000 g) shromáždění sedimentu centrifugace supematantu při vysokých otáčkách (B0 000 g) izokinetická centrifugace nvzorek nanesený na povrch 5 - 20 % sacharózového gradientu centrifugace izopyknická centrifugace • fo roztok CsCI obsahující směs částic centrifugace o o o pomaleji sedimentující částice rychleji sedimentuj ící částice frakcionace obsahu zkumavky O o Ol částice s nižší hustotou částice s vyšší hustotou frakcionace obsahu zkumavky uuuuuuuu sběr frakcí sběr frakci Diferenciální centrifugace částice s různou velikostí, hmotností - jiná rychlost sedimentace Opakovaná centrifugace se zvyšujícími otáčkami - frakce př. buněčná jádra, ribozomy, mitochondrie ... Cell iýsate Centrifuge at 1 ř300g for 5 min at 4 °C i ^Centrifuge at 17>000g .for 15 min at 4 "C 1 Centrifuge at 80,000g w ^for 60 min at 4 "C Pellet rich in nuclei i_^Centrifuge at 150,000g and cell debri © \ for 3 h at 4