Cvičení z fyziologie rostlin 2. Osmotický a vodní potenciál Vodní režim rostlin  Nutnost přijímat vodu jako:  „látku“ - základní složka cytoplazmy buněk, substrát pro fotolýzu vody během fotosyntézy  „rozpouštědlo, nosné médium“ - příjem živin z půdy, transport látek v rostlině, vše ve formě vodných roztoků  Hnací síla toku vody - osmóza voda roztok polopropustná membrána Vodní potenciál  Veličina pro popis a kvantifikaci transportu vody v rostlině  Ψ = p – π [Pa]  Ψ = vodní potenciál  p = hydrostatický tlak  π = osmotický tlak  = 0,5 p = 0  = -0,5  = 0,5 p = 0,5  = 0 Buňka před pokusem (hodnoty v MPa) Ponoření do čisté vody  = 0 p = 0  = 0  = 0,5 p = 0,3  = -0,2  = 0,2 p = 0  = -0,2 Ponoření do slabého roztoku (hypotonický roztok)  = 0,7 p = 0  = -0,7  = 0,7 p = 0  = -0,7 Ponoření do koncentrovaného roztoku (hypertonický roztok) Tok vody do buňky, maximální vodní potenciál ( = 0), maximální turgor buňky Vyrovnání vodních potenciálů částečným tokem vody do buňky, turgor buňky mírně snížený Tok vody z buňky, pokles vodního potenciálu, ztráta turgoru -> plazmolýza Předpoklad: pevná buněčná stěna! Metody stanovení vodního potenciálu  Nepřímé stanovení – stanovení osmotického potenciálu π (zanedbání vlivu tlakové složky „p“)  Metoda hraniční plazmolýzy  Refraktometrická metoda  Osmometrie  parní, zmrazovací…  Přímé stanovení  Tlaková metoda  Psychrometrie Stanovení osmotického potenciálu π  Osmotický tlak = tlak, který musí působit na roztok, aby se zabránilo pronikání molekul vody do roztoku (vyvolá zastavení osmózy)  Osmotický potenciál = potenciál buňky/pletiva vykázat za ideálních podmínek osmotický tlak  Osmotický potenciál buňky/pletiva závisí na obsahu osmoticky aktivních látek v cytoplazmě (kompatibilní osmotika (např. cukry, aminokyseliny) a vakuole (např. anorg. ionty K+, Mg2+, NO3 -) Metoda hraniční plazmolýzy  Inkubace vzorků pletiva v koncentrační řadě roztoků s osmoticky aktivní látkou (např. sacharózou)  Vakuoly a celé protoplasty buněk reagují na osmotické vlastnosti roztoku okolo nich příjmem nebo výdejem vody  Pozorování podílu „plazmolyzovaných“ buněk  Hledání koncentrace osmotika, při níž je právě 50% buněk plazmolyzovaných  Přepočet odpovídající koncentrace osmotika na hodnotu osmotického potenciálu. Plazmolýza rostlinných buněk Allium cepa (česnek cibule) – pokožka dužnaté suknice Hypo-/izotonický roztok Hypertonický roztok Refraktometrická metoda  Inkubace vzorků pletiva v koncentrační řadě roztoků s osmoticky aktivní látkou (sacharózou)  Pozorování změny koncentrace osmotika v inkubačním roztoku pomocí refraktometru  Porovnání hodnot z řady vzorků s kalibrační řadou původních roztoků  Hledání izotonické koncentrace  Přepočet odpovídající koncentrace na osmotický potenciál koncentraceindexlomu Kalibrační křivka Vzorky Naředění roztoku Zahuštění roztoku Izotonická koncentrace Osmometrie  Základní osmometrie – sledování osmózy jako zvýšení/snížení hladiny kapaliny v kapiláře osmometru naplněném zkoumaným roztokem.  Parní osmometrie – sledování osmózy vody z vodní páry do kapky zkoumaného roztoku na základě změny jeho teploty (ohřátí = příjem vody koncentrovaným roztokem)  Zmrazovací osmometrie – stanovení osmotického potenciálu roztoku podle přesné teploty tuhnutí Přímé stanovení – tlaková metoda  Princip - působením vnějšího tlaku dojde k překonání osmotického tlaku a vytlačení vody z buněk do xylému  Balanční tlak = číselně vodní potenciál Přímé stanovení - psychrometrie  Princip – stanovení teploty rosného bodu (teploty při maximálním nasycení vzduchu vodní párou, tj. při 100% relativní vzdušné vlhkosti)  Ve vzduchotěsné měřící komoře se nad vzorkem pletiva/půdy ustaví rovnováha mezi vodou ve vzorku a vodní párou v komoře, tlak vodní páry odpovídá vodnímu potenciálu vzorku Praktické návody 1. Refraktometrická metoda  Princip:  Změna koncentrace osmoticky aktivní látky (sacharózy) v roztoku po inkubaci se vzorkem rostlinného pletiva detekovaná opticky  Pomůcky a potřeby:  Rostlinný materiál – hlízy brambor  Příprava vzorků – korkovrt, nůž, pravítko  Inkubační roztoky – koncentrát 1M sacharóza koncentrační řada 0,1 M; 0,2 M; 0,3 M; …. 0,9 M; (1,0 M) kontrola (0 M) – čistá voda  Pomůcky – sada zkumavek 10mL, kádinky, pipety (1, 5 a 10 mL), refraktometr 1. Refraktometrická metoda  Provedení (1):  Označit kádinky a zkumavky (1 kádinka a 2-3 zkumavky na jednu koncentraci).  Připravit koncentrační řadu roztoků, od každé koncentrace 10 (resp. 20) mL.  Do všech zkumavek (2 sady se vzorky, 1 sada kalibrační) napipetovat roztok podle koncentrace v objemu 1 mL 1. Refraktometrická metoda  Provedení (2):  Připravit vzorky z bramborových hlíz:  Pomocí korkovrtu vyvrtat válečky dřeně  Odkrojit okraj válečku se slupkou, zarovnat řeznou plochu  Rozdělit váleček na přesně 2,5 cm dlouhé špalíky a ty rozříznout napůl.  Menší kusy válečků z odkrojků lze složit k sobě do celkové délky 2,5 cm. 1. Refraktometrická metoda  Provedení (3):  Do dvou sad zkumavek umístit špalíky dřeně, jednu sadu zkumavek ponechat prázdnou (kalibrační řada)  Zkumavky uzavřít víčkem a nechat za občasného protřepání inkubovat minimálně 30 minut. Ilustrativní video 1. Refraktometrická metoda  Měření (1):  Připravit refraktometr – sejmout hranol, očistit čistou vodou hranol i čočku, ubrouskem utřít do sucha  Změřit kalibrační sadu (bez vzorků dřeně), začít od nejvyšší koncentrace  Na čočku refraktometru nanést tyčinkou kapku roztoku  Přiklopit hranol  Upravit zaostření okuláru refraktometru, najít stupnici a odečíst co nejpřesněji hodnotu indexu lomu na viditelném rozhraní světla a stínu  Sejmout hranol a očistit čočku i hranol 1. Refraktometrická metoda Ilustrativní video měření pomocí refraktometru 1. Refraktometrická metoda  Měření (2):  Změřit kalibrační sadu (bez vzorků dřeně), začít od nejvyšší koncentrace  Změřit sady inkubačních roztoků se vzorky dřeně  Podle potřeby zopakovat měření kalibrační sady i vzorkových sad  Zaznamenat si teplotu prostředí během měření !! 1. Refraktometrická metoda  Vyhodnocení (1):  Zprůměrovat případné opakovaně měřené hodnoty  Vynést data do grafu (typ BODOVÝ, s číselnými osami) jako závislost indexu lomu (osa Y) na koncentraci sacharózy (osa X), řady tvoří kalibrační sada a zprůměrovaná sada ze vzorků,  Datovými body proložit lineární spojnice trendu („přímky“)  Podle polohy průsečíku přímek z grafu odečíst (nebo z rovnic přímek vypočítat) hodnotu izotonické koncentrace osmotika. koncentrace indexlomu Kalibrační křivka Vzorky Izotonická koncentrace 1. Refraktometrická metoda  Vyhodnocení (2):  Získanou hodnotu dosadit za „c“ do Van‘t Hoffova vzorce pro výpočet osmotického potenciálu π = - R*T*c*i [MPa], kde:  R= univerzální plynová konstanta 0,00831447 MPa mol-1 K-1  T= absolutní teplota v době měření (273,15 K + t[°C])  c= izotonická koncentrace (mol/L)  i= koeficient disociace osmotika, pro sacharózu je roven 1 2. Tlaková metoda  Princip  Tlakem plynu vytlačit z pletiva vodu, hodnota tlaku odpovídá přímo hodnotě vodního potenciálu pletiva  Experiment  Porovnání vodního potenciálu a jeho změn v čase u listů ze zalévané a nezalévané rostliny pelargonie  Pomůcky a potřeby  Rostlinný materiál – listy s řapíky nebo celé stonky rostlin (např. pelargonie, zalévané a nezalévané rostliny)  Pomůcky - měřící aparatura, tlaková nádoba s plynem (vzduch, dusík …), žiletka, lupa, těsnící hmota 2. Tlaková metoda  Provedení (1):  Odebrat rostlinný materiál (list s řapíkem, celý stonek)  Připravit měřící aparaturu  Otevřít přívod plynu  Ventil tlakové komory přepnout do polohy „Vent chamber“  Pomocí zátky s vhodným průměrem otvoru upevnit list (stonek) zespodu do víka tlakové komory  List (stonek) vložit do tlakové komory a víko těsně našroubovat na tlakovou komoru. Pozor, zamezit mechanickému poškození vloženého listu (stonku)! 2. Tlaková metoda  Provedení (2):  Řeznou plochu na řapíku seříznout šikmo pod úhlem přibližně 45°  Ventil tlakové komory přepnout do polohy „Fill Chamber“.  Sluchem zkontrolovat napouštění komory a zejména případné netěsnosti kolem zátky (intenzivní syčení). V případě potřeby přepnout ventil zpět na „Vent Chamber“, odšroubovat víko, vyjmout zátku s listem a přetěsnit pomocí těsnící hmoty.  Pokud zátka těsní, jehlovým ventilem „Flow rate“ podle potřeby regulovat rychlost napouštění komory. 2. Tlaková metoda  Měření (1):  Pokud zátka a víko těsní a tlakoměr ukazuje zvyšující se hodnotu tlaku v komoře, sledovat přítomnost vody na řezné ploše řapíku (stonku) – když řezná plocha zvlhne a objeví se kapka vody, okamžitě zastavit napouštění komory přepnutím ventilu do polohy „Off“  Na tlakoměru odečíst hodnotu dosaženého tlaku plynu. 2. Tlaková metoda  Měření (2):  Ukončení měření  Pomalu přepnout ventil tlakové komory do polohy „Vent Chamber“ (hlasitě uniká stlačený plyn)  Po vypuštění komory sešroubovat víko a šetrně vyjmout zátku s vloženým listem (stonkem)  Měření opakovat s dalším listem (stonkem) 2. Tlaková metoda  Vyhodnocení  Podle designu experimentu např. opakovaně měřit 2-3 listy ze zalévané a nezalévané rostliny v 10-15 min intervalech  Dosažené hodnoty tlaků přepočítat z jednotky bar na MPa a zapsat do tabulky  Porovnat získané hodnoty a jejich změny v jednotlivých měřících intervalech.