Cvičení z fyziologie rostlin 4. Respirace Co je respirace?  Aerobní respirace („dýchání“) :  Probíhá ve všech živých buňkách kořenů, stonků, listů (květů, plodů)  Hlavní zdroj energie v noci a v heterotrofních (nezelených) orgánech  Při fotosyntéze je rychlost respirace v zelených částech rostlin omezená Co je respirace?  Aerobní respirace („dýchání“) :  Katabolický děj buněčného metabolismu  Aerobní proces, tj. O2 je konečný akceptor elektronů  Zisk energie a uhlíkatých meziproduktů pro syntézy rozkladem organických molekul za spotřeby O2 a uvolnění CO2.  Substráty – sacharidy, tuky, bílkoviny, organické kyseliny  Produkty – ATP, NADH, uhlíkaté skelety, CO2, H2O Co je respirace?  Lokalizace procesů respirace v buňce:  Cytoplazma – glykolýza, pentózo-fosfátový cyklus  Plastidy – pentózofosfátový cyklus  Mitochondrie - Krebsův (citrátový) cyklus, koncový dýchací řetězec (oxidativní fosforylace)  Řízení respirace  Redoxní signály – NADPH, ROS, RNS, přenašeče elektronů atd…  Specifické metabolity / meziprodukty – malát, … Respirace a její rychlost  Faktory ovlivňující rychlost respirace  Dostupnost O2 – anaerobní procesy produkují málo ATP  Koncentrace CO2 - zvýšená hladina zpomaluje respiraci  Teplota – nízká teplota zpomaluje, vysoká zrychluje respiraci  Záření – dostatek světla podporuje fotosyntézu a částečně potlačuje respiraci v zelených částech rostlin  Dostupnost minerálních živin – fosfor, dusík…  Stupeň ontogeneze a fyziologický stav rostliny  Vysoká respirace u klíčících semen, mladých rostlin a nefotosyntetizujících orgánů rostlin  Vyšší respirace u mírně nebo akutně stresovaných rostlin – v první „poplachové“ fázi energie pro nastartování obranných mechanismů, v druhé „resistenční“ fázi energie pro udržování obrany Metody měření respirace  Gazometrické metody  detekce koncentrace CO2 (ve vzduchu)  Oxymetrické metody  Detekce koncentrace kyslíku (plynného i rozpuštěného v roztoku) UH3 Gazometrické měření respirace  Detekce koncentrace CO2  IRGA – infračervený analyzátor plynů  Princip – detekce změn koncentrace CO2 podle absorbance IR záření  Výhody  Jednoduché a rychlé měření změn koncentrace CO2 v proudu vzduchu  Vysoká citlivost  Nevýhody  Nutno odstranit vlhkost ze vzduchu (vodní pára také absorbuje IR záření)  Potřeba zdroje vzduchu se stabilní koncentrací CO2, nebo upraveného vzduchu bez CO2 UH3 Oxymetrické měření respirace  Detekce koncentrace kyslíku (plynného i rozpuštěného v roztoku)  Elektrochemická (Clarkova) kyslíková elektroda  Princip – redukce O2 v elektrolytu okolo elektrod za plynopropustnou membránou – vznik elektrického proudu  Optická kyslíková elektroda  Princip – změna (snížení) intenzity luminiscence barviva vázaného na membráně v přítomnosti kyslíku, obsahuje zdroj excitačního záření a detektor luminiscence UH3 Oxymetrické měření respirace  Výhody  Rychlé měření, běžně dostupné přístroje  Nevýhody  Vhodné zejména pro roztoky a suspenze  Citlivá membrána a nestabilní signál elektrochemické sondy kvůli průběžné spotřebě O2 během redukce na elektrodě Proč měříme rychlost respirace?  Stanovení uhlíkové bilance rostliny  Stanovení nákladnosti fyziologických procesů (např. příjem iontů, růst, udržování biomasy)  Stanovení dynamických změn v reakci na podněty (např. stres) UH2 Praktická část Gazometrické měření rychlosti respirace  Experiment 1 – Porovnání rychlosti respirace různě dlouhou dobu bobtnajících semen  Materiál: semena (bob, pšenice…) bobtnající ve vodě po dobu 2 hodin a 2 dnů  Úkoly: Vypočtěte rychlosti respirace, porovnejte výsledky, rozdíly popište a vysvětlete v Závěru.  Hypotéza: Semena bobtnající delší dobu budou mít vyšší rychlost respirace.  Experiment 2 – Porovnání rychlosti respirace kořenů rostlin kukuřice pěstovaných při deficienci některé makroživiny (N, P, Fe)  Materiál: kořeny rostlin kukuřice pěstovaných v živném roztoku bez vybraných makroživin (N, P, Fe)  Úkoly: Vypočtěte rychlosti respirace, porovnejte výsledky, vyjádřete v procentech změny u deficientních rostlin oproti kontrole, rozdíly stručně popište a vysvětlete v Závěru.  Hypotéza: Kořeny deficientních rostlin se budou lišit rychlostí respirace od kořenů kontrolní rostliny, ale v závislosti na významu konkrétní živiny pro růst a na rozsahu poškození způsobeném jejím nedostatkem. Gazometrické měření rychlosti respirace  Princip:  Stanovení rychlosti respirace ze změny koncentrace CO2 ve vzduchu proudícím okolo rostlinného vzorku  Rostlinný materiál:  semena (bob, pšenice,…), bobtnající ve vodě po krátkou (2 hodiny) a dlouhou (2 dny) dobu  Kořeny rostlin rostoucích při deficienci některé makroživiny Gazometrické měření rychlosti respirace Počítač pro záznam dat IRGA Zdroj vzduchu a pumpaZdroj vzduchu a pumpa Regulátor průtoku Vodní lázeň a měřící baňky Sestavení měřící soupravy Odlučovač vlhkosti Referenční hodnota CO2 Gazometrické měření rychlosti respirace  Provedení  Zapojit měřící soupravu  Změřit referenční hodnotu (výchozí koncentraci) CO2 ve zdroji vzduchu  Zapojit prázdnou baňku  Zregulovat průtok na 0.2 L/min  Počkat na ustálení signálu z IRGA, odečíst hodnotu koncentrace CO2 Gazometrické měření rychlosti respirace  Provedení  Připravit rostlinný vzorek  Kořeny oddělit od rostliny  Semena / kořeny lehce osušit  Šetrně vložit do měřící baňky  Umístit baňku do držáku ve vodní lázni Gazometrické měření rychlosti respirace  Měření  Zapojit baňku se vzorkem do měřícího okruhu  Zkontrolovat hodnotu průtoku (optimálně 0.2 L/min)  Počkat na ustálení signálu z IRGA a odečíst hodnotu koncentrace CO2 Gazometrické měření rychlosti respirace  Měření  Ustalování signálu IRGA trvá obvykle několik (5-10) minut.  Pokud se hodnota výrazně nemění (o víc než 1-2 ppm) během jedné minuty, lze ji považovat za ustálenou.  Při odečtu po delší době (10-15 minut) může být hodnota ovlivněna zpomalováním respirace z důvodu vysychání vzorku!!! Gazometrické měření rychlosti respirace  Ukončení měření  Po odečtu ustálené hodnoty koncentrace CO2 odečíst také teplotu vodní lázně a hodnotu průtoku vzduchu v systému  Odpojit baňku s rostlinným vzorkem (možno připojit baňku s dalším vzorkem a pokračovat v měření, nebo připojit prázdnou baňku a zopakovat měření referenční hodnoty CO2) Gazometrické měření rychlosti respirace  Ukončení měření  Vyjmout vzorek z baňky  Uložit vzorek do označeného papírového sáčku pro usušení (nutno stanovit sušinu) Gazometrické měření rychlosti respirace  Výpočet rychlosti respirace  Vr = (Дc(CO2) * f * k) / m (µmol.g-1.h-1)  Дc(CO2) – rozdíl referenční a ustálené hodnoty koncentrace CO2 v ppm  f – průtok (přepočítat z L/min na L/h !!)  m – hmotnost sušiny vzorku (g)  k – koeficient pro přepočet koncentrace CO2 z ppm na látkové množství v závislosti na atmosférickém tlaku a teplotě k = (n/V) = p / ( R * T), kde p je atmosférický tlak (průměrně 101 kPa), R je univerzální plynová konstanta (8,31447 kPa mol-1 K-1), T je absolutní teplota vodní lázně v době měření (273,15 K + t[°C])