Cvičení z fyziologie rostlin
8. Fotosyntetické pigmenty
Rostlinné pigmenty
 Rozpustné ve vodě („hydrochromy“):
 Flavonoidy: antokyany, flavonoly, flavony
 Lokalizované ve vakuolách („vakuolární barviva“),
 Barvy – fialová, modrá, růžová, načervenalá (antokyany)
- bělavá, nažloutlá (flavony a flavonoly)
 reakce na pH (antokyany), barevnost květů, plodů, stonků a dalších
částí rostlin, ochrana před UV zářením
 Rozpustné v tucích („lipochromy“):
 Cyklické tetrapyroly (chlorofyly), karotenoidy
 Lokalizované v plastidech („plastidová barviva“)
 Barvy – zelená, modrozelená, žlutozelená (chlorofyly)
- žlutá, oranžová, červená (karotenoidy)
 fotosyntéza (zachytávání energie fotonů, excitace elektronů),
barevnost zelených částí rostlin (chlorofyly), květů, plodů, zásobních
orgánů (karotenoidy)
Fotosyntetické pigmenty
CHO
Chlorophyll b
Fotosyntetické pigmenty
 Absorbují viditelné záření v modré a červené oblasti
Fotosyntetické pigmenty
 Chlorofyly:
 Chl a, chl b – vyšší rostliny, další formy u řas, sinic a bakterií
 Zachycení energie fotonu, excitace elektronu
 Chl b -> chl a -> chl a (P680) v reakčním jádru fotosystému II
(a P700 v reakčním jádru fotosystému I)
 Karotenoidy:
 Přídatné pigmenty, zachycení energie fotonu a předávání na
chlorofyly
 Ochranná funkce – disipace nadbytečné excitační energie v
xantofylovém cyklu
 Obsah pigmentů a vzájemné poměry ve vyšších rostlinách
 Obvykle Chl a : chl b – 3:1, Chl (a+b): karotenoidy – 5:1 a více
 Změna při stresu (vliv toxické látky, nedostatek živin, dostupnost
světla…), často pokles obsahu chl a, nebo zvýšení obsahu
karotenoidů
Metody stanovení obsahu
fotosyntetických pigmentů
 Přímé – přesné, destrukční, nutná extrakce pigmentů z biomasy
 Extrakt v nepolárním rozpouštědle (methanol, ethanol, aceton, DMSO
…)
 Chromatografická analýza – dělení a kvantifikace separovaných
složek
např. tenkovrstevná chromatografie (TLC), kapalinová
chromatografie (HPLC)
 Spektrofotometrická analýza – kvantifikace ve směsi podle optické
absorbance extraktu
 Nepřímé – méně přesné, jen pro některé pigmenty, možná
detekce pigmentů in vivo bez extrakce
 Optické metody na základě reflektance nebo fluorescence
Přímé metody stanovení pigmentů
 Nutná extrakce do nepolárního rozpouštědla
 TLC
 (HP)LC
© wiki
Přímé metody stanovení pigmentů
 Nutná extrakce do nepolárního rozpouštědla
 (Spektro)fotometrické stanovení absorbance
 Měření absorbance při specifických vlnových délkách, přepočet
obsahu jednotlivých složek pomocí multikomponentní analýzy
absorpčního spektra (nutné znát extinkční koeficienty a absorpční
maxima složek)
Nepřímé metody stanovení pigmentů
 Bez extrakce, měření in vivo,
stanovení relativního obsahu pigmentů
 Reflektanční měření:
 Photochemical Reflectance Index (PRI) –
karotenoidy, porovnání reflektance při
vlnových délkách okolo 500 až 600 nm
 Normalized Difference Vegetation Index
(NDVI) – chlorofyly, porovnání reflektance
při vlnových délkách viditelné a blízké
infračervené (NIR) části spektra
 Fluorescenční měření:
 Nitrogen-Flavonol Index (NFI) a relativní
obsahy chlorofylu, karotenoidů, a
antokyanů
Nepřímé metody stanovení pigmentů
 Fluorescenční měření:
 Vhodné také pro detekci řas a sinic ve vodě (fytoplankton,
fytobentos) na základě přítomnosti chlorofylu a
(u sinic i na základě přítomnosti fykocyaninu)
 Excitace chl a energií zachycenou přídatnými pigmenty (chl b,
karotenoidy, fykobiliny)
 Kvantifikace podle kalibrace
 Ukazatel čistoty koupacích vod !!!
Světlo
Proč měříme obsah pigmentů?
 Celkový obsah chlorofylů, poměr chlorofylu a a b
 Dostatek chlorofylů = efektivní fotosyntéza, nedostatek =
důkaz nedostatku živin, malý výkon fotosyntézy, slabý růst
 Poměr chl a/chl b – obvykle 3:1, změna při změně
podmínek (dostupnost světla, vliv stresu)
 Obsah karotenoidů
 Zvýšený obsah – možný vliv stresu
 Stanovení dynamických změn v reakci na podněty
(např. stres)
Praktické návody
Stanovení obsahu fotosyntetických
pigmentů
Úloha:
Vliv deficienci vybraných makroživin (N, P, Fe) na obsah
fotosyntetických pigmentů v listech rostlin kukuřice
 Materiál: listy rostlin kukuřice pěstovaných v živném roztoku bez
vybraných makroživin (N, P, Fe)
 Úkoly: Spektrofotometricky stanovte obsah chl a, chl b a karotenoidů
a jejich vzájemné poměry v listech nedostatkem živin ovlivněných
rostlin.
 Hypotéza: Obsahy a poměry pigmentů v listech deficientních rostlin se
budou lišit v závislosti na významu konkrétní živiny pro růst a na rozsahu
poškození způsobeném jejím nedostatkem.
Stanovení obsahu pigmentů
 Pomůcky a potřeby:
 Rostlinný materiál: rostliny kukuřice (Zea mays) pěstované za
nedostatku živin (bez N, P, Fe)
 Potřeby: sestava pro filtraci (stojan, nálevky), odměrné válce a
baňky (25 mL), filtrační papír, třecí misky s tloučky, nůžky, tyčinka,
ubrousky, spektrofotometrické kyvety
 Chemikálie:
mořský písek,
MgCO3,
aceton (100%)
 Přístroje: váhy,
spektrofotometr
Stanovení obsahu pigmentů
Provedení:
Extrakce pigmentů
 Označit si třecí misky
a odměrné sklo podle
variant
 Odebrat vzorek listu
a rozstříhat jej na malé
kousky
 Odvážit přibližně
250 mg, zaznamenat si
přesnou hmotnost
 Kousky listu přesypat do
třecí misky, přidat malé
množství mořského písku
a MgCO3.
Stanovení obsahu pigmentů
Provedení:
Extrakce pigmentů
 Za přikapávání acetonu kousky
listů pomocí tloučku rozetřít na
jemnou kaši
 Připravit si filtrační soupravu
(stojan, nálevka, filtr zvlhčený
acetonem, odměrný válec)
 Extrakt zfiltrovat – tekutinu z
misky opatrně přelít po tyčince
do filtru
 Do misky znovu přidat malý
objem acetonu, promíchat
a slít na filtr
 Postup opakovat do úplného
odbarvení hmoty v misce
Stanovení obsahu pigmentů
Provedení:
Extrakce pigmentů
 Spláchnout zbytky barviv z okrajů
filtru
 Extrakt přelít z odměrného válce
do baňky
 Objem upravit na finální hodnotu
(25 mL)
 Vzorek dobře promíchat
a uzavřít zátkou
 Extrakci zopakovat pro každou
zkoumanou variantu
Stanovení obsahu pigmentů
Měření:
Příprava spektrofotometru
 Po spuštění spektrofotometru nastavit
první vlnovou délku pro měření
absorbance (stisknout „GOTO WL“, zadat
čísly vlnovou délku, potvrdit „ENTER“)
 U dvoupaprskového spektrofotometru dát
do zadní pozice kyvetu s acetonem
(blank)
 Pro vynulování dát do přední
pozice také kyvetu s acetonem
a stisknout „AUTO ZERO“
Stanovení obsahu pigmentů
Měření:
Měření absorbance
 Po nastavení spektrofotometru
nalít do přední kyvety vzorek
extraktu, kyvetu otřít a vložit
zpět do přístroje
 Zavřít kryt přístroje a zaznamenat si hodnotu
absorbance.
Hodnota absorbance by se měla pohybovat
optimálně v rozmezí 0.2 až 0.8 (max. 1.0).
Vzorky s vyšší absorbancí je nutno zředit přesným
objemem acetonu a změnu celkového objemu
vzorku si poznamenat.
 Měření při nastavené vlnové délce provést pro
všechny vzorky.
Poté změnit vlnovou délku, provést vynulování
a opět pokračovat v měření celé sady vzorků.
Princip spektrofotometrické
detekce pigmentů v extraktu
470 nm 646 nm 663 nm
Stanovení obsahu pigmentů
 Vyhodnocení
 Pro každý vzorek je třeba zaznamenat:
 Navážku použitou pro extrakci
 Celkový extrakční objem (včetně případného ředění)
 Absorbanci při 663, 646 a 470 nm.
 Výpočet obsahu pigmentů:
1) přepočet absorbance na koncentraci pigmentů v
extraktu pomocí rovnic multikomponentní analýzy:
C(chl a) = 12,21×A663 - 2,81×A646 [µg/mL]
C(chl b) = 20,13×A646 - 5,03×A663 [µg/mL]
C(c+x) = (1000×A470 - 3,27×C(chl a) - 104×C(chl b))/198 [µg/mL]
Podle Wellburn A.R. (1994), J. Plant Physiol. 144: 307-313,
pro 100% aceton a 1 cm kyvety
Stanovení obsahu pigmentů
 Výpočet obsahu pigmentů
2) přepočet koncentrací na extrakční objem a navážku
Získané koncentrace Chl a, Chl b a karotenoidů vynásobit
extrakčním objemem a s pomocí hodnoty navážky
vyjádřit obsah v mg na 1 gram čerstvé hmotnosti listu
(mg/g č.hm.).
 Pokud bylo měřeno více vzorků téže varianty, výsledné
hodnoty zprůměrovat.
 Pokud je známá plocha části listu použité pro extrakci, lze
obsah pigmentů vyjádřit i jako obsah na listovou plochu,
např. mg/cm2 .
Stanovení obsahu pigmentů
Výsledková tabulka
Stanovení obsahu pigmentů
Úkoly:
 Ze zadaných dat vypočítejte obsah pigmentů na
gram čerstvé hmotnosti listu.
 Porovnejte průměrné hodnoty – jak se liší v obsahu
chlorofylů a karotenoidů jednotlivé varianty kukuřice?
 Z průměrných hodnot vypočítejte poměr obsahu
chlorofylu a ku chlorofylu b (chl a/chl b) a poměr
obsahu chlorofylů ku karotenoidům (chl a + chl b /
car) – jak se hodnoty liší u jednotlivých variant? Blíží se
poměr chl a / chl b teoreticky udávané hodnotě 3:1?