Cvičení z fyziologie rostlin 9. Fytohormony Fytohormony  Obecněji „růstové regulátory“ (= včetně syntetických látek)  Organické molekuly (zejména endogenního původu) – syntéza v určité části rostliny, transport do jiné části, fyziologický účinek v nízkých koncentracích  Regulace růstu a vývoje rostliny, udržování celistvosti rostliny  udržování správných vztahů na úrovních buňka – pletivo – orgán, zprostředkování komunikace, přenos informace o změně jedné části rostliny do ostatních částí, korelace růstu (vztahy mezi orgány související s růstem), podpora regenerace při porušení celistvosti.  Působení stimulační i inhibiční  Skupiny růstových regulátorů  Auxiny  Cytokininy  Gibereliny  Etylen  Kyselina abscisová  Kys. jasmonová,  Brasinosteroidy  Polyaminy, oligosacharidy, oligopeptidy….. Účinky fytohormonů  Auxiny:  Syntéza ve vzrostném vrcholu a mladých listech, transport bazipetální do starších částí rostliny  Přirozené: kys. indolyl-3-octová (IAA), kys. indolyl-máselná (IBA), kys. fenyloctová (PAA)  Umělé: kys. naftyloctová (NAA), kys. 2,4-dichlorfenoxyoctová (2,4-D), …  Stimulují: prodlužovací růst (stonku i kořene), fototropismus, gravitropismus, polarita buněk/pletiv/orgánů, vývoj cévních svazků, vývoj plodů, tvorba adventivních kořenů, regenerace  Inhibují: tvorba postranních výhonů do určité vzdálenosti od vzrostného vrcholu (tzv. apikální dominance) IAA Účinky fytohormonů  Cytokininy  Syntéza v kořenech a v intenzivně se dělících meristémech, transport z kořenů do nadzemní části  Benzyladenin (BA), benzylaminopurin (BAP), m-topolin (mT), zeatin (Z), izopentenyladenin (iP)…  Stimulují – buněčné dělení, regenerace, větvení nadzemní části (potlačení apikální dominance), zpomalení stárnutí, odolnost vůči stresu, diferenciace plastidů, tvorba chlorofylu, tvorba zásob škrobu  Důležitá je správná rovnováha s auxiny a dalšími fytohormony Zeatin Účinky fytohormonů  Gibereliny  Syntéza v celé rostlině, nejvíce v oblastech aktivního růstu  Kys. giberelová (GA3) a další - GA4, GA12 ,… více než 80 látek  Stimulují: prodlužovací růst stonku (spolu s auxiny), jarovizace, indukce kvetení, indukce klíčení semen (spuštění rozkladu zásobních látek z endospermu pro výživu embrya) Kys. giberelová, G3 Účinky fytohormonů  Kyselina abscisová (ABA)  Syntéza v dormantních orgánech (pupeny, semena, zásobní orgány), v kořenových špičkách, v listech; transport z kořenů do nadzemních částí  Stimuluje: stárnutí (senescence) pletiv a orgánů, opad listů, regulace vodního provozu – uzavření průduchů při suchu, indukce obranné reakce při stresu  Inhibuje: prodlužovací růst a rychlost růstu, způsobuje dormanci (podle rovnováhy s gibereliny) Účinky fytohormonů  Etylen  Plynný fytohormon  Produkt oxidace kys. 1-aminocyklopropan-1-karboxylové (ACC), syntéza ve stárnoucích pletivech, dozrávajících plodech, také v reakci na stres (zejména poranění)  Stimuluje: radiální růst (tloustnutí stonků a kořenů), dozrávání plodů, tvorba odlučovací vrstvy při opadu listů  Inhibuje: prodlužovací růst a gravitropické reakce, zavírání průduchů způsobené ABA Stanovení obsahu fytohormonů  Plynný etylen se stanovuje přímo ze vzduchu okolo rostliny pomocí plynové chromatografie  Ostatní fytohormony (v aktivní i neaktivní formě a prekurzory):  Homogenizace biomasy v kapalném dusíku (nutná nízká teplota!)  Extrakce polárními (nebo nepolárními) rozpouštědly  Nutné přečištění extraktu (iontoměniče, C-18 Sep-Pak kolonky), použití antioxidantů  Analýza:  kapalinovou nebo plynovou chromatografií s hmotnostní detekcí  Radioimmunoassay (RIA) – použití radioaktivně značené analogické látky, soupeření o vazebná místa na protilátkách, vyhodnocení podle podílu radioaktivity  Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) – vazba fytohormonu na specifické protilátky, navázání způsobí aktivaci enzymu, který přemění substrát na barevný produkt – barevná reakce, kolorimetrické vyhodnocení Využití fytohormonů v praxi Rostlinné biotechnologie:  Kultivace a množení rostlin in vitro, mikropropagace, udržování odrůd, … (nutná správná rovnováha auxinů a cytokininů)  Řízkování a zakořeňování (auxiny)  Urychlení klíčení semen, jarovizace a indukce kvetení, větší nasazení plodů (gibereliny)  Řízení dozrávání plodů (etylen) při transportu na dlouhé vzdálenosti Práce s fytohormony, kultivace in-vitro V rámci předmětů vyučovaných na ÚEB-EBR  Bi6120 Rostlinné explantáty  Bi8670 Principy rostlinných biotechnologií Kontaktní osoba: Mgr. Hana Cempírková, Ph.D. Praktické návody Vliv fytohormonů na růst a vývoj rostlin Úloha 1: Sledování projevů apikální dominance u klíčních rostlin hrachu Úloha 2: Indukce tvorby adventivních kořenů auxinem Úloha 1 – Regulace vývoje klíčních rostlin  Princip: (experiment podle prof. Rudolfa Dostála (Dostál, 1959)) Auxiny produkované vzrostným vrcholem klíční rostliny a obsažené v dělohách způsobují apikální dominanci vzrostného vrcholu, a brání tak rozvoji postranních, tzv. kotylárních pupenů (kotylárů) umístěných těsně nad dělohami. Odříznutí vzrostného vrcholu, nebo jedné dělohy a nebo aplikace umělého zdroje auxinů na místo vzrostného vrcholu nebo na obnaženou dělohu změní rovnováhu fytohormonů a způsobí změnu ve vývoji kotylárů. Úloha 1 – Regulace vývoje klíčních rostlin Hypotézy:  Odstranění epikotylu (přirozeného zdroje auxinů; -E) zruší apikální dominanci a umožní rozvoj obou kotylárů.  Odstranění epikotylu a jedné dělohy (-D) poruší rovnováhu auxinů a umožní rozvoj kotyláru nad odstraněnou dělohou.  Aplikace auxinu na jednu dělohu (IAA+D) posílí inhibiční vliv dělohy a vzniklá nerovnováha umožní rozvoj kotyláru nad neošetřenou dělohou.  Aplikace auxinu na řeznou plochu po epikotylu (IAA-E) zachová apikální dominanci vzrostného vrcholu a kotyláry se vyvíjet nebudou. Kontrola -E -D IAA-EIAA+D Úloha 1 – Regulace vývoje klíčních rostlin  Pomůcky a potřeby:  Rostlinný materiál: klíční rostliny hrachu (Pisum sativum) pěstované ve tmě v destilované vodě  Potřeby: pinzeta, žiletka, párátka, popisovač  Chemikálie: lanolinová pasta s přídavkem 1% kys. indolyl-3-octové (IAA) Úloha 1 – regulace vývoje klíčních rostlin  Provedení:  Příprava rostlin:  Označit kultivační nádobu pořadovým číslem  Označit rostliny podle zkoumaných variant (popis na kultivační nádobě)  „-E“ – rostlina bez epikotylu  „-D“ – rostlina bez epikotylu s odstraněnou jednou dělohou  „IAA-E“ – rostlina bez epikotylu s aplikací pasty s IAA na řeznou plochu  „IAA+D“ – rostlina bez epikotylu s aplikací pasty s IAA na obnaženou jednu dělohu  Rostlina uprostřed nádoby bude sloužit jako neošetřená kontrola Úloha 1 – regulace vývoje klíčních rostlin  Provedení:  Příprava rostlin:  „-E“ – rostlina bez epikotylu  žiletkou odříznout epikotyl (zhruba 1cm od semene, pod prvními šupinovitými palisty)  „IAA-E“ – rostlina bez epikotylu s aplikací pasty s IAA na řeznou plochu  Žiletkou odříznout epikotyl  Na řeznou plochu nanést pastu s IAA Úloha 1 – regulace vývoje klíčních rostlin  Provedení:  Příprava rostlin: „-D“ – rostlina bez epikotylu s odstraněnou jednou dělohou  Klíční rostlinu šetrně vyjmout ze substrátu  Žiletkou odříznout epikotyl  Pomocí pinzety šetrně sloupnout osemení  Žiletkou odříznout jednu z děloh  Rostlinku zasadit zpět do substrátu Úloha 1 – regulace vývoje klíčních rostlin  Provedení:  Příprava rostlin: „IAA+D“ – rostlina bez epikotylu s aplikací pasty s IAA na obnaženou dělohu  Klíční rostlinu šetrně vyjmout ze substrátu  Žiletkou odříznout epikotyl  Pomocí pinzety šetrně sloupnout osemení (celé nebo alespoň z jedné dělohy)  Jednu obnaženou dělohu potřít pastou s IAA  Rostlinku zasadit zpět do substrátu Úloha 1 – regulace vývoje klíčních rostlin  Vyhodnocení: Po 7-14 dnech kultivace na světle vyhodnotit stav rozvoje kotylárů Kontrola -E -D IAA-EIAA+D Úloha 1 – regulace vývoje klíčních rostlin Kontrola: normální vývoj hlavního stonku -E IAA-E Rostlina bez epikotylu (-E): rozvoj obou kotylárů, z nich nové postranní výhony Pahýl epikotylu Rostlina bez epikotylu s aplikací IAA na řeznou plochu (IAA-E): - kotyláry se nevyvíjí (zachována apikální dominance) - pahýl epikotylu deformovaný (ztloustlý) s častým výskytem nových adventivních kořenů Úloha 1 – regulace vývoje klíčních rostlin Kontrola: normální vývoj hlavního stonku -D IAA+D Rostlina bez epikotylu a jedné dělohy (-D): rozvoj kotyláru nad odstraněnou dělohou Pahýl epikotylu Rostlina bez epikotylu a s jednou dělohou ošetřenou IAA (IAA+D): rozvoj kotyláru nad neošetřenou dělohou Aktivní kotylár Úloha 2 – Indukce tvorby adventivních kořenů  Princip: Vhodná koncentrace auxinu (např. okolo 10-7 až 10-5 M) indukuje tvorbu adventivních kořenů v nodech částí stonků („stonkových řízcích“), ale i v jiných orgánech (např. řapíky a čepele listů). Nízká koncentrace (menší než 10-7 M) může indukovat jen malý počet nových adventivních kořenů. Vysoká koncentrace (10-4 M a vyšší) může sice indukovat vznik velkého počtu adventivních kořenů, ale vysoká koncentrace auxinu inhibuje jejich další růst a vývoj, takže zůstávají zakrslé a nevyvíjí se. Úloha 2 – Indukce tvorby adventivních kořenů  Pomůcky a potřeby:  Rostlinný materiál: vrcholové řízky stonků rostliny Tradescantia  Potřeby: žiletka, preparační jehla, zkumavky, fólie/parafilm, popisovač  Chemikálie: vodné roztoky kys. indolyl-máselné (IBA) o koncentracích 10-5 M a 10-4 M Úloha 2 – Indukce tvorby adventivních kořenů  Provedení:  Upravit vrcholové řízkyzachovat vrchol se 2-3 nejmladšími listy, odstranit ostatní listy, upravit délku řízku, zachovat 2-3 nody  Do zkumavek nalít po okraj roztok IBA nebo vodu (kontrola), utěsnit fólií/parafilmem  Prorazit ve fólii otvor a vložit řízek Úloha 2 – Indukce tvorby adventivních kořenů  Vyhodnocení: Po 7-14 dnech kultivace na světle vyhodnotit počet a délku adventivních kořenů u jednotlivých variant Kontrola IBA 10-5 M IBA 10-4 M Úloha 2 – Indukce tvorby adventivních kořenů Kontrola IBA 10-5 M IBA 10-4 M Kontrola – v každém nodu 1 až 10 dlouhých adventivních kořenů IBA 10-5 M – v každém nodu 10 a více krátkých adventivních kořenů IBA 10-4 M – v každém nodu 10 a více zakrnělých základů (primordií) adventivních kořenů, které se dále nevyvíjí kvůli inhibující koncentraci auxinu