ÚLOHA 8: Turbidimetrické stanovení protilátek třídy M (IgM)
Chemikálie a roztoky
1. Komerční lidské sérum s koncentrací IgM 2 g/l
2. Fyziologický roztok
3. Komerční kit pro stanovení IgM (reagent R1 a R2)
Vzorek: Komerční lidské sérum s neznámým množstvím IgM.
Přístroje a pomůcky
Spektrofotometr pro UV oblast schopný měřit při vlnové délce 340 nm.
Postup
1. Ze zásobního komerčního séra o známé koncentraci IgM si do dvojice připravíme řadu ředění pro
kalibraci
a) do 1. zkumavky napipetujeme 10 μl komerčního séra
b) do 2. - 3. zkumavky napipetujeme 5 μl fyziologického roztoku
c) z 1. zkumavky přeneseme 5 μl do 2. zkumavky, důkladně promícháme, poté přeneseme
5 μl do 3. zkumavky
Označení zkumavky 1. 2. 3.
Fyziologický roztok 5 µl 5 µl
Vzorek - - Antigen
(sérum) 10 µl - Ředění:
Konc. 2x 4x
Koncentrace: 2 g/l
Celkový objem: 5 µl 5 µl 10 µl
2. Smícháme antigen (řada ředění séra o známé koncentraci IgM a vzorek) s protilátkou (antisérum
s anti-IgM) a reakčním pufrem
a) přímo na destičku napipetujeme do čtyř jamek po 160 µl reagentu R1
b) poté přidáme do jamek 1,5 µl připraveného standardu nebo vzorku
c) promícháme a 20 s počkáme
d) nakonec do všech jamek napipetujeme 40 µl reagentu R2
3. Reakční směs v jamkách promícháme a mikrotitrační destičku inkubujeme minimálně 4 minuty,
aby došlo k vytvoření imunokomplexů.
4. Po uplynutí dané doby ještě jednou promícháme a změříme absorbanci při vlnové délce 340 nm.
Hodnocení
Výstupem je série hodnot v tabulce, ve které jsou uvedeny hodnoty absorbance pro každou jamku.
Absorbance je bezrozměrná veličina, která udává množství pohlceného světla. Získáte 3 hodnoty
absorbancí pro sestavení kalibrační křivky a hodnotu pro vzorek.
Vytvořte lineární kalibrační přímku se zobrazením rovnice regrese a hodnoty spolehlivosti. Pomocí
této rovnice spočítejte koncentraci imunoglobulinů ve vzorku.
5 µl 5 µl
Výstup
1) Tabulka hodnot (koncentrace a absorbance) kalibračních sér a vzorku.
2) Bodový graf s proloženou lineární regresní křivkou, hodnotou spolehlivosti R a rovnicí regrese