Příprava kardiomyocytů a studium kardiomyogeneze Co děláme: Tvoříme kardiomyocyty in vitro z kmenových buněk Selhání srdce Rakovina Násilí Nejčastější příčina úmrtí… HEART%20MUSCLE%20HI%20MAG1 Proč: KARDIOMYOCYTY MYOKARD SRDCE Testování farmak Transplantace Pochopení mechanismů vývoje Studium patofyziologie srdce/myokardu Studium fyziologických zákonitostí A další…. Jak to děláme: -> Na miskách, in vitro, techniky tkáňových kultur a molekulární biologie EBkapky2 Jak to děláme: Příprava kardiomyocytů A) z pluripotentních kmenových buněk Vnitřní buněčná masa (embryoblast) Embryonální kmenové buňky ESC Indukované pluripotentní kmenové buňky iPSC Reprogramování Yamanakovy factory (Oct4, Klf4, Sox2, c-myc) Izolace Izolace Diferenciace 5 0 3 7 GiWi CHIR 99021 1 XAV939 B27-INS B27+INS 1:1 old:new medium 14 20 30 -4 24h! 72h! RPMI 0 3 8 6 BAC BMP4 Activin A CHIR99021 XAV939 14 20 30 -4 days days Jak to děláme: Příklad základních protokolů přeměny pluripotentních kmenových buněk na kardiomyocyty Pluripotentní kmenové buňky Zralý kardiomyocyt Nezralé kardiomyocyty hiPSC 50 ds differentiation Human myocard Day 0 5 6 8 12 14 20 EBs in non-adhesive culture with serum EBs in adhesive culture without serum qRT-PCR analysis Cardiomyocyte quantification Electrophysiology Ca2+ eflux Hypoxia d 12 - 14 d 6 - 8 d 6 - 14 continuous Jak to děláme: Příklad základních protokolů přeměny pluripotentních kmenových buněk na kardiomyocyty Protokoly kardiomyogeneze u pluripotentních buněk mimikují podmínky in vivo vývoje Příprava kardiomyocytů B) Z kmenových buněk myokardu (zatím hypotetické) Metody – I. fenotyp qRT-PCR Immunocytochemistry Western blot MHC Nkx2.5 (GFP) β-Actin - + D7 D8 D9 D10 D12 D14 - + - + - + - + - + TPA Patch clamp - analýza dynamiky depolarizace membrány Metody – IIa. funkce Multielectrode array – MEA - změny v povrchovém napětí Metody – IIb. funkce Ca2+ ion flux 10 s Control 5mM Epinephrine Video analýza Pluripotent stem cell cardiomyocyte Differentiated mixed cell population Purified cardiomyocytes Differentiation Purification ? Improved protocol ? Problémy => Efektivita a čistota protokolů – vznikají i jiné typy buněk než požadujeme TPA PKC ERK gene expression cardiomyocyte Embryonic stem cells Germ layers progenitors within embryoid body Differentiating cells of various lineages Příprava kardiomyocytů - hledání látek vedoucí k proliferaci kardiomyogenních progenitorů Jak vylepšit efektivitu kardiomyogeneze => vliv různých biologicky aktivních látek 0 1 5 3 7 20 CHIR99021 XAV939 1 DMSO 1uM TPA 9 0 1 5 3 7 20 CHIR99021 XAV939 2 9 0 1 5 3 7 20 CHIR99021 3 9 0 1 5 3 7 20 CHIR99021 4 9 0 1 5 3 7 20 CHIR99021 5 9 0 1 5 3 7 20 CHIR99021 6 9 0 1 5 3 7 20 CHIR99021 XAV939 7 9 DMSO 1uM TPA DMSO 1uM TPA DMSO 1uM TPA XAV939 DMSO 1uM TPA DMSO 1uM TPA XAV939 1uM TPA Myl2 Myl7 b actin MF20 Troponin T D T D T D T D T D T 1 3 4 5 6 7 2 Western blot analýza exprese proteinů specifických pro kardiomyocyty Days Adultní srdce Fetální srdce iPSC Vlastnosti Morfologie Substrát pro výrobu ATP glukóza glukóza mastné kyseliny menší, oválné, jednojaderné menší, oválné, jednojaderné velké, podlouhé, (viacejaderné) BUŇKY Sila kontrakce Kontrakce 0.1–0.5 mN/mm2 10–50 mN/mm2 cca 0.4 mN/mm2 spontánní, asynchronní spontánní, asynchronní indukovaná, synchronní Vápnikové kanály T-typ/L-typ T-typ/L-typ L-typ Mitochondrie oválne, uspořádané, s kristami, zabírají 35% objemu buňky malé, okrouhlé, neuspořádané, bez kríst malé, neuspořádané, bez kríst, v menším počtu Problémy => Zralost kardiomyocytů – in vitro připravené kardiomyocyty steží dosahují zralosti embryonálních kardiomyocytů … tvořený mnoha typy buněk Srdce -První funkční orgán organismu -Komplikovaný vývoj -Nezbytné pro život větších živočichů Problémy => Specifita kardiomyocytů – není kardiomyocyt jako kardiomyocyt, vzniká směs různých typů kardiomyocytů MATURACE & FENOTYP E – den embryonálního vývoje A - atrium H – srdce V - ventrikulum Analýzy spotřeby kyslíku NORMOXIA H 6-8 H 6-14 H 12-14 Analýzy morfologie buněk – délka sarkomer MATURACE & FENOTYP Obrázok, na ktorom je šálka, tanier, káva, malé Automaticky generovaný popis Tkáňové řezy – kultivace tkáně in vitro, izolace jednotlivých buněk, srovnání vlivu in vitro podmínek na fenotyp buněk MATURACE & FENOTYP Spolupráce: Markéta Bébarová & Tomaš Bárta, Lékařská fakulta MU PŘÍPRAVA IPSC, PŘÍPRAVA IPSC Z PACIENTŮ S VADOU SRDCE A JEJICH PŘEMĚNA NA KARDIOMYOCYTY PRO STUDIUM PODSTATY DANÝCH VAD, PERSONALIZOVANÁ TERAPIE Petr Humpolíček, Fakulta technologická, Univ. Tomaše Bati ve Zlíně VÝVOJ NOVÝCH MATERIÁLŮ PRO TKÁŇOVÉ INŽENÝRSTVÍ A BIOMONITORING Lukáš Kubala, Biofyzikální ústav AV CR, Brno BIOCHEMICKÉ ANALÝZY Náměty na téma závěrečných prací: https://is.muni.cz/auth/osoba/6371#skolitel Variace na témata: Jak regulovat fenotyp kardiomyocytů, jejich zralost, jejich specializaci? Je možné připravit kmenové buňky myokardu? Jak toho dosáhnout? JIPAlab – OFIŽ, Ústav experimentální biologie, Masarzkova univerzita Univerzitní kampus Bohunice D36; https://www.sci.muni.cz/ofiz/pachernik/ Jiří Pacherník jipa@sci.muni.cz D36/111 Publikace: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Pachernik&sort=pubdate Závěrečné práce: https://is.muni.cz/auth/osoba/6371#skolitel 2021