Speciální metody fyziologie živočichů Vítězslav BRYJA OFIŽ Ústav experimentální biologie, PřF MU Význam bakalářské práce Co jste možná nevěděli Možnost zapsat si: Bakalářská práce nyní může být i praktická Časopisový klub Imunologie I a II Časopisový klub Fyziologie živočichů I a II Časopisový klub Vývojová biologie I a II Nancy Papalopulu MODEL XENOPUS Zahrnuty základní i pokročilé metodiky: • “live imaging” a konfokální mikroskopie, • optogenetika, • biofyzika and NMR spectroskopie, • genetické manipulace, • molekularní & buněčná biologie metabolismus METODY Mgr. Tomáš Bárta, PhD & Čím se zabýváme Lidské pluripotentní kmenové buňky Ectoderm Mesoderm Endoderm Lidské embryonální kmenové buňky Oct4, Klf4, Sox2, c-myc Lidské indukované pluripotentní kmenové buňky Čím se zabýváme Retinální organoidy Vnější segmenty fotoreceptorů Průřez retinou Průřezy retinálním organoidem – obarveny fotoreceptory a Opsiny Co studujeme iPSCs ? Co se děje při přeprogramování buněčného osudu? ? Jak vzniká a funguje lidská retina? Jak vytvořit lepší organoidy? Jak fungují cirkadiánní rytmy u lidí? Modelování retinálních onemocnění S kým spolupracujeme Majlinda Lako Evelyn SernagorMikael Altun Johan Boström Valeria Chichagova Michael Andäng Martin Vácha Pavel Krejčí Michaela Bosáková Marcela Buchtová David Staněk Petra Lišková Markéta Bebarová Lyle Armstrong Jiří Pacherník Kdo jsme Canan Çeliker Tomáš Bárta Kamila Weissová Tereza Váňová Postdoci Ph.D. studenti M.Sc. studenti Kateřina Konečná Jana Šebestíková Lucie Pešková – M.Sc. a Ph.D. student Vienna BioCenter, Vienna, Austria Denisa Jurčíková – B.Sc. a M.Sc. student Roche, Switzerland Absolventi A další…. Kontakt: tbarta@med.muni.cz Laboratoř Petera Fabiana Kontakt: Peter.Fabian@med.usc.edu Starting 1.9.2022 • Deadliest gynecological malignancy • Late diagnosis (metastases already developed) • Frequent recurrence of the disease • No significant achievements in earlier diagnosis and better options of treatment (with the exception of PARP inhibitors) • High-grade serous ovarian carcinoma (HGSOC) • 70 % of ovarian carcinomas • 5-year survival rate at the stage of diagnosis – less than 30% • Fast progression - Intraperitoneal dissemination (ascites) • Rarely lymphatic or hematogenous dissemination Ovarian cancer (OvCa) Research scheme WNT / Planar Cell Polarity Pathway Metoda: BioID a hmotnostní spektroskopie BioID – proximity labeling Hmotnostní spektroskopie (Mass Spec) PCP BioID – finding new potential WNT/PCP proteins Credit: T. W. Radaszkievicz and P. Paclíková Baits: DVL3, ROR1, ROR2, PRICKLE1, VANGL2 BioID and MS/MS analysis PCP BioID – finding new potential WNT/PCP proteins Credit: K. Gömöryová RASAL2 MAP4K4 ERBB2IP PARD3 PEAK1 UTRN RAI14 MARK2 PHACTR4 AKAP12 EPHA2 SCRIB AHNAK PTPN13 TJP1 DLG1 DLG5 EPB41L3 EPB41L2 CCDC88A EPB41 AHNAK2 SEPT9 KIAA1217 ARHGAP21 RAPH1 DST CLUSTER 5 PRICKLE1, ROR2, ROR1 Bioinformatics analysis Testing in zebrafish Metoda: Crispr/Cas9 Testing in zebrafish – CRISPR/CAS9 RASAL2 MAP4K4 ERBB2IP PARD3 PEAK1 UTRN RAI14 MARK2 PHACTR4 AKAP12 EPHA2 SCRIB AHNAK PTPN13 TJP1 DLG1 DLG5 EPB41L3 EPB41L2 CCDC88A EPB41 AHNAK2 SEPT9 KIAA1217 ARHGAP21 RAPH1 DST CLUSTER 5 PRICKLE1, ROR2, ROR1 List of genes zebrafish orthologous Epha2a Epha2b Map4k4a Map4k4a Erbin Akab12a Akab12b Phactr4a Phactr4b Pard3aa Pard3ab Pard3ba Pard3bb Peak1 gRNA design PCR and in vitro transcription Preparing RNAs Testing for WNT/PCP phenotypes rCAS9 gRNA + Testing for WNT/PCP phenotypes RASAL2 MAP4K4 ERBB2IP PEAK1 PARD3 UTRN RAI14 MARK2 PHACTR4 AKAP12 EPHA2 PTPN13 SCRIB AHNAK ALMS1 RASAL2 PEAK1 ERBIN PLEKHA5 USP6NL GIGYF2 TANC1 MINK1 DST TESTED POTENTIAL HITS EXCLUDED TJP1 DLG1 DLG5 EPB41L3 EPB41L2 CCDC88A EPB41 AHNAK2 SEPT9 KIAA1217 ARHGAP21 RAPH1 LIST OF GENES 2dpfUninjected control rai14 gRNA injected Total body lenght Preliminary data – Kinocilia orientation Control injection RAI14 gRNA injectedPrim II derived Prim I derived Role nekanonické Wnt dráhy v polarizaci lymfocytů What does a lymphocyte look like? Active lymphocytes are highly polarized cells Automated tracking of CLL cell migration using under-agarose assay DMSO Y27632 CK1 inhibitor inhibits migratory properties of CLL cell lines differently from ROCK inhibitor Future aims circularity Future aims Role nekanonické Wnt dráhy v rozvoji chronické lymfocytární leukémie Dr. Pavlína Janovská Our hypothesis: • Rare ROR1+ B cell subsets in adults represent the origin of CLL Our goals (ongoing project): • To describe phenotype of ROR1+ B cells in adult PB • Describe relation with increasing age • Model the relation of these cells to MBL and CLL cells • Validate the observations by other methods • Describe functional characteristics of ROR1+ B cells (anergy? self-reactive? stereotypic BCRs? cycling capacity? acquisition of typical driver mutations?) • Validate the findings on larger cohort, with focus on early MBL cases • Quantify ROR1+ mature B cells in adult PB • What is their phenotype? • Age-related differences? • Relation to MBL/CLL? Flow cytometry Mass Cytometry (CyTOF) scRNAseq CLL diagnostic Rawstron Ab panel (7 markers) Normal B cell subsets Ab panel (8 markers) Complex Ab panel (28 markers + barcoding) 3` RNAseq ~ 1500 genes/cell PB B cells • Young healthy donors (<40) • Older donors (>60) • MBL patients • CLL patients Bone marrow (BM) B cells • Young donors (<40) (child, no B cell malignancy) • Older donors (>60) (MDS, no B cell malignancy) Methodological approach: Samples: Focus: • B cell maturation in BM and PB • Normal vs CLL Modified 15 Ab panel Spectral cytometry SURFACE INTRA marker B cell maturation CLL vs normal marker B cell maturation CLL vs normal CD38 yes yes i_cPARP apoptosis CD19 yes i_BCL-2 yes yes IgM yes yes CD79B yes yes CD81 yes yes i_Ki-67 proliferation IgD yes i_IgM yes yes CD20 yes yes CD34 yes CD5 yes yes Anti- Human IgG lambda yes yes CD21 yes CD45RA yes CD10 yes pStat3[Y705] yes aROR-1 PE yes yes Anti- Human IgG kappa yes yes CD9 yes CD95 yes yes CD27 yes yes CD24 yes yes PE Ror1 detection Biotin depletion of non-B cells T-bet yes HLA-DR yes CD184 yes yes Mgr. Jitka Stančíková, Ph.D. List of markers CLL 1 CLL 2 BM CD19+ PB B CD19+ unsorted ROR1+ PB B cells MBL PB B cells Differences ROR1+/-? Phenotype? Subsets? MBL clone + remaining B subsets Are they different…?! – Not analyzed yet Plan for scRNAseq Data analysis – Mgr. Jan Stuchly, Ph.D. Dimension reduction >> Mgr. Jan Stuchly, Ph.D. Modeling of most probable developmental trajectories CLL MBL ROR1+ B cells Unsorted B cells BM B cells Monoclonal B lymphocytosis (MBL) CLLMature B cells A specific ROR1+ subset? >> IgM+IgDlow Wnt5-induced signaling in the tissue morphogenesis molecular, cellular and evolutionary aspects PHD WORKSHOP 2022 MGR. PETRA KOMPANÍKOVÁ SUPERVISOR: PROF. V. BRYJA, PH.D. PHD WORKSHOP 2022 MGR. PETRA KOMPANÍKOVÁ Wnt5a Bryja et al., 2017 Metoda: Genetické modifikace myší Transgenní myš Nobelova cena 2007 Mario R. Capecchi, Martin J. Evans and Oliver Smithies za „principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells“ PHD WORKSHOP 2022 MGR. PETRA KOMPANÍKOVÁ Wnt5a Bryja et al., 2017 J. Procházka mouseembryoE16.5 WT Wnt5a KO PHD WORKSHOP 2022 MGR. PETRA KOMPANÍKOVÁ Wnt5a www.robinow.org/ J. Procházka mouseembryoE16.5 WT Wnt5a KO Robinow syndrome PHD WORKSHOP 2022 MGR. PETRA KOMPANÍKOVÁ Choroid plexus E14. 5 Coronalsection Sagittal section In situ credit: Allen brain institute Tt r TtrTtr Lateral & 3rd Choroid Plexus Ttr – epithelial marker of choroid plexus Tt r Ttr Hindbrain Choroid Plexus PHD WORKSHOP 2022 MGR. PETRA KOMPANÍKOVÁ Choroid plexus & Wnt5a Wnt5 a AQP 1 Wnt5a AQP1E13.5 WT Kaiser et al., 2019 AQP 1 AQP 1 Wnt5 a AQP 1 Wnt5a AQP1 DAPI WTE13.5 Metoda: RNA sekvenování (RNA Seq) Centrální dogma molekulární biologie PHD WORKSHOP 2022 MGR. PETRA KOMPANÍKOVÁ PHD WORKSHOP 2022 MGR. PETRA KOMPANÍKOVÁ A. Mikulová PHD WORKSHOP 2022 MGR. PETRA KOMPANÍKOVÁ A. Mikulová PHD WORKSHOP 2022 MGR. PETRA KOMPANÍKOVÁ Wnt signalling and formation of ChPs Kompaníková & Bryja, in revision Dani et al., 2021 PHD WORKSHOP 2022 MGR. PETRA KOMPANÍKOVÁ RFP YFP CFP GFP E14.5Wnt1-Cre2/R26RConfetti Hindbrain Choroid PlexusWnt1-Cre2/R26R Confetti Děkuji za pozornost! Molekulární mechanismus Celogenomové techniky Celoproteomové techniky Experimentální model (in vitro - tkáňové kultury, in vivo myš, C. elegans, Xenopus) Pacient