Buněčná smrt a metody její detekce doc. RNDr. Alena Hyršlová Vaculová, Ph.D. 2022 Speciální metody fyziologie živočichů 37 trilionů buněk v těle Buněčná smrt „nevratné poškození základních buněčných funkcí, které vede ke ztrátě buněčné integrity“ normální tkáň nové buňky buněčná smrt homeostáza • produkce ATP • redoxní rovnováhy • permeabilizace plazmatické membrány • nebo fragmentace buňky (Galluzzi et al., Nomenclature Committee on Cell Death, 2018) … nahrazovány novými buňkami… … dalekosáhlé důsledky… Téma buněčné smrti je vysoce aktuální a intenzívně studované… • buněčná smrt ve vývoji organismu • prenatální i postnatální vývoj • buněčná smrt - zachování homeostázy mnohobuněčného organismu • buněčná smrt ve zdraví a nemoci • deregulace buněčné smrti versus vývoj různých typů onemocnění • využití poznatků a praktické aplikace – řada oborů: • vývojová biologie, buněčná a molekulární biologie, fyziologie, patofyziologie, medicína, toxikologie, mikrobiologie… a mnohé další… (Galluzzi et al, 2018) Jak buňky umírají? … řada způsobů a forem buněčné smrti… morfologie: ◼ zmenšení buňky ◼ bobtnání plazmatické membrány ◼ kondenzace a fragmentace jaderného chromatinu ◼ tvorba apoptotických tělísek ◼ udržení integrity buněčných organel (http://en.wikipedia.org/wiki/Apoptosis) Apoptóza - znaky (Grisham et al., 2014) biochemie: ◼ aktivace specifických enzymů – kaspázy, nukleázy.. ◼ změny ve struktuře a funkci membrán a organel … (Arrora 2017) www.merckmillipore.com (Podcheko, 2015) Apoptóza v lidském těle obnova střevního epitelu reakce imunitního systému homeostáza v epidermis (Perez-Garijo, Steller, 2015) (http://histonano.com/books) (Lippens et al., 2005)(Falschlehner et al. 2009) formace prstů vývoj nervové soustavy regulace menstruačního cyklu ..od embrya po dospělce… (www.vectorstock.com) Apoptóza a nemoci (Walensky, 2006; Schulze-Osthoff et al., 2010) DEREGULACE APOPTÓZY …nadměrné spuštění vs. potlačení… (Hannahan, Weinberg, 2011) http://holistichealthmastery.com • podpora vývoje nádoru • rezistence k protinádorové terapii Apoptóza a nádory různé mechanismy intenzívní výzkum apoptózy – nové poznatky - pokroky v léčbě nádorů? (Melino, Vaux, 2010, upraveno) Buněčná smrt (apoptóza) ve vědecké literatuře početpublikacízarok 1960 1970 1980 1990 2000 2010 Apoptosis 412 854 Apoptosis and cancer 190 865 Cell death 516 122cca 500 000 cca 220 000 cca 465 000 Pubmed April 2021 (according to Calvino-Fernández et al., 2010) Bcl-2 family proteins chemotherapeutic drugs TRAIL Bcl-2 family Jaké jsou konkrétní molekulární mechanismy zodpovědné za průběh apoptózy? Metody detekce apoptózy Detekce apoptózy na různých úrovních v buňce www.promega.com Detekce apoptózy a souvisejících změn na úrovni plazmatické membrány - během apoptózy dochází k charakteristickým změnám v lokalizaci fosfatidylserinu v plazmatické membráně (translokace z vnitřní strány membrány na vnější) - translokovaný PS lze detekovat s využitím annexinu V (fluorescenčně značený) - průtoková cytometrie • protein with high affinity for PS • PS binding dependent on calcium • detection of membrane PS • conjugation with fluorescence probes Annexin V https://cz.pinterest.com/pin/293085888223404525/ www.biovision.com extracellular cytoplasmic extracellular cytoplasmic phosphatidyl- serine Annexin V- conjugate normal cell apoptotic cell extracellular cytoplasmic necrotic cell PIPIPI annexin V propidium iodide staining - - + - + + Annexin V staining: phosphatidylserine exposure Kaspázy - cysteinové proteázy, specificky štěpí proteinové substráty v místě kyseliny asparagové - klíčová úloha v přenosu apoptotického signálu (Thornberry, Lazebnik, 1999) (Opdenbosch, Lamkanfi, 2019) - v inaktivní formě (proenzymy, pro-kaspázy) v cytoplazmě - štěpením vzniká aktivní kaspáza schopná dále štěpit tzv. „death substráty“ a významně se tak podílet na šíření apoptotického signálu a exekuci apoptózy 1. Antibody- based detection of specific caspase fragments 2. Antibody-based detection of endogenous caspase-substrate cleavage 3. Labelled synthetic substrate-based detection of caspase activity 4. Labelled synthetic inhibitor-based detection of caspase activity CK18 (Lavrik et al., 2005) Caspase substrates ANTIBODIES SUBSTRATES/ INHIBITORS Detekce aktivace kaspáz kaspázy jsou klíčové molekuly pro průběh apoptózy, stimulují apoptotické signálování a štěpí řadu substrátů – proteinů důležitých pro život buňky průtoková cytometrie fluorescenční mikroskopie fluorimetrie www.cellsignal.com Detection of caspase-3 cleavage control and STS-treated HT-29 cells, cleaved caspase-3 (green), actin (red), nucleus (blue) etoposide-treated (green) or untreated (blue) Jurkat cells, negative control (red) Jurkat cells, anti-Fas antibody (Taylor et al., 2008) • kondenzace a fragmentace jaderného chromatinu – morfologie jádra • fragmentace jaderné DNA - TUNEL Detekce apoptózy a souvisejících změn na úrovni jádra (Arrora 2017) průtoková cytometrie fluorescenční mikroskopie agarózová elektroforéza apoptosis of anti-Fas-treated HCT116 cells Detekce apoptózy a souvisejících změn na úrovni mitochondrií vylití proapoptotických mediátorů z mitochondrií do cytoplazmy aktivace kaspáz zapojených v regulaci mitochondriální sráhy apoptózy aktivace proapoptotických proteinů z rodiny Bcl-2 průtoková cytometrie fluorescenční mikroskopie změny mitochondriálního membránového potenciálu Nekróza versus apoptóza (Priante et al., 2019) vitální barvení vylití proteinů z buňky morfologie Nekróza – možnosti detekce LDH G6PDH HMGB1 prokaspázy substráty kaspáz ….. eosin trypanová modř propidium jodid DAPI 7-AAD Sytox Blue/Red Live/Dead …. (Priante et al., 2019) (Choi et al., 2019) Autofagie (makroautofagie) • „eating oneself“, katabolický proces, degradace buněčných složek s využitím lysosomů • dynamický, regulovaný, evolučně konzervovaný proces u eukaryotických buněk (kvasinky – člověk) • v závislosti na podmínkách může působit jako: • mechanismus zajišťující přežit • mechanismus buněčné smrti (Chen,Klionsky 2012) (www.wikimedia.org) ◼ formace autofagozomů – (dvoumembránové útvary, elektronová mikroskopie) Autofagie morphologické znaky • lipidace proteinu LC3 (western bloting) • relokalizace LC3-GFP (fluorescenční microskopie) • degradace p62 (western bloting) http://myweb.sabanciuniv.edu/dgozuacik/research/ (Klionsky et al., 2009) nedostatek živin, hladovění biochemické znaky Other types… (Galluzzi et al, 2018)(Tang et al., 2019) …of cell death Jaké jsou konkrétní molekulární mechanismy zodpovědné za průběh buněčné smrti? JINÉ NEŽ APOPTÓZA: (Tang et al., 2019) Kdy je možné považovat buňku za mrtvou? • pokud je splněno alespoň jedno z těchto kritérií: • poškozená integrita plazmatické membrány • fragmentace buňky včetně jádra • buňky nebo jejich fragmenty pohlceny okolními buňkami • za těchto podmínek už není „cesty zpět“… cancer cell molecular mechanisms of: - cancer cell death - anticancer drug action modern methods of analytical cytometry novel therapeutic strategies DEATH modern methods of cell and molecular biology flow cytometry confocal microscopy… Oddělení cytokinetiky (Biofyzikální ústav AV ČR Brno) Jakou zvolit konkrétní metodu? Oddělení cytokinetiky Modelové příklady - člen rodiny TNF, objeven v roce 1995, na základě sekvenční homologie s TNFa and CD95L - selektivní induktor apoptózy u nádorových buněk, in vitro a in vivo - spuštění apoptózy nezávisle na p53 (Ravi et al, 2004) (Lemke & Walczak, 2014) TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand) (Pitti et al, 1996; Wiley et al, 1995) (Ashkenazi et al, 1999; Walczak et al, 1999) LA-12 Platinové komplexy – cis-diamminedichloroplatinum(II) – desetiletí v klinice • léčba řady typů nádorů • mechanismy ne zcela objasněny – vážné vedlejší účinky – problém rezistence některých nádorů (Žák et al., 2004) cisplatina – (OC-6-43)-bis(acetato)(1-adamantylamine)amminedichloro platinum(IV) – překonává rezistenci k cisplatině u některých typů nádorových buněk • (Kozubik et al., 2005; Horváth et al., 2006) – vyšší účinnost než jiné platinové komplexy u nádorů tlustého střeva • (Svihalkova Sindlerova et al., 2010) – více lipofilní, snadnější vstup do buňky • (Kvardova et al., 2010) – specificky moduluje průchod buněčným cyklem nádorových buněk • (Horvath et al., 2007; Vondalova Blanarova et al., 2013) – úloha specifických molekul v regulaci jejího cytotoxického působení • p53, p21 (Vondalova Blanarova et al., 2013; Roubalova et al., 2010) • PTEN (Laukova et al., 2015) • Chk1 (Herudkova et al., 2017) (Calvino-Fernández et al., 2010, upraveno) cisplatin LA-12 DR4, DR5 TRAIL DR5 Procaspase-8 ? LA-12 – zcitlivění nádorových buněk tlustého střeva k apoptóze indukované TRAILem – mechanismus? (Vondalova Blanarova et al., 2011) DR4, DR5 TRAIL DR4, DR5 Procaspase-8 cisplatina LA-12 DR5 mRNA DR5 na povrchu buňky lokalizace DR v lipidových raftech internalizace TRAILu aktivace kaspázy-8 a tvorba komplexu DISC (IPs) DR5 in LRs ? povrchový DR4/5, průtoková cytometrie kolokalizace DR4/5 a LR, fluorescenční mikroskopie DR5 mRNA, qRT-PCR internalizace značeného TRAILu, průtoková cytometrie (according to Calvino-Fernandez et al., 2010) nárůst množství proteinu Bim - nezávislý na p53 - závislý na ERK1/2 Bax/Bak Bim MMP caspase-9 Klíčová úloha mitochondrií a proteinu Bax v posílení apoptózy indukované TRAILem prostřednictvím platinových látek detailnější mechanismus? aktivace proteinu Bax, průtoková cytometrie mitochondriální membránový potenciál (TMRE), průtoková cytometrie (Jelínková et al., 2011) buňky HCT116 cisplatina 10 mM LA-12 0.5 mM amplifikace apoptotického signálu přes mitochondrie aktivace mitochondriální apoptotické dráhy …. mechanismus? Platinové látky zvyšují citlivost nádorových buněk prostaty k apoptóze indukované TRAILem annexin V assay, průtoková cytometrie štěpení kaspázy-3, průtoková cytometrie mitochondriální membránový potenciál (TMRE), průtoková cytometrie DU 145 (Vondalova Blanarova et al., 2011) cisplatina 5-10 mM LA-12 0.5-2.5 mM izolace a kultivace buněk detekce apoptózy … posílení apoptózy včetně mitochondriální dráhy… nádor prostaty Kooperativní cytotoxické působení platinových látek a TRAILu – nádorové buňky - biopsie prostaty (Vondalova Blanarova et al., 2011) annexin V assay, průtoková cytometrie LA-12 … 5 mM TRAIL … 200 ng/ml Bcl-2 family chemoterapeutické látky „apoptosis sensitizers“ TRAIL DR 4/5 efektorové kaspázy mitochondrie rodina Bcl-2 iniciační kaspázy Výzkum protinádorového působení TRAILu – náš přínos… doc. RNDr. Alena Hyršlová Vaculová, Ph.D. vaculova@ibp.cz Bi8870 Mechanismy buněčné smrti, význam, metody vždy v jarním semestru přednáška – 2 hodiny týdně praktické cvičení – 12 hodin blokově - next year both in Czech and in English!!! Zaujalo Vás téma buněčné smrti? více informací v předmětu: Děkuji za pozornost! V případě dotazů nebo zájmu o spolupráci napište na adresu: vaculova@ibp.cz