Sledování parametrů imunitní odpovědi MVDr. Mgr. Monika Dušková, Ph.D. Které parametry imunitního systému měříme •Počty a typy krevních buněk •Fagocytóza •Aktivita komplementového systému •Aktivita lysozymu •Hladiny sérových bílkovin •Hladiny celkových a specifických protilátek •Produkci kyslíkových radikálů •Antioxidační mechanismy S jakým materiálem pracujeme •Buňky ex vivo: plná krev kapilární, žilní • •Tělní tekutiny: plasma, sérum, hemolymfa • •Vzorky lidské: odběry u sportovců, studentů • •Vzorky zvířecí: zamražená plasma, sérum, spolupráce s VFU • Odběr kapilární krve z prstu a separace plasmy Počty a typy krevních buněk • počítání krevních elementů v Bürkerově komůrce • Untitled-2 krevní diferenciál TEORETICKÝ ÚVOD Zjednodušené schéma imunitní reakce 1 Důležité pojmy v IS: antigen a protilátka •Antigen – cizorodá látka, na kterou imunitní systém reaguje tvorbou protilátek. Antigeny jsou části patogenních mikroorganismů -bakterie, viry, houby, plísně, paraziti • •Protilátka – bílkovina tvořená B lymfocyty, která specificky váže antigen a zneškodní ho. • •Třídy protilátek (imunoglobulinů): •IgM, IgG, IgA IgD, IgE •Koncentrace IgG v plasmě: 8 -18 g/l • http://www.wikiskripta.eu/images/thumb/3/31/Mono-und-Polymere.svg/300px-Mono-und-Polymere.svg.png Stanovování množství protilátek •Základní princip: reakce antigenu a protilátky • •Různé způsoby uspořádání, možnost navázat jednu ze složek na nosiče. • •Stanovení: •kvalitativní (izotyp, specifita) x kvantitativní (množství, koncentrace) • •Precipitace: vznik zákalu po reakci Ag – Ab v tekutém prostředí •Popsána v r. 1929 Heidelberg a Kendall • • Stanovení protilátek: nefelometrie, turbidimetrie F4k46-o494 Při reakci Ag a Ab vzniká zákal-precipitát, jehož intenzita je při konstantním množství Ab úměrná koncentraci vyšetřovaného Ag Vhodná pro: kvantitativní stanovaní protilátek ale i jiných sérových proteinů Podmínkou je, aby byla komerčně dostupná protilátka proti stanovované složce. Detekční limity: nefelometrie nad 10 mg/l, turbidimetrie 20 – 30 mg/l. Stanovení protilátek: ELISA metoda Imobilizace jedné ze složek reakce (Ag – Ab) navázáním na pevný povrch (jamka destičky). Druhý reaktant se přidává v roztoku a vytvořené komplexy se detekují pomocí enzymatického systému. Příklad využití metody ELISA pro detekci specifických protilátek v plasmě: 1.Na vnitřní povrch jamek se naváže jeden reaktant (Ab) 2.Přidá se vyšetřovaný vzorek (plasma) s obsahem druhého reaktantu (Ag) 3.Přidá se tzv. konjugát (protilátka proti vyšetřovanému reaktantu – sekundární protilátka - značená enzymaticky) 4.Přidá se substrát pro enzym a detekční systém (sloučenina, která při enzymatické reakci mění barvu) a detekuje se spektrofotometricky 5. ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY = ELISA 2navazeAb Na tuhou fázi se naváže Ab. Na ni se potom navazuje známé nebo neznámé množství antigenu. Přidá se volná enzymem značená Ab, která reaguje s volnými hapteny antigenu imobilizovaného vazbou do komplexu s Ab. Přidá se substrát na detekci enzymové aktivity. Konkrétní schéma použití ELISA metody pro detekci antigenu ve vzorku Konjugát: protilátka s navázaným enzymem – peroxidázou Substrát: peroxidu vodíku Chromogen: ortofenylén- diamin hydrochlorid = OPD. V přítomnosti peroxidu vodíku dochází ke změně barvy, která je detekovatelné na spektrofotometru Imunochemické metody – WikiSkripta Přístroje: ELISA – reader je spektrofotometr upravený na odečítání absorbance v reakčních jamkách. Filtry jsou nastavené s volitelnou vlnovou délkou optimální pro určitý ELISA systém (obvykle mezi 405 až 570 nm) v závislosti na typu použitého konjugátu a substrátovo - chromogenním roztoku. ELISA: pojmy, detekce, výsledek Rozetování erytrocytů způsobené Borrelia burgdorferi sensu lato •Rozetování červených krvinek je známý jev, kdy se erytrocyty formují do shluků, které jsou pozorovatelné pomocí mikroskopu. V sedmdesátých letech 20. století byly rozetové metody velmi významné pro rozlišení, případně separaci základních subpopulací lymfocytů a pro diagnostiku leukémií. • •Dále je fenomén rozetování erytrocytů popsaný při malárii, jejímž původcem je prvok Plasmodium falciparum. Zde se erytrocyty napadené původcem obalují zdravými erytrocyty a vzniklé rozety ucpávají kapiláry a způsobují mikroembolizace. • •Na konci 90. let minulého století bylo zjištěno, že rozety s erytrocyty tvoří i některé druhy borelií vyvolávajících návratnou horečku, např. B. crociduraeu B. hispanica, B. duttonii a B.coriaceae Příklad rozety z erytrocytů nahloučených kolem centrální buňky Kultury Borrelia burgdorferi s. l. Rozety vzniklé při smíchání kultury borrelií s lidskými erytrocyty. ?? Fenomén rozetování může být spojen se závažnějším průběhem onemocnění ?? Foto: T. Lefnerová Otázka závislosti tvorby roset (borrelie plus erytrocyty) na krevní skupině ABO systému Počet rozet v objemu 0,1 μl reakční směsi u jednotlivých vzorků podle krevních skupin • •V prezentaci byly použity obrázky převzaté z: • •Bartůňková, Paulík a kol.: Vyšetřovací metody v imunologii, Grada Publishing, 2005 •Hořejší, Bartůňková: Základy imunologie, Triton, 2002 https://is.muni.cz/auth/osoba/35892#skolitel Realizované závěrečné práce: