lukas.cajanek@gmail.com /cajanek@med.muni.cz Lukáš Čajánek – Primární cilium: mechanismy a funkce • Ph.D.: Karolinska Institute, Švédsko • Postdoc: University of Basel, Švýcarsko • Vlastní výzkum (PI): LF & PřF MUNI www.cajaneklab.com F01 Primární cilium: mechanismy a funkce ODPOVĚD – organela na povrchu buněk umožňující reagovat na podněty z okolí („ buněčná anténa“) SIGNÁL Primární a pohyblivá cilia Signál Pohyblivá cilia Direction of beating Flow of signaling molecules Primární cilium Exprese cílových genů Flow of liquid, transporting function Aktivace signalizace Slepota Rakovina Poruchy čichu Poruchy primárních cilií: dopad na lidské zdraví • 100+ chorob spojených s poruchami cilií ? ? Naše klíčové otázky • Pro jaké procesy v buňce je primární cilium důležité? • Jaké mechanismy řídí tvorbu a funkci této organely ? ? centrioly cilium • Kde se protein X nachází a co různých situacích „dělá“? Protein X (c) Gaia Pigino MPI- CBG Naše experimentální přístupy - mikroskopie IF (imunofluorescenční) mikroskopie - princip Detekce a vizualizace proteinů pomocí protilátek IF (imunofluorescenční) mikroskopie - princip Detekce a vizualizace proteinů pomocí protilátek Protein X Y Y Y Y Y Y Protein X Y Y Y Y Y Y centrioly/DNA Detekce a vizualizace proteinů pomocí protilátek Protein X Y Y Y Y Y Y Protein X Y Y Y Y Y Y IF (imunofluorescenční) mikroskopie - princip IF mikroskopie - důvěřuj ale prověřuj Validace specificity protilátek (signál vs „šum“) Protein X Y Y Y Y Y Y Protein X Y Y Y Y Y Y ? kontrola Buňky bez genu X Protein X/Ac. tubulin Protein X/Ac. tubulin Pejšková et al., JCB Expanzní mikroskopie – za málo peněž hodně muziky centrioly/DNA € € Expanzní mikroskopie – za málo peněž hodně muziky Edward Boyden, MIT, USA - “prostě zvětším preparát“ - extrémně vysoké rozlišení i na „běžných“ mikroskopech Expanze (4.2x) Spec. Polymer Expanzní mikroskopie – příklady centrioly cilium Pejšková et al., nepublikováno Mikroskopické přístupy • Kde se protein X nachází a co různých situacích „dělá“? Protein X Fixní preparáty VS Live cell imaging „Live cell imaging“ mikroskopie + práce s živými buňkami – pozorování změn a jejich dynamiky v různých podmínkách (např. růst cilia v čase) Kontrolní buňky – cilium „roste“ Buňky bez genu X – cilium „moc neroste“ Pejšková et al., JCBBinó et al., nepublikováno „Live cell imaging“ mikroskopie - práce s živými buňkami – problém vizualizace → fúze proteinu zájmu s fluorescenčním proteinem Aequorea victoria, tvorba fluorescenčních proteinů (např. GFP – „green fluorescence protein“) GFP Protein X „Live cell imaging“ mikroskopie - Jak dostat fluorescenční protein do živých buněk ? Fúzní gen GFP Gen X Transfekce („obalená“ DNA projde membránou) Naše experimentální přístupy Studium významu cilií pomocí embryonálních kmenových buněk Embryonální kmenové buňky Buňky srdce Buňky mozku Imunitní buňky Kmenová buňka Nervová buňka Proč ? Defekty v CNS u některých typů ciliopatií Naše experimentální přístupy Kmenová buňka Nervová buňka ? Cilium/centriola Neurální Rozety – neurální trubice „in vitro“ Kontrola Aktivace signalizace rosette area sum ctr SAG RA 0 10000 20000 30000 40000 rosetteareaSD Binó et al., nepublikováno Experimentální strategie pro regulaci genové exprese (nejen) v kmenových buňkách gen X gen X ? ? CRISPR/Cas9 RNAi > Jakou má daným gen/protein funkci a jak je důležitý ? Editace genů pomocí CRISPR/Cas9 Cas9 Cas9 Cas9 Oprava s chybou – nefunkční gen Cas9 – nukleáza – zlomy v DNA řetěžci gRNA – „guide“/průvodce – cílení na specifickou oblast DNA CRISPR Editace genů pomocí CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 • Typická účinnost editace u kmenových buněk 2-8% (účinnost transfekce, efektivita oprav DNA, toxicita,…) Cas9 Cas9 Re-transfekce 3x-4x ~ 80% buněk s inaktivovaným genem zájmu Editace genů pomocí CRISPR/Cas9 - Kmenové buňky bez cilií gen XTTBK2 gen XTTBK2 CRISPR/Cas9 ? ? TTBK2 cilium centrioly TTBK2 cilium centrioly Binó et al., nepublikováno Regulace genové exprese pomocí siRNA DNA RNA protein ribozom Regulace genové exprese pomocí siRNA DNA RNA protein ribozom siRNA – „small interfering“ RNA RISC – nukleáza – zlomy v RNA Regulace genové exprese pomocí siRNA DNA RNA protein ribozom Cep135 TTBK2Cep164 Cep135 TTBK2Cep164 Control siRNA CEP164 siRNACEP164 Bernatík et al., MBoC Naše experimentální přístupy Studium mechanismu kontroly tvorby primárních cilií Protein X AB C D • Jaké proteiny řídí tvorbu cilií a jak se vzájemně ovlivňují? Proč se zabývat „mechanismy“? Jediný způsob jak opravdu přijít na to jak vlastně daná věc funguje … a následně být schopen „něco udělat“ když to nefunguje. mechanismus ↔ funkce Q11, R93 – mutace u pacientů s ciliopatií Pochopení mechanismu (struktura daného proteinu) a funkce (co v ciliích pacientů nefunguje) nezbytné pro možnou terapeutickou intervenci („small molecule“ která napraví defekt v daném proteinu) Identifikace proteinových komplexů a jejich změn Protein X A B Protein X A B + + Identifikace proteinových komplexů a jejich změn → metoda „ proximity labeling“ – označení proteinů daného komplexu přímo v buňce a jejich následná izolace a identifikace B B X B B XA D Identifikace proteinových komplexů a jejich změn B B X D B B XA → metoda „ proximity labeling“ – označení proteinů daného komplexu přímo v buňce a jejich následná izolace a identifikace Rozdíly? BirA – enzym, který „označí“ všechny proteiny ve svém okolí Více když Více když → pozitivní funkce? → negativní funkce? Identifikace proteinových komplexů a jejich změn Bernatík et al., nepublikováno Testovaní významu/funkce proteinu X siRNA/CRISPR + „rescue“ – specificita efektu a srovnání různých variant proteinu X (zde Tau Tubulin kinase 2, TTBK2) TTBK2KO+FLAG-TTBK2 centrioly FLAG cilium TTBK2KO+FLAG-TTBK2mut1 centrioly FLAG cilium TTBK2KO+FLAG-TTBK2mut2 centrioly FLAG cilium Mut2 – pacientská mutaceKO – knockout – gen X byl inaktivován JAK? Vysloužil et al., nepublikováno Proč bádat právě u nás? • Základní výzkum s možným terapeutickým přesahem • Mezinárodní spolupráce : Harvard Medical School (USA), Imagine Institute (France), Queen Mary University (UK), Brunnel University (UK) • Naše dosavadní výsledky jsou mezinárodně konkurenceschopné lukas.cajanek@gmail.com /cajanek@med.muni.cz Lukáš Čajánek – Primární cilium: mechanismy a funkce www.cajaneklab.com F01