Molekulární biologie rostlin v praxi Úvod: Rychlý protokol na izolaci genomové DNA (gDNA) z rostlin, který slouží pro jejich genotypování. Dají se tak rozlišit různé genové varianty, mutace (např. T-DNA inzerce, CRISPR/Cas9 mutace, delece) i odrůdy plodin. Získaná DNA se použije jako templát v polymerázové řetězové reakci (PCR) a její výsledek se detekuje pomocí horizontální gelové elektroforézy (nebo sekvenováním DNA). Cíl: A. Izolace gDNA z modelové rostliny Arabidopsis thaliana B. PCR metoda C. Analýza pomocí horizontální gelové elektroforézy DNA Materiál: Arabidopsis thaliana Pomůcky a chemikálie: pipety, špičky, eppendorfky, plastové či skleněné tyčinky, centrifuga, vortex, PCR termocykler, mikrovlnná trouba, elektroforéza, UV transmiter, DNA extrakční pufr, izopropanol, 70 % etanol, miliQ voda (sterilní), PCR Master Mix, primery (Forward a Reverse), MidoriGreen (váže se na DNA), vizualizační barvička (Loading Dye), DNA žebříček (DNA ladder), agaróza, pufr TBE A. Izolace genomové DNA 1. Homogenizujte jeden malý až střední list tyčinkou v 1,5 ml zkumavce (eppendorfka). 2. Přidejte 400 ml extrakčního pufru, vortexujte 5 s a nechte stát při laboratorní teplotě (do 60 min). 3. Centrifugujte při maximálních otáčkách 5 min. 4. Přeneste 300 µl supernatantu do nové 1,5 ml zkumavky a přidejte 300 ml izopropanolu, 4-6x překlopte, tím se roztoky promíchají. Nechte stát při laboratorní teplotě (do 10 min). 5. Centrifugujte 10 min při 13000 rmp a 4˚C. Odstraňte supernatant, vysrážená DNA bude v peletu. 6. Promyjte 500 µl 70 % etanolem (vychlazeným při -20 ^oC). Nechte vysušit při laboratorní teplotě. 7. Pelet rozpusťte ve 100-500 ml sterilní miliQ H[2]O. Genomovou DNA uchovávejte na ledu nebo v 4˚C. DNA extrakční pufr (100 ml) 200 mM Tris HCl pH 7.5 1 M zásobní roztok 20 ml 250 mM NaCl 5 M zásobní roztok 5 ml 25 mM EDTA pH 8 0,5 M zásobní roztok 5 ml 0,5 % SDS 10 % zásobní roztok 5 ml Doplňte sterilní vodou do 100 ml. B. PCR metoda 1. Všechny komponenty a reakční směsi uchovávejte a připravujte v krabici s ledem. 2. Do připravených PCR zkumavek (speciální, tenkostěnné zkumavky), napipetujte PCR reakci v následném pořadí: 12,5 ml AmpliTaq Gold 360 Master Mix (2x koncentrovaný) 7 ml miliQ voda (sterilní) 2 ml primer F (10 mM koncentrace) 2 ml primer R (10 mM koncentrace) 1,5 ml gDNA (templát) 25 ml celkový reakční objem 3. Promíchejte pipetou, stočte krátce na stolní centrifuze a vložte do PCR termocykleru s následným teplotním programem: 95^oC / 2 min 95^oC / 10 s Denaturace (Denaturation) 56^oC / 20 s 35x Hybridizace (Annealing) 72^oC / 30 s Elongace (Extension) 72^oC / 5 min 4. Po proběhnutí (cca za 1h 15 min) smíchejte PCR reakci s 5 µl vizualizační barvičky (Loading Dye) a otestujte amplifikovaný DNA produkt nanesením směsi na 1,5 % agarósový gel v TBE pufru. Pro určení velikosti PCR produktu a odhadnutí jeho koncentrace naneste také standard, tedy 6 µl DNA žebříčku (DNA ladder, 100 bp) smíchaného s vizualizační barvičkou. Poznámka: AmpliTaq Gold 360 Master Mix obsahuje nukleotidy (dNTPs), reakční pufr a Taq polymerázu ve potřených koncentrací. Obvykle se také používá negativní kontrola, kdy se místo DNA přidá do reakce stejné množství vody a pozitivní kontrola, kdy se jako templát použije již ověřená gDNA. C. Horizontální gelové elektroforéza DNA 1. Připravte 1,5 % agarózový gel tak, že a. smícháte 1,5 g agarózy se 100 ml 0,5x TBE pufru, b. rozpustíte v mikrovlnné troubě, c. po krátkém vychladnutí přidáte 5-10 ml barvičky MidoriGreen, která bude sloužit k označení DNA, d. a nalijete do elektroforézní „elfo“ vaničky, do které předem vložíte hřeben. e. Po ztuhnutí gelu (za cca 30 min) hřeben opatrně vyndejte. 2. Do horizontální elektroforézy nalijte 0,5x TBE pufr a vložte vaničku s gelem. 3. Napipetujte vzorky DNA smíchané s Loading Dye a DNA ladder do jednotlivých jamek v gelu. 4. Spusťte elektroforézu při 80 – 100 V po dobu 30 – 60 min. Vaničku napojte na přístroj, tak aby vzorky DNA difundovaly ke kladně nabitému pólu (od – k +) !!! 5. Pozorujte proužky DNA v procházejícím UV světle transmiteru a výsledek elektroforézy dokumentujte fotografováním. Délkový a hmotnostní standard: 100 bp DNA ladder (0,5 mg) Vyhodnocení: Napište úspěšnost/neúspěšnost PCR reakce a odhadnutou velikost a koncentraci amplifikované DNA. Do protokolu vložte fotografii výsledného gelu a popište ji.