Úvod do studia vlivu toxických látek na rostliny Praktikum 1 – Vliv léčiv na růst Lemna minor. Praktikum 2 – Využití BY-2 k posouzení fytotoxicity léčiv Anotace: Cílem obou úloh je posouzení vlivu nesteroidního protizánětlivého léčiva (diklofenak (DCF), naproxen (NPX)) při zvyšujícím se stupni zatížení prostředí na růst rostlin jak na úrovni celého organismu (Lemna minor), tak i na úrovni buňky (suspenze Nicotiana tabacum BY-2). L. minor je využívána v oficiálních testech fytotoxicity (OECD, US EPA). Koncentrační řada léčiv simuluje běžné až vyšší zatížení prostředí. Praktikum 1 - Vliv léčiv na růst Lemna minor. Provedení: 1) Příprava Steinbergova kultivačního média (SM) pro L. minor: výpočet potřebného objemu média (2 L), příprava ze zásobních roztoků, úprava pH. 2) Příprava roztoků léčiv: výpočet navážky, příprava zásobního roztoku, ředění v SM médiu na aplikované koncentrace (0, 0,01, 0,1, 1 a 10 mg/L). · Zásobní roztok: navážit 10 mg léčiva, rozpustit v 2 mL acetonu, přidat 5 mL dest. H[2]O, doplnit do 100 mL SM médiem · Konc. 10 mg/L: odpipetovat 10 mL do 100 mL baňky, doplnit SM médiem · Konc. 1 mg/L : z roztoku 10 mg/L odpipetovat 10 mL do 100 mL baňky, doplnit SM médiem · Konc. 0.1 mg/L : z roztoku 1 mg/L odpipetovat 10 mL do 100 mL baňky, doplnit SM médiem · Konc. 0.01 mg/L : z roztoku 0.1 mg/L odpipetovat 10 mL do 100 mL baňky, doplnit SM médiem · Konc. 0 mg/L : kontrola, pouze SM médium 3) Příprava kultivačních destiček: popis, napipetování (10 mL/jamka) příslušných roztoků 4) Umístění rostlin: 6 lístků do každé jamky (1 rostlina = 1 lístek) 5) Kultivace: 7 dní při teplotě 23±2°C, fotoperiodě 14/10, ozářenosti 200 µmol/m^2.s 6) Vyhodnocení: fotodokumentace pro výpočet listové plochy, stanovení počtu rostlin, stanovení čerstvé hmotnosti a sušiny, doplnění hodnot do výsledkové tabulky. 7) Vypracování protokolu: Průměrné hodnoty ze všech sledovaných parametrů budou prezentovány v protokolu v tabulkách a grafech. Bude formulován Závěr. Praktikum 2 – Využití BY-2 k posouzení fytotoxicity léčiv Zvoleným modelovým organismem je tabáková buněčná suspenze BY-2, iniciovaná z kalusu založeného na tabáku Nicotiana tabacum L. cv. „Bright Yellow 2“. Díky svým charakteristickým vlastnostem, jako je např. tvorba dlouhých vícebuněčných řetízků, mimořádně vysoká rychlost růstu, viabilita a vysoká homogenita buněk, se stala velmi populárním modelem pro studium buněčné biologie a biochemie na vyšších rostlinách. Využívá se např. pro studium PCD, studium biosyntetických drah různých látek, produkce sekundárních metabolitů, signalizace v rostlinných buňkách, regulace buněčného cyklu a projevů genové exprese. Základními parametry, kterými lze hodnotit vliv stresového faktoru na buněčnou suspenzi jsou stanovení její viability (životaschopnosti) vyjádřené poměrem živých a mrtvých buněk, a sledování změn hustoty suspenze (celkový počet buněk). Test viability lze využít i při kontrole životaschopnosti buněk během kultivace. Princip je založen na intaktnosti a selektivní propustnosti cytoplazmatické membrány živých buněk. K barvení se používají netoxická barviva. A. Provedení testu viability 1) Příprava roztoků léčiva DCF: výpočet navážky pro koncentráty, ředění na aplikované koncentrace (0, 0,001, 0,01, 0,1 a 1 mg/L). · Zásobní roztok: navážit 5 mg léčiva, rozpustit v 2 mL acetonu, doplnit dest. H[2]O do 100 mL · Konc. 1 mg/L: odpipetovat 10 mL ze zásobního roztoku do zkumavky · Konc. 0.1 mg/L : z roztoku 1 mg/L odpipetovat 1 mL do zkumavky, doplnit doplnit dest. H[2]O do 10 mL · Konc. 0.01 mg/L : z roztoku 0.1 mg/L odpipetovat 1 mL do zkumavky, doplnit doplnit dest. H[2]O do 10 mL · Konc. 0.001 mg/L : z roztoku 0.01 mg/L odpipetovat 1 mL do zkumavky, doplnit doplnit dest. H[2]O do 10 mL · Konc. 0 mg/L : kontrola, pouze 10 mL dest. H[2]O · Všechny výsledné roztoky sterilně zfiltrovat přes stříkačkové filtry !!! 2) Předkultivace suspenze BY-2: příprava baněk s čerstvou suspenzí (22 ml média + 2.5 ml suspenze), kultivace po dobu 4 dnů při 27°C ve tmě. 3) Expozice suspenze: přidání příslušné koncentrace léčiva DCF (0,5 ml), inkubace po dobu 1 hod. 4) Příprava suspenze k pozorování: odběr suspenze (5 ml), naředění suspenze (5-10x) kultivačním médiem. 5) Barvení suspenze: odebrat 50 μL suspenze do mikrozkumavky, přidá se 10 μL roztoku propidium jodidu (PI), 3 μL roztoku fluorescein diacetátu (FDA), promíchá se a 3 minuty se inkubuje. 6) Pozorování: Pasteurovou pipetou se odebere kapka suspenze na podložní sklo počítací komůrky. Po přikrytí krycím sklem se ve fluorescenčním mikroskopu pozoruje poměr živých (zelených) a mrtvých (červených) buněk v zorném poli (filtr FITC). Vyfotí se zorná pole a následně se na fotografiích zjišťují počty živých (zelených) a mrtvých (červených) buněk v mřížce. Počítá se pouze každá druhá mřížka (počítací rámec!!). 7) Vyhodnocení: z dat se vypočítá poměr živých a mrtvých buněk. Získané výsledky prezentujte formou grafu. B. Stanovení hustoty suspenze 1) Příprava roztoků léčiva DCF: výpočet koncentrace pro koncentráty, ředění na aplikované koncentrace (0, 0,001, 0,01, 0,1 a 1 mg/L), viz výše. 2) Založení experimentu: napipetování 22 ml média + 2.5 ml suspenze + 0.5 ml příslušného koncentrátu léčiva. 3) Kultivace suspenze: 4 dny na třepačce při 27°C ve tmě. 4) Příprava suspenze k pozorování: odběr suspenze (5 ml), naředění médiem (2 až 10x). 5) Pozorování: Pasteurovou pipetou se odebere kapka suspenze na podložní sklo počítací komůrky, přikryje krycím sklem a pozoruje pod světelným mikroskopem. Vyfotí se zorná pole a následně se na fotografiích zjišťují počty buněk. Počítá se pouze každá druhá mřížka (počítací rámec!!). 6) Vyhodnocení: přepočet počtu buněk s ohledem na ředění na počet buněk v 1 ml suspenze, výsledky prezentovat formou grafu. Závěr: Ze získaných výsledků porovnejte odezvu rostlinných organismů na úrovni celých rostlin a buněk.