Jméno:
Datum:


Téma 02:              Sterilní výsev a nakličování semen


Výsev povrchově desinfikovaných semen je relativně nejjednodušším způsobem, jak založit kulturu in
vitro, protože na semena je možné použít razantnější desinfekční postupy než na rostlinné orgány,
jako jsou listy nebo květní poupata.

Malá semena vyséváme (pomocí navlhčených špejlí nebo párátek) na povrch agarem nebo Gelritem
ztuženého média, které má většinou sníženou koncentraci anorganických solí i sacharosy. Velká
semena, jako hrách, okurky apod., je možné vysévat na povrch navlhčené buničité vaty nebo na povrch
skleněných perel s tekutým médiem.


Materiál: (vypsat podle vlastních experimentů)

semena různých linií tabáku Nicotiana tabacum L. SR1, len setý Linum usitatissimum L., spory
kapradin – např. křídelnice krétská (Pteris cretica), rumora (Rumohra adiantiformis), ledviník
(Nephrolepis exaltata), semena orchidejí (Phalaenopis hybr.) apod.

Pomůcky: (vypsat)


A.    Desinfekce větších semen

1.    Uzavření semen do skleněné epruvety nebo gázového váčku (podle velikosti semen)

2.    Desinfekce v 50% etanolu a 3% peroxidu vodíku                               1 minuta

3.    Oplach sterilní destilovanou vodou (SDV)

4.    Desinfekce ve 20% roztoku SAVO v SDV (v/v)                                 20 minut

5.    3x po dobu 3 - 5 minut oplachování SDV, poslední vodu slít a nechat uzavřeno v boxu

6.    Bobtnání 24 hodin

7.    Opakovaná desinfekce ve 20% roztoku SAVO v SDV (v/v)               20 minut

8.    3x po dobu 3 - 5 minut oplach SDV

9.    Desinfikovaná semena přeneseme v laminárním boxu do sterilní Petriho misky s filtračním
papírem.

Sterilní výsev

10. Provedeme sterilně výsev semen pomocí pinzety nebo sterilního párátka do Petriho misek na
povrch agarem ztuženého média (MS médium, 2% sacharosa, 0,65% agar). Víko misky zajistíme proti
otevření proužkem fólie.

11. Označíme kultury popisem (datum, materiál), poznamenáme si počet semen vysetých na misku.

12. Nakličování provádíme ve tmě v termostatu, při teplotě 25°C nebo na světle v kultivačním
regálu.


B. Desinfekce malých semen nebo spor kapradin

1.    Suspendování semen nebo spor ve sterilní destilované vodě a jejich krátké nabobtnání (ve
Falkon. zkumavce)

2.    Centrifugace na ruční centrifuze                                              1 minuta

3.    Dekantace vody

4.    Desinfekce v 7% chlornanu vápenatém (Phalaenopsis)          10 minut

5.    Centrifugace na ruční centrifuze                                              1 minuta

6.    Dekantace desinfekčního roztoku

7.    Oplachování sterilní destilovanou vodou (SDV) 3 – 4x, mezi každou výměnou vody centrifugujeme
suspenzi a sléváme supernatant

8.    Poslední oplachovací vody přidáváme menší množství a po resuspendování sedimentu naléváme
malé množství suspenze na povrch agarového média.


Hodnocení:

První kontrola kultur by měla probíhat již po několika dnech. Zpravidla již 3. den od počátku
experimentu je patrná přítomnost nežádoucích infekcí (týdenní interval mezi praktiky může být
příliš dlouhý). Pokud je výskyt infekcí limitovaný a kulturu kontrolujeme včas, je možné pasážovat
neinfikovaná semena na čerstvé médium.

V případě, že je desinfekce nedostatečná a infekce se projevuje u mnoha semen, je nutné provést
razantnější desinfekci (opakováním desinfekce, prodloužením doby působení desinfekční látky nebo
použitím jiné desinfikující látky)

V následujících týdnech vyhodnotíme % klíčivosti osiva, kontrolujeme čistotu kultur a sledujeme
vývoj klíčních rostlin nebo případné projevy sensitivity pokud jsme vysévali semena na selekční
médium.

Podle dalších pokynů pracujeme s klíčními rostlinkami v dalších úlohách.