Analýza genomických a proteomických dat
Proteomické analýzy
Jaro 2022
19. duben 2022
Eva Budinská (budinska@recetox.muni.cz)
Analýza proteomu
Zdroj: https://www.creative-proteomics.com/services/proteomics-service.htm
Analýza proteomu
3. Analýza funkce: Modelovaní
makromolekulárních systémů –
odvozování vlastností z
atomových interakcí
1. Analýza struktury:
Proteínová sekvenace –
Edmanova degradace,
hmotnostní
spektrometrie
2. Analýza abundance:
Hmotnostní
spektrometrie,
proteínové mikročipy, 2D
gelová elektroforéza..
Dělení proteomických experimentů
Dle toho co zkoumají: kvalita (struktura, funkce) nebo kvantita (abundance)
Dle komplexity vzorku: jeden, několik, tisíce?
Dle úrovně frakcionace: zkoumáme peptidy nebo proteiny?
Dle značení: label-free, SILAC, iTRAQ, ...
Dle rozlišení: nízké vs vysoké
2D gelová elektroforéza
Princip
Proteiny jsou separované na gelu ve dvou dimenzích – na základě hmotnosti a na
základě pH
pH
molekuoární
hmotnost
Postup experimentu
1. Proteiny jsou extrahovanéze vzorku
2. Vzorky se umístí na gel a proteiny migrují až dosáhnou izoelektronický bod (kdy je jejich náboj
nula) - pH(I)
* Důležitý je výběr gelu, který musí být dostatečně pórovitý, aby umožnil proteinům pohyb (agaróza
nebo polyakrylamidový gel)
3. Takto se proteiny oddělí vzhledem ke svému izoelektrickému bodu
4. Následně proteiny necháme se pohybovat na základě hmotnosti ve druhé dimenzi
5. Nakonec je gel zabarvený, aby se detekovaly jednotlivé oblasti výskytu proteinů (spoty)
6. Zabarvený gel je pak digitalizován do obrazu (podobně jako mikročipy)
7. Intenzita pixelů koreluje s množstvím proteinu, používá se speciální SW pro analýzu spotů
Jak vypadá obrázek
2-D gelová elektroforéza
Jak vypadají data
SSP wt_A wt_A wt_A wt_S
101 2338.84 2078.42 2625.1 2550.54
102 118.92 68.65 125.8 109.66
103 221.89 55.32 NA NA
104 215.3 189.02 220.28 NA
105 106.56 NA 238.36 NA
202 328.32 226.46 522.52 1281.75
203 259.8 228.13 340.37 NA
205 1439.72 1213.28 1187.43 1353.14
206 1094.33 754.83 1291.89 1240.82
208 97.78 41.51 164.49 33.25
209 NA NA NA 22.42
301 212.63 92.12 307.19 317.67
302 1491.34 1703.79 1830.19 1976.66
304 71.25 72.72 127.87 199.31
Vzorky
Peptidy
DIGE
* Speciální typ 2-DE je 2-D FluorescenceDifference Gel Electrophoresis (DIGE).
• Proteiny se nejprve zabarví
fluorescenčním barvivem
• Každé barvivo se skenuje pod
jiným filtrem
• Takto se může porovnávat více
vzorků
Nutnost úpravy dat
* Tak jako mikročipový experiment i 2-DE je vystavená experimentálním chybám, které jsou zdrojem
šumu
* Je nutná úprava a normalizace dat
* Neexistuje tu ale taková automatická kvantifikace spotů tak jako u mikročipů, protože spoty nejsou
fixně dané předem!
* existující automatická kvantifikace vyžaduje manuální úpravu
* proměnné kvality spotů
* Data z 2DE nejsou normálně rozložené – je nutná transformace (log)
Normalizace a úpravy dat
* Důležitým krokem v úpravě dat je kalibrace všech expresních hodnot a gelů navzájem
* V tomto procesu se odstraňuje prostorový efekt, i efekt barviva
* Na každém gelu jsou kontrolní proteiny, podle kterýchse každý gel kalibruje (posouvá)
Kontrola kvality spotů
Hmotnostní spektrometrie
Hmotnostní spektrometrie
Technika používaná pro charakterizaci (nejen) proteomu v biologickém vzorku (plasma, sérum, . . .)
různé konzistence (pevná konzistence, tekutina, plyn)
Založená na rozdílném náboji a hmotnosti peptidů a proteinů (nebo jiných molekul)
Hmotnostní spektrometr je separuje na základě poměru hmotnosti k náboji (anglicky mass to charge ratio –
m/z, jednotka Dalton), který je specifický pro každou molekulu.
Často používané systémy - TOF nebo Orbitrap
Hmotnostní spektrometrie
1. Ionizace molekul
pomocílaseru
3. Pohyb iontů nulovým elektrickým
polem dolů po délce MS přístroje k
detektoru, který měříTOF
Technika používaná pro charakterizaci (nejen) proteomu v biologickém vzorku (plasma, sérum, . . .) různé
konzistence (pevná konzistence, tekutina, plyn)
Založená na rozdílném náboji a hmotnosti peptidů a proteinů (nebo jiných molekul)
Hmotnostní spektrometr je separuje na základě poměru hmotnosti k náboji (anglicky mass to charge ratio –
m/z, jednotka Dalton), který je specifický pro každou molekulu.
Často používané systémy - TOF nebo Orbitrap
2. Urychlení
iontů pomocí
akceleračního
potenciálu
m/z
Intensita
Hmotnostní spektrometr TOF - princip
▪ TOF (time-of-flight) závisí na hmotnosti proteinů nebo přesněji na jejich m/z a představuje
sumu těchto časů:
je čas letu v akcelerační oblasti,
je čas přeletu v oblasti s nulovým elektrickým polem
je čas detekce
▪ TOF lze aproximovat pouze pomocí
mass-to-charge ratio je vypočteno podle:
▪ A a B jsou stanoveny pomocí kalibrace
dDa t+t+t=TOF
,
at
Dt
dt
2^)(/ AtB=zm D −
Dt
Hmotnostní spektrometr TOF - druhy
▪ Příklady TOF spektrometrů:
▪ Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionisation(MALDI)-TOF
▪ Surface-Enhanced Laser Desorption-Ionisation (SELDI)-TOF
▪ Způsob uchycení proteinů a ionizace
▪ Proteiny vzorku jsou před samotnou analýzou upevněny na podklad, který se v závislosti od typu
hmotnostní spektrometrie liší.
▪ Jeho úkolem je také absorbovat energii v ionizátoru a předat ji vzorku a tak usnadnit jeho
ionizaci.
▪ u MALDI se jedná o energii-absorbující matrici (matrix), co je nejčastěji organická kyselina s
aromatickým jádrem
▪ SELDI využívá proteinový čip (s několika - obvykle osmi - spoty), opatřen speciálním
chromatografickým povrchem, takže se na povrch váží různé proteiny v závislosti na svých
chemických vlastnostech a vlastnostechčipu. A až potom dojde k nanesení matrice, která se
vzorkem vytvoří krystaly.
,
MALDI-TOF
▪ Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionisation- TOF
SELDI-TOF
▪ Surface-Enhanced Laser Desorption-Ionisation – TOF
▪ Existuje několik druhů čipů (IMAC30, H50, NP20...), které se liší svým
aktivním povrchem (anionický, kationický, kovový, normální fáze,
hydrofobický, …) a proto také přednostně vážou jiné molekuly.
Výhoda SELDI:
Možnost odmýt látky,
které by jinak
ovlivňovali spektrum
vzorku
(např. močovina
používaná k přípravě
vzorku, nebo Na+ ionty
přítomné fyziologicky
ve vzorcích).
Kapalinová chromatografie – LC-MS/MS
▪ Další druh hmotnostní spektrometrie pro identifikaci proteinů
▪ Vzorky nejsou na matrici jako u MALDI nebo SELDI, ale v kapalině
▪ MS/MS - tandemová hmotnostní spektrometrie
Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS)
Jde o použití dvou spektrometrií jednu po druhé.
1. Molekuly vzorku jsou ionizovány a první spektrometr (označený MS1)
odděluje tyto ionty podle jejich poměru hmotnosti k náboji (m/z).
2. Ionty s konkrétním poměrem m/z pocházející z MS1 jsou vybrány a
poté se rozštěpí (fragmentují) na menší ionty (kolizí indukovanou
disociací, reakcí iontů a molekul nebo fotodisociací).
3. Tyto fragmenty dále putují do druhého hmotnostního spektrometru
(MS2), který dále odděluje fragmenty podle jejich poměru m/z a detekuje
je.
Fragmentační krok umožňuje identifikovat a separovat ionty, které mají
velmi podobné m/z-poměry v běžných hmotnostních spektrometrech.
Používá se v proteínovém sekvencování.
Výsledkem je peptide sequence tag
0
20406080
100
intensity
0 10000 20000 30000 40000 50000
mz
Jak vypadají data vzorku z hmotnostního spektrometru
0
204060
Intensity
0 5000 10000 15000 20000
Mass to charge ratio (m/z)
0
204060
Intensity
0 5000 10000 15000 20000
Mass to charge ratio (m/z)
Dvě spektra z
jednoho vzorku
0
20406
Intensity
0 5000 10000 15000 20000
Mass to charge ratio (m/z)
0
204060
Intensity
0 5000 10000 15000 20000
Mass to charge ratio (m/z)
Spektra z různých vzorků
Zpracování dat
1. úprava hrubých dat (MS/MS i MS), normalizace, identifikace píků
Vznik a úprava dat
▪ Kalibrace
▪ Signál je přeměněný na škálu m/z pomocí množství kalibračních proteinů ze známou
m/z hodnotou. Toto se děje ještě v přístroji
Základní data (formáty raw, mzXML, mzML, ...)
▪ Odstranění baseline
▪ Odstranění baseline šumu z profilu, například pomocí loess
▪ Normalizace
▪ Abychom mohli porovnat spektra mezi vzorky
0
20406080
100
intensity
0 10000 20000 30000 40000 50000
mz
0
20406080
100
0 10000 20000 30000 40000 50000
mz
intensity baseline
Baseline subtraction
0
20406080
100
0 10000 20000 30000 40000 50000
mz
Upravená data
Normalizace
▪ Odstraňujeme technickou variabilitu (přístrojové chyby, odlišné množství
vzorku)
▪ Koncentrace proteinu se odhaduje jako plocha pod píkem (Area Under Curve
– AUC)
▪ Normalizace pomocí průměrné AUC (TIC – total ion current)
AUC celého spektra / průměrná AUC všech spekter
Detekce píků a jejich zarovnání
▪ Pík ~ peptid/proteín, definuje se
jako lokální maximum na základě
porovnání variability v okolí
▪ Existují nepřesnosti na x (m/z) a y
(signál) osách
▪ Píky každého spektra můžou být
definované jako body které jsou
maximálně +/- N bodů v okolí m/z
▪ first, second, estimated..
▪ Důležité je brát do úvahy signal-tonoise
ratio – píky musí překročit
nějakou běžnou hranici šumu
Jak vypadají data po zarovnání a detekci píků
▪ SELDI-TOF
Clus
ter Group
Norm. Log
Intensity M/Z Intensity
Norm. Linear
Intensity Type
Mass
Dev.
1 chemoresistentni 0.581550 2392.84 3.058176 30.578211 estimated 0.000007
1 chemoresistentni -0.072123 2392.84 1.943959 12.984676 estimated 0.000007
1 chemoresistentni 0.023116 2392.84 2.076621 15.079403 estimated 0.000007
1 chemoresistentni 0.160910 2392.84 2.284742 18.365652 estimated 0.000007
1 chemoresistentni 0.199591 2392.84 2.346828 19.345988 estimated 0.000007
1 chemoresistentni 0.161331 2392.82 2.285410 18.376190 first -0.000004
Úprava hrubých dat - dvě možnosti
Profilové spektrum
▪ Získané z experimentu
Čárové spektrum
▪ Vypočítané z profilového
612.5 613.0 613.5 614.0 614.5 615.0 615.5 616.0 616.5
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
RelativeAbundance
614.34
615.34
612.5 613.0 613.5 614.0 614.5 615.0 615.5 616.0 616.5
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
614.37
615.32
RelativeAbundance
Čipy pro SELDI hmotnostní spektrometrii
▪ Kvantitativní hodnoty proteomu jsou také ovlivněné různými zdroji
variability (experimentální i biologické)
▪ Velmi velké rozdíly mezi typy použitého čipu!
H50 IMAC30 NP20acid NP20alkaline
N % N % N % N %
H50 75 100.0 19 47.5 24 52.2 56 59.6
IMAC30 19 25.3 40 100.0 19 41.3 21 22.3
NP20acid 24 32.0 19 47.5 46 100.0 30 31.9
NP20alkaline 56 74.7 21 52.5 30 65.2 94 100.0
separate M/Z 15 20.0% 15 37.5% 12 30.0% 28 29.8%
2500 5000 7500 10000
2500 5000 7500 10000
0
25
50
75
100
2500 5000 7500 10000
0
25
50
75
100
2500 5000 7500 10000
0
25
50
75
100
2500 5000 7500 10000
0
25
50
75
100
2500 5000 7500 10000
2500 5000 7500 10000
2500 5000 7500 10000
0
25
50
75
100
2500 5000 7500 10000
0
25
50
75
100
2500 5000 7500 10000
0
25
50
75
100
2500 5000 7500 10000
0
25
50
75
100
2500 5000 7500 10000
2500 5000 7500 10000
2500 5000 7500 10000
0
25
50
75
100
2500 5000 7500 10000
0
25
50
75
100
2500 5000 7500 10000
0
25
50
75
100
2500 5000 7500 10000
0
25
50
75
100
2500 5000 7500 10000
Citrat
e
EDTA
Heparin
Serum
CM10 IMAC-Cu
-
H50
m/z m/z m/z
Intensit
y
Peaky profilů 3 odlišných SELDI čipů
Vzorky zpracované 4 různými způsoby
Banks et al, Clinical Chemistry 2005
Příklad
▪ Shlukování profilů stejných vzorků ze 4 typů SELDI sklíček:
IMAC30, H50, NP20zas, NP20kys
Aplikace I – identifikace bakterií
5176
6105
6797 779773954790 102688305 949942652795 3405 8972
4976
116763897
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
5x10
Intens.[a.u.]
2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000
m/z
Acinetobacter johnsonii
53814364
6255
5096
9553
2833 71584776
6507
8368 89937869
4183
10299
0
2
4x10
Intens.[a.u.] 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000
m/z
Escherichia coli
4435
6048
5211 6678
7236
7923 8357 9091 97002213 3020 3613
0
500
1000
Intens.[a.u.]
2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000
m/z
Pseudomonas aeruginosa
Kingella kingae
50502524
44263154 3592
2212 4120 59684704
71842746 5320
0
2000
4000
Intens.[a.u.]
2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000
Aplikace I – identifikace bakterií
5176
9931
6105
6832
83204265 947773814966 89722585 34143051 4486 5932
3879 11082
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
5x10
Intens.[a.u.] 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000
m/z
Acinetobacter bouvetii
5175
6105
74486930 92942585 833542653723 47843051 89866642 7186 99745626
0
1
2
3
4
4x10
Intens.[a.u.]
2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000
m/z
Acinetobacter haemolyticus
5176
6105
739668024265
922377972585 47553399 66113050 1001683203897 59335393
0
1
2
4x10
Intens.[a.u.]
2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000
m/z
Acinetobacter johnsonii NIPH 2122
5176
6105
6814
739642652585 95115729 779747553405 8320 102693050 6611 89733897
0
2
4
4x10
Intens.[a.u.]
2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000
m/z
Acinetobacter johnsonii NIPH 2124
41 01002003004005006007008009001000
Duskova KAS 151
Duskova KAS 152
Duskova KAS 153
Duskova KAS 115
Duskova KAS 110
Duskova KAS 113
Duskova KAS 137
Duskova KAS 175
Duskova KAS 155
Duskova KAS 106
Duskova KAS 102
Duskova KAS 140
Duskova KAS 105
Duskova KAS 139
Duskova KAS 112
Duskova KAS 111
Duskova KAS 114
Duskova KAS 180
Duskova KAS 187
Duskova KAS 184
Duskova KAS 190
Duskova KAS 191
Duskova KAS 192
Duskova KAS 185
Duskova KAS 186
Duskova KAS 169
Duskova KAS 188
Duskova KAS 168
Duskova KAS 170
Duskova KAS 171
Duskova KAS 121
Duskova KAS 104
Duskova KAS 183
Duskova KAS 193
Duskova KAS 223
Duskova KAS 224
Duskova KAS 88
Duskova KAS 119
Duskova KAS 125
Duskova KAS 149
Duskova KAS 89
Duskova KAS 94
Duskova KAS 91
Duskova KAS 120
Duskova KAS 148
Duskova KAS 126
Duskova KAS 99
Duskova KAS 117
Duskova KAS 118
Duskova KAS 92
Duskova KAS 236
Duskova KAS 238
Duskova KAS 242
Duskova KAS 243
Duskova KAS 237
Duskova KAS 229
Duskova KAS 231
Duskova KAS 230
Duskova KAS 239
Duskova KAS 258
Duskova KAS 209
Duskova KAS 210
Duskova KAS 226
Duskova KAS 206
Duskova KAS 205
Duskova KAS 215
Duskova KAS 124
Duskova VI
Duskova XIII
Duskova VII
Duskova XIV
Duskova KAS 240
Duskova KAS 241
Duskova KAS 244
Duskova KAS 259
Duskova KAS 212
Duskova KAS 207
Duskova KAS 208
Duskova KAS 211
Duskova KAS 213
Duskova KAS 227
Duskova KAS 228
Duskova KAS 216
Duskova KAS 167
Duskova KAS 136
Duskova KAS 165
Duskova KAS 133
Duskova KAS 247
Duskova KAS 268
Duskova KAS 225
Duskova V
Duskova KAS 252
Duskova KAS 256
Duskova KAS 232
Duskova IV
Duskova XV
Duskova KAS 267
Duskova XI
Duskova XVII
Duskova XVI
Duskova KAS 264
Duskova KAS 266
Duskova KAS 265
Duskova KAS 253
Duskova KAS 255
Duskova I
Duskova II
Duskova III
Duskova KAS 248
Duskova KAS 158
Duskova KAS 203
Duskova XX
Duskova XII
Duskova KAS 202
Duskova KAS 142
Duskova XXI
Duskova KAS 245
Duskova KAS 263
Duskova KAS 257
Duskova KAS 246
Duskova KAS 234
Duskova KAS 249
Duskova KAS 260
Duskova KAS 270
Duskova KAS 254
Duskova KAS 262
Duskova KAS 261
Duskova KAS 199
Duskova KAS 196
Duskova KAS 200
Duskova KAS 194
Duskova KAS 195
Duskova KAS 201
Duskova KAS 189
Duskova KAS 197
Duskova KAS 198
Duskova KAS 204
Duskova KAS 178
Duskova KAS 172
Duskova KAS 132
Duskova KAS 129
Duskova KAS 181
Duskova KAS 173
Duskova KAS 134
Duskova KAS 128
Duskova KAS 182
Duskova KAS 162
Duskova KAS 163
Duskova KAS 130
Duskova KAS 135
Duskova KAS 84
Duskova KAS 83
Duskova KAS 85
Duskova IX
Duskova XVIII
Duskova X
Duskova VIII
Duskova XIX
Duskova KAS 251
Duskova KAS 164
Duskova KAS 141
Duskova KAS 86
Duskova KAS 96
Duskova KAS 101
Duskova KAS 95
Duskova KAS 97
Duskova KAS 176
Duskova KAS 160
Duskova KAS 179
Duskova KAS 122
Duskova KAS 123
Duskova KAS 147
Duskova KAS 90
Duskova KAS 144
Duskova KAS 145
Duskova KAS 127
Duskova KAS 116
Duskova KAS 138
Duskova KAS 100
Duskova KAS 98
Duskova KAS 93
Duskova KAS 108
Duskova KAS 107
Duskova KAS 217
Duskova KAS 221
Duskova KAS 177
Duskova KAS 222
Duskova KAS 174
Duskova KAS 154
Duskova KAS 166
Duskova KAS 156
Duskova KAS 143
Duskova KAS 146
Duskova KAS 218
Duskova KAS 219
Duskova KAS 220
Duskova KAS 150
Duskova KAS 109
Duskova KAS 161
Duskova KAS 131
Duskova KAS 103
Duskova KAS 87
Distance Level
Lactococcus
lactis
Lactococcus
garvieae
Lactobacillus
brevis
Lactobacillus
sakeiLactobacillus
curvatusEnterococcus
faecalis
Enterococcus
thailandicusEnterococcus
faeciumEnterococcus
spp.
Enterococcus
hermanniensis
Enterococcus
devriesei
Lactobacillus
plantarum
Lactobacillus
plantarum/paraplantarum
Pseudomonas
spp.Weissella
viridescens
Corynebacterium
variabile
Corynebacterium
spp.
Streptococcus
parauberisStreptococcus
salivariusStreptococcus
spp.Vagococcus
fluvialis
Leuconostoc
citreum
Bacillus
spp.Bacillus
subtilis
Staphylococcus
carnosusStaphylococcus
spp.
Staphylococcus
hominisBacillus
cereus
Staphylococcus
epidermidisStaphylococcus
spp.Staphylococcus
aureus
Pediococcus
pentosaceus
Pediococcus
spp.
Pediococcus
acidilactici
Aplikace II
**
*
*
*
**
*
*
**
*
**
***
***
*
MALDI-TOF MS fingerprint containing proteins
2564
3281
2812
3623
5589
6225
7239
10014
9690
10305
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
4x10
Intens.[a.u.]
2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000
9851
10144
MALDI-TOF MS fingerprint containing maltooligosaccharides
1517
1355
1030
2167
2329
1193
2004
1680
2490
1842
867
2652
2976
2814
3138
705
3300
3462
3624
3785
2425
2586
2263
3947
4109
1614
2749
1776
4270
1451
3233
3073
4432
1939
4594
4755
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
4x10
Intens.[a.u.]
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000
m/ z
Šedo et al., 2012
Aplikace II
1002003004005006007008009001000
Brewery 1 bottle 3
Brewery 1 bottle 4
Brewery 1 bottle 5
Brewery 1 bottle 1
Brewery 1 bottle 2
Brewery 2 bottle 3
Brewery 2 bottle 4
Brewery 2 bottle 5
Brewery 2 bottle 1
Brewery 2 bottle 2
Brewery 3 bottle 1
Brewery 3 bottle 2
Brewery 3 bottle 3
Brewery 3 bottle 4
Brewery 3 bottle 5
Distance Level
Aplikace II
01002003004005006007008009001000
Pilsner Urquell bottle 3 analysis I
Pilsner Urquell bottle 3 analysis II
Pilsner Urquell bottle 1 analysis I
Pilsner Urquell bottle 1 analysis II
Pilsner Urquell bottle 2 analysis I
Pilsner Urquell bottle 2 analysis II
Branik bottle 1 analysis I
Branik bottle 1 analysis II
Branik bottle 3 analysis I
Branik bottle 3 analysis II
Starobrno bottle 1 analysis II
Starobrno bottle 2 analysis I
Starobrno bottle 3 analysis I
Starobrno bottle 3 analysis II
Starobrno bottle 2 analysis II
Budweiser Budvar bottle 1 analysis I
Budweiser Budvar bottle 1 analysis II
Budweiser Budvar bottle 2 analysis I
Budweiser Budvar bottle 3 analysis I
Primator bottle 1 analysis I
Primator bottle 1 analysis II
Cerna Hora bottle 2 analysis I
Rychtar bottle 2 analysis II
Rychtar bottle 3 analysis I
Rychtar bottle 1 analysis I
Rychtar bottle 2 analysis I
Rychtar bottle 3 analysis II
Rychtar bottle 1 analysis II
Budweiser Budvar bottle 2 analysis II
Budweiser Budvar bottle 3 analysis II
Cerna Hora bottle 1 analysis I
Cerna Hora bottle 1 analysis II
Cerna Hora bottle 3 analysis I
Cerna Hora bottle 3 analysis II
Cerna hora bottle 2 analysis II
Primator bottle 2 analysis I
Primator bottle 2 analysis II
Primator bottle 3 analysis I
Primator bottle 3 analysis II
Krusovice bottle 3 analysis I
Staropramen bottle 3 analysis I
Branik bottle 2 analysis I
Branik bottle 2 analysis II
Staropramen bottle 2 analysis II
Staropramen bottle 2 analysis I
Gambrinus bottle 1 analysis I
Gambrinus bottle 1 analysis II
Gambrinus bottle 3 analysis I
Gambrinus bottle 3 analysis II
Gambrinus bottle 2 analysis I
Gambrinus bottle 2 analysis II
Krusovice bottle 1 analysis II
Krusovice bottle 2 analysis I
Krusovice bottle 3 analysis II
Starobrno bottle 1 analysis I
Krusovice bottle 2 analysis II
Zlaty Bazant bottle 3 analysis I
Zlaty Bazant bottle 3 analysis II
Zlaty Bazant bottle 2 analysis I
Zlaty Bazant bottle 2 analysis II
Staropramen bottle 1 analysis I
Staropramen bottle 3 analysis II
Staropramen bottle 1 analysis II
Velkopopovicky Kozel bottle 1 analysis I
Velkopopovicky Kozel bottle 2 analysis I
Velkopopovicky Kozel bottle 1 analysis II
Velkopopovicky Kozel bottle 3 analysis I
Velkopopovicky Kozel bottle 3 analysis II
Velkopopovicky Kozel bottle 2 analysis II
Krusovice bottle 1 analysis I
Heineken bottle 1 analysis I
Zlaty Bazant bottle 1 analysis I
Heineken bottle 2 analysis I
Zlaty Bazant bottle 1 analysis
II
Heineken bottle 1 analysis II
Heineken bottle 3 analysis I
Heineken bottle 2 analysis II
Heineken bottle 3 analysis II
Bernard bottle 1 analysis I
Bernard bottle 1 analysis II
Bernard bottle 2 analysis I
Bernard bottle 2 analysis II
Bernard bottle 3 analysis II
Bernard bottle 3 analysis I
Carlsberg bottle 1 analysis I
Carlsberg bottle 1 analysis II
Carlsberg bottle 2 analysis II
Carlsberg bottle 2 analysis I
Carlsberg bottle 3 analysis I
Carlsberg bottle 3 analysis II
Stella Artois bottle 1 analysis
I
Stella Artois bottle 1 analysis II
Stella Artois bottle 2 analysis II
Stella Artois bottle 2 analysis
I
Stella Artois bottle 3 analysis
I
Stella Artois bottle 3 analysis II
Corona bottle 1 analysis
I
Corona bottle 1 analysis II
Corona bottle 3 analysis
I
Corona bottle 2 analysis
I
Corona bottle 2 analysis II
Corona bottle 3 analysis II
ALE MY CHCEME JEŠTĚ URČIT
PROTEINY...
Zpracování dat
1. Úprava hrubých dat (MS/MS i MS), normalizace, identifikace píků
2. Identifikace proteinů s pomocí databáze
Identifikace proteinů
Princip: Porovnáváme získaná spektra s cílovou databází pomocí
databázových vyhledávačů (Sequest a Mascot), výsledkem je seznam shod spekter
vzorku se spektrami proteinů v db (peptide sequence matches - PSMs) =>
identifikace
Problém: Posoudit přesnost těchto identifikací však není triviální.
Řešení: Statistické přístupy a machine learning
Tři základní kroky identifikace proteinů
1. Příprava dat
▪ Výběr „reprezentativních“ signálů MS/MS
▪ Odstranění „méně kvalitních“ spekter MS/MS
▪ Top N (z okna), dekonvoluce signálu a šumu
▪ Získáme tabulku m/z hodnot a intenzit
2. Příprava databáze
▪ in silico štěpení sekvencí z databáze
▪ Přiřazení jednoho a nebo více peptidů k jednomu spektru (s pomocí statistiky
a machine-learning přístupů)
3. Výběr peptidových identifikací (kam patří, přiřazení k proteinu)
1
2
3
1. prohledání dat MS/MS
2. výpočet „vlastností“ peptidů
3. propočítání skóre peptidů
Propočítání skóre peptidů
• Použití support vector machines (SVM)
• sady identifikací
• falešně pozitivní – decoy databáze
• pozitivní – původní databáze
(skóre)
• přiřazení vah vlastnostem v SVM
• např. skóre; chyba hmotnosti
intenzita, modifikace, ...
• víc identifikovaných peptidů
Percolator (http://percolator.ms)
Rekonstrukce sady proteinů
Analogie puzzle, ALE:
• Tisíce kousků:
• Stejné
• Poškozené
• Chybějící
• Z jiných skládaček
• Pasují na stejná místa
Korf, Nat Methods, 2013
Metody rekonstrukce sady proteinů
* Cíl: zjistit, které peptidy patří kterým proteinům s větší pravděpodobností
* Dva základní přístupy:
1. N – peptidové pravidlo
*Proteiny, u kterých pozorujeme alespoň N peptidů
*Vysoká falešná pozitivita
*Používané na sekvenční homologické proteiny
2. Pravděpodobnostní přístupy
*ProteinProphet, Nested mixtures, Fido
Princip parsimonie a Occamové břitvy
A. Vytvoření biparitního grafu:
peptidy- možné proteiny
B. Sloučení proteinů a peptidů do
skupin (např. pep 3,7,9;pro
4,9)
C. Rozdělení skupin
D. Výběr minimální sady proteinů
Zhang, B. et al. J. Proteome Res., 2007, 6, 3549–3557.
Důsledek: falešná negativita výsledků
Co s identifikovanými proteiny?
* Závisí od původního experimentu
* Typicky doplnění anotace proteinů z databáze (GO, KEGG, TAIR) a použití metod
analýzy genových sad (další přednáška)
Identifikace proteinů
▪ NCBI Protein -http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein
* jen pro proteinové sekvence odvozené translací nukleotidových sekvencí
▪ RefSeq - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/
▪ UniProt– administrovaná databáze; kompozit SwissProt,TrEMBL a PIR-PSD–
http://www.uniprot.org
Cvičení a R balíky
* Provedeme cvičení MassSpectrometry.R
* Využívá bioconductor balík PROcess
* Další balíky
- rTANDEM (an R/Bioconductor package for MS/MS protein identification)
- dagLogo: An R/Bioconductor package for identifying and visualizing differential
amino acid group usage in proteomics data
Databáze dat
Výuka IBA
Veřejně přístupné databáze
▪ Velké experimenty mají až stovky, a nebo tisíce vzorků, v každé se studují desetitisíce až stovky
genů
▪ Pro publikaci výsledků je vyžadované vložit data ve standardizovaném formátu (MIAME– Minimal
Information About a Microarray Experiment) do jedné z veřejně přístupných databází tak, aby
kdokoliv byl schopný výsledky zreprodukovat
▪ Toto přináší velkou výhodu:
▪ Můžeme data podrobit meta-analýze (simultánně porovnat data z různých experimentů)
▪ Díky standardnímu formátu můžeme vyhledávat soubory s parametry, které potřebujeme
▪ Data můžeme automaticky stahovat
GEO na NCBI
Array Express na EBI
http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/
Další čtení
▪ E-learningová skripta analýzy dat IBA
▪ http://portal.matematickabiologie.cz/index.php?pg=analyza-genomickych-a-
proteomickych-dat--analyza-genomickych-a-proteomickych-dat