Editace fágového genomu pomocí systému CRISPR/Cas10 – seznámení s více vektorovým systémem
využívajícím CRISPR/Cas10 pro inaktivaci fága


Cílem teoretické úlohy je podrobně se seznámit s možnostmi editace genomů bakteriofágů pomocí
systému CRISPR/Cas10. Bakteriofágy jako viry bakterií mají řadu praktických aplikací a cílené změny
jejich genomu mají využití v biotechnologiích i medicíně. Efektivní metoda umožňující editaci
fágových genomů také přispívá významně k jejich výzkumu.

CRISPR/Cas10 editační systém a jeho využití pro inaktivaci/editaci fágových genomů

CRISPR/Cas10 systém označovaný jako Type III-A CRISPR/Cas systém byl poprvé identifikován u
grampozitivní bakterie Staphylococcus epidermidis. V úloze využijeme tento systém jako nástroj pro
editaci lytických fágů Staphylococcus aureus.

Bakteriofágy cílí na bakteriální hostitele druhově specificky, proto je editaci nutné provést v
příslušném hostiteli. Fágy injikují svou DNA do hostitele a s využitím jeho replikačního aparátu se
množí a následně lyzují hostitelskou buňku během několika desítek minut. Způsob editace fágový
genomů popisuje Obr. 1 (Bari et al., 2019).


Obr. 1: CRISPR/Cas systém typu III-A (Cas10) u S. epidermidis. A. systém kóduje tři spacery
(barevně) ohraničené repetitivními sekvencemi a 9 cas/csm genů. Efektorový komplex proteinů
Cas10-Csm je znázorněn hnědou barvou. Systém je využit pro editaci fágových genomů: B. kmen
s plazmidem cílícím na fágovou sekvenci. V prvním kroku se ověří, zda navržený spacer cílí na
cílového fága a inhibuje jeho replikaci. C. V druhé fázi je zkonstruovaný vektor tak, že kromě
spaceru nese také donorovou DNA s danou mutací s dostatečně dlouhými přesahy umožňujícími
rekombinaci. Fágy, které rekombinací získají požadovanou mutaci, se stávají imunní k původnímu
spaceru v navrženém systému.


CRISPR/Cas10 systém je kromě mezerníků tvořen efektorovým komplexem, který se skládá z 5
proteinových podjednotek (Cas10, Csm2, Csm3, Csm4 a Csm5) a crRNA. Nukleáza Cas6 a protein Csm6
hrají roli při sestřihu pre-crRNA na crRNA a komplex degraduje transkripty bakteriofága. Systém pro
editaci fágů zahrnuje dvou-krokový postup popsaný ve schématu (Obr. 2). V prvním kroku je vytvořen
kmen obsahující plazmid, který nese mezerník a efektorový komplex pro cílení na esenciální gen
bakteriofága. Tento kmen slouží jako kontrolní, ověřuje správnost návrhu mezerníku. V druhém kroku
se využívá editační kmen, který obsahuje na plazmidu nebo více plazmidech cílící mezerník a
donorovou DNA. Donorová DNA je sekvence, která obsahuje mutovanou sekvenci fága a je ohraničena
z obou stran 500-1000 nt dlouhou sekvencí fága. Bakteriofágy jsou pomnoženy na tomto editačním
kmeni, úspěšně se pomnoží pouze „mutantní“ potomstvo, které obsahuje mutovanou sekvenci (homologní
rekombinace) a uniká CRISPR/Cas systému. Genomovou sekvenci fágů, u nichž proběhla rekombinace nebo
přestavba genomu ověřujeme sekvenováním.

Výběr vhodného spaceru pro editaci fágového genomu v blízkosti genu, který má být mutován.

                 Vložení spaceru do plazmidového vektoru pro vytvoření  pcrispr/φ.

     Přenos plazmidu pcrispr/φ do kmene s funkčním CRISPR/Cas10 systémem – tzv. „cílící kmen“

                   Potvrzení funkčnosti spaceru. Infikování kmene bakteriofágem.

                                             Imunita?

Ne

1. Cílení na bakteriofága

Návrh a vložení donorové DNA obsahující požadovanou mutaci do vektoru pcrispr/φ a vytvoření
                                    pcrispr/φ-donorDNA

Ano

     Pomnožení fága na editačním kmeni. Purifikace plak a ověření vzniku rekombinantních fágů.

2. Editace f