Úloha č. 4 – příprava rekombinantního proteinu značeného fluorescenční značkou GFP
Výsledky funkčního testu – potvrzení vazby klonované vazebné domény endolyzinu značené GFP na
buněčnou stěnu bakterií
Předpoklad:
- po navázání domény na buněčnou stěnu pozorujeme zelenou fluorescenci
- specifita na Staphylococcus aureus, případně jiné druhy stafylokoků
Ošetření vzorku:
- 18-ti hodinová bakteriální kultura v MPB (resp. LB pro E. coli), odebrán 1 ml, centrifugace
11 000 g/2 min
- promyto 3x v PBS
- resuspendováno v 1 ml PBS
- k 250 ml buněčné suspenze v PBS přidat 50 l purifikovaného proteinu po FPLC
Fluorescenční mikroskopie pod imerzí, filtr FITC (zelená fluorescence, emise 509 nm, excitace 395-
475 nm)
Staphylococcus epidermidis – vidíme vazbu, ale s nízkou afinitou
Staphylococcus aureus – průkaz vazby GFP značené vazebné domény endolyzinu na buněčnou stěnu
S. aureus, mikroskop zaostří vždy určitou vrstvu preparátu – můžeme tedy vidět jak povrch (celý
zelený) některých buněk, tak řez buňkou (vidíme jako zelený prstenec) – protein je navázán na
buněčné stěně
Escherichia coli – negativní kontrola, bez vazby proteinu