Rostlinný genom Rostlinné explantáty Hana Cempírková, Ph.D. Bi8670 Principy rostlinných biotechnologií DNA https://i0.wp.com/science-explained.com/wp-content/uploads/2013/08/DNA.jpg https://i0.wp.com/science-explained.com/wp-content/uploads/2013/08/Chromosoom_English1.jpg https://i0.wp.com/science-explained.com/wp-content/uploads/2013/08/Cell.jpg https://science-explained.com/theory/dna-rna-and-protein/ Chloroplasty a mitochondrie ´Chloroplasty ´Cirkulární DNA, i další podobnosti s prokaryotickým genomem ´Velikost 120 – 160 kbp, 120 -140 genů; syntéza proteinů a fotosyntéza (ale většina genů pro fotosynt. v jádře) ´Mitochondrie ´Struktura proměnlivá, cirkulární, lineární ´Velikost 200 – 2500 kbp (větší než u živočichů), velké části nekódující DNA; syntéza proteinů a respirační řetězec ´ Figure 1. Gene map of tobacco chloroplast DNA. The genome size is 155,939 bp and consists of 86,686 bp of large single copy region (LSC) and 18,571 bp of small single-copy region (SSC) and two inverted repeats (IR)s of 25,341 bp each. Genes shown on the inside of the circle are transcribed clockwise and genes on the outside are transcribed counterclockwise. Genes for tRNAs are represented by a one letter code of amino acids with anticodons. Aster- isks denote split genes. Open reading frames unique to tobacco are shown by orf plus codon number. Open reading frames of unknown function but common to chloroplast genomes are shown by ycf plus designation number. Overlapping genes are displayed by low-high boxes for downstream or inside genes. Výsledek obrázku pro mitochondrial genome plants Výsledek obrázku pro mitochondrial genome plants Charakteristika genů gen kódující sekvence (+ repetitivní DNA) regulační část kódující úseky = exony nekódující úseky = introny promotor zaváděcí sekvence terminační sekvence Struktura genu a genová exprese http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/transcription/images/gene.gif http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/transcription/images/procolin.gif http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/transcription/images/eunotcol.gif Prokarytota Eukaryota Rostlinný genom, sekvenace ´2000 - kompletní sekvenace genomu Arabidopsis thalliana ´Od r. 2012 -1000 Plant Genomes Project (iniciováno na University of Alberta, Canada) ´https://sites.google.com/a/ualberta.ca/onekp/ ´ ´2017 (workshop v China National GeneBank) - rámci “Earth BioGenome Project (EBP)“ se plánuje sekvenace 10 tis. rostlinných genomů (http://www.sciencemag.org/news/2017/07/plant-scientists-plan-massive-effort-sequence-10000-genomes ) Rostlinné biotechnologie a propojení technik Figure 3: Functional genomic analyses were applied by the Plant Biotechnology Unit to determine how and when oil and toxins are produced in developing seeds and to identify possible impacts on the strategies for Jatropha genetic improvement. Jatropha curcas, a biofuel crop: Functional genomics for understanding metabolic pathways and genetic improvement (Maghluly et Laimer 2013) Rostlinné explantáty In vitro rostlinné kultury Rostlinné tkáňové kultury ´ http://cdn.biologydiscussion.com/wp-content/uploads/2016/10/image-616.png http://www.biologydiscussion.com/cell/plant-cell/top-10-applications-of-plant-cell-and-tissue-cultu re-biotechnology/61263 Explantát (Bauer 1939) je každý fragment živého pletiva, celý orgán nebo soubor orgánů, který je vytržen z korelačních vztahů celku a je pěstován v umělých podmínkách. Definice termínů ex plantare = pěstovat mimo in vitro = ve skle, v umělých podmínkách aseptická kultura = bez infekce (bakterie, kvasinky, plísně) axenická kultura = kultura jednoho organismu tkáňová kultura = historický pojem, přeneseno z oblasti fyziologie živočichů Definice termínů Úrovně organizace explantátu Dospělá rostlina Dospělá rostlina Embryo, klíční rostlina Orgán Pletivo Buňka Buňka: mikrospory, pylová zrna, buněčné suspenze Izolovaný protoplast Kultivační nádoby pro kultury in vitro (sklo i plasty) média ztužená zkumavky, Petriho misky, Erlenmayerovy baňky, zavařovací lahve, Magenta boxy Výsledek obrázku pro petri dish plants Suspenzní kultury média tekutá (nutné zajištění provzdušňování) laboratorní bioreaktor laboratorní třepačka Základní podmínky kultivace in vitro ´aseptická kultura nutnost sterilizace a desinfekce ´• vhodná výživa explantátu živná média ´• vhodné fyzikální podmínky ´– osvětlení ´ – teplota ´ – koncentrace plynů ´ – vlhkost vzduchu Laminární box, flowbox, očkovací box ´Pro zajištění sterility prostředí ´Vzduch je veden přes HEPA filtr a plynulým laminárním prouděním směrem k uživateli ´Obvykle z nerezavějící oceli bez mezer nebo spojů, kde by se mohly usazovat spory ´Horizontální a vertikální Katalog firmy Gelaire Očkovací box 1. bezpečnostní třída (digestoř) box nezajišťuje podmínky pro sterilní práci Očkovací box 2. bezpečnostní třída je možné pracovat i s GMO Očkovací box 3. bezpečnostní třída užití pro práci s vysoce infekčními, toxickými nebo radioaktivními materiály apod. Sterilizace a desinfekce ´A. Fyzikální ´ • mechanická a elektrostatická ´ vzduch očkovacích boxů (laminární, 2. třída) ´ filtrace termolabilních látek - filtry: ´ skleněné (frity G5, S4) ´ membránové (Seitz, Millipore, Sartorius) ´ 0,22mm ´ • UV záření (kultivační místnosti, boxy) ´ • teplota ´ suché nebo vlhké teplo (kahan, sušárny, autoklávy…) Sterilizace teplem suché teplo 120 - 170°C -horkovzdušné sušárny -kahan -sterilizační přístroj sklo nástroje vlhké teplo voda, živná média, roztoky, filtrační papír normální tlak - zavařovací hrnec - Kochův sterilační přístroj vodou chlazený plášť zvýšený tlak - tlakový hrnec - autokláv 100kPa, 121°C ´ Mrknout na review o mikropropagaci jablek, tam hezky shrnutý význam různých složek médií (třeba že cukry mají funkci zdroje uhlíku, ale i osmotickou v médiu…). Taky k čemu aktivní uhlí, kokosové mléko… Rostlinné hormony a růstové regulátory -Střední poměr auxinů k cytokininům kalus -Vysoký poměr cytokininů k auxinům prýt -Vysoký poměr auxinu k cytokininům kořeny - Kalus a transformace Výsledek obrázku pro callus plants http://plantcellbiology.masters.grkraj.org/html/Plant_Growth_And_Development10-Physiology_Of_Flower ing.htm Integrace tkáňových kultur do protokolů rostlinné transformace ´Upraveno dle Slater et al. 2003 Plant biotechnology Viz obr. 2.3, str. 51, Suspenzní kultury protoplasty kalus Somatická embryogeneze Organogeneze Přímá organogeneze Somatická embryogeneze Explantát (rost. pletivo) A,E A, D, E A,B A,B A,B A,B A,B (Metody regenerace) A – Agrobacterium B - biolisticky D – přímý přenos DNA E - elektroporace (Metody transformace) Arabidopsis floral dip transformation ´Pouze Arabidopsis a některé Brassicaceae ´ ´Princip: Agrobacterium osídlí vyvíjející se vajíčka a tam způsobí transformaci ´Velmi snadné a vysoká úspěšnost Suspenzní kultury buněk • rychle se dělící buňky • homogenní buňky nebo buněčné agregáty • rozmíchání v tekutém médiu • odvození buněčné linie (“cell line”) buněčné linie odvozené z jedné buňky klony jedné buňky : Iniciace suspenzní kultury buněk ´fragmenty nediferencovaného kalusu 2 - 3 g / 100 mL ´ ↓ ´ tekuté medium ´ ↓ ´ ↓ ´ ↓ ´ pasáže ´ ↓ ´ ↓ ´ ↓ ´ kultura suspenze buněk ´ aerace -------- míchání (agitace) -------- výběr malých shluků buněk ptc-001 Schéma Bergmannovy techniky výsevu buněk (Konar 1960) Sigmoidální růst (S): Lag fáze -- logaritmická (log, exponenciální) -- Stationary phase Growth curve copy Lag Log Stationary Exponential Linear Progressive deceleration Charakter růstu suspenzní kultury buněk 1. interval subkultivace pasáž ve stacionární fázi dlouhý růstový cyklus dlouhá lag fáze Faktory ovlivňující růst 1. interval subkultivace pasáž v log fázi --> krátký krátký Faktory ovlivňující růst: 2. Hustota buněk při iniciaci vysoká hustota buněk nízká počáteční hustota buněk --> krátká lag fáze málo buněčných dělení dlouhá lag fáze dlouhý exponenciální růst kritická iniciální hustota --> Faktory ovlivňující růst: 2. Iniciální hustota buněk obecně 0.5 – 2.5 x 105 buněk / ml 4 – 6 dělení 1 – 4 x 106 buněk / ml Použití kultur rostlinných buněk suspenzní kultura somatická embryogeneze umělá semena mutageneze mutant protoplasty modifikace buněk fúze buněk transfer genů sekundární metabolity sekundární produkty Rostlinné buněčné (suspenzní) kultury a tvorba sekundárních metabolitů Část rostliny (list, stonek, kořen, embryo) Kalusová kultura (na pevném médiu) Suspenzní kultura (v tekutém médiu) Bioreaktor ´ Výsledek obrázku pro immobilization cells plant ´ Orgánové kultury ´ ´„hairy roots“ kultury získané pomocí infekcí bakterie Agrobacterium rhizogenes ´Rostou bez rostlinných hormonů a mají rychlost růstu podobnou buněčným suspenzím ´Jsou dobrými producenty kořenových sekundárních metabolitů ´Prýtové kultury mohou produkovat sekundární metabolity syntetizované v nadzemních částech rostlin, např. esenciální oleje, terpenoidy, alkaloidy apod. Regenerace rostlinných buněk ´ Totipotence ´ ´ ´ Meristematic Tissue Vector Illustration Labeled Educational Plant Structure Stock Illustration - Download Image Now - iStock Rekalcitrance ´Nežádoucí a většinou ireverzibilní stav nastávající u kultur in vitro, kdy ´ buňky, pletiva nebo orgány ustrnou ve vývoji i růstu a ač jsou živé, nereagují ani na změněné kultivační podmínky (recalcitro = přístup odpírám, vyhazuji – o koni). Rekalcitrantní genotypy Příčiny ´jsou spatřovány v ekologické konstituci rostlinného materiálu (donora), manipulacích in vitro a stresorech in vitro. Vážný problém v biotechnologii. Hypotéza: neexistují (jen zatím nevíme jak na to) ´ ´ Somaklonální variabilita Rhododendron Příčiny zvyšující SV: Dlouhá expozice fytohormony (!2,4-D) Dlouhé intervaly mezi subkulturami Větší riziko při tvorbě adventivních než při množení z axilárních pupenů (a meristémů) Def. : Fenotypová variabilita genetického nebo epigenetického původu, zejména u rostlin odvozených z buněčných kultur in vitro. …. vysoký výskyt odchylek od původního fenotypu Somaklonální variabilita ´ Navsari Agricultural University Kiosk ´ „Embryo rescue“ ´ Figure 3 from Improved in vitro Vitis vinifera L. embryo development of F1 progeny of 'Delight' × 'Ruby seedless' using putrescine and marker-assisted selection | Semantic Scholar Improved in vitro Vitis vinifera L. embryo development of F1 progeny of ‘Delight’ × ‘Ruby seedless’ using putrescine and marker-assisted selection Embryo culture technique: To overcome barriers of distantly related crosses. : Plantlet ´ Somatická embryogeneze ´ Observations on Somatic Embryogenesis in Coffea arabica L. | IntechOpen Endospermové kultury ´ Endosperm vyjmut z nezralého semena a pěstován na vhodném médiu bez embrya ´ vytvoří se kalus, který může regenerovat přímou organogenezí nebo přes SE ´ nové rostliny jsou triploidní s novými vlastnostmi Snímek 1 Prašníkové kultury ´ anther-culture-4-638 - Study Solutions Sequence of plant regeneration from anther culture in S. commersonii.... | Download Scientific Diagram Kultury vajíček, semeníků (ovule, ovary culture) ´Méně časté než prašníkové kultury (tam, kde prašníkové nejdou) ´ What is Ovary Culture? Meaning, Principle and Method - Biology Reader Flow chart for the in vitro sugar beet gynogenesis protocol employed | Download Scientific Diagram Protoplastové kultury ´ Fúze protoplastů ´ spontánní ´ indukovaná (chemicky, elektrickým polem - elektroporace) Protoplast fusion Plant Protoplast Fusion by Electroporation ´ Výsledek obrázku pro plant in vitro carnivorous Děkuji za pozornost