Nové metody, editace genomu Výsledek obrázku pro genome editing Nové metody šlechtění „NEW PLANT-BREEDING TECHNIQUES“ ´odstraňují nevýhodu všech způsobů vzniku transgeneze, tj. cílí na přesné místo na molekule DNA, kde buď vyvolá mutaci, nebo umožní vložení genu ´cisgeneze = vkládání genu jako při transgenezi, ale jde o gen vlastního druhu, nebo druhu, se kterým se odrůda kříží ´Intrageneze = gen vlastního druhu, jen nové kombinace díky in vitro manipulaci funkčních genetických jednotek ´ODM - oligonukleotidem řízená mutageneze ´Agro-infiltrace ´Reverse-breeding ´gene editing, tj. editace, úprava genů (Zinc-finger, TALEN, CRISPR) ´ ´ Výsledek obrázku pro reverse breeding (Cardi et al. 2017) Příklady cisgeneze ´brambor Amflora, u nás již pěstovaný, byl připraven vložením jednoho vlastního genu v opačné sekvenci. Tím se vyřadil gen pro syntézu amylosy, takže škrob se skládá pouze z amylopektinu ´ ´brambor necitlivý na hnilobu byl vyšlechtěn díky genu přenesenému z jeho peruánského divokého příbuzného Amflora – GM brambor ´běžné brambory produkují směs škrobů amylopektinu a amylózy ´Amflora produkuje čistý amylopektin ´použití v potravinách se nepředpokládá ´u technických aplikací – v papírenském, textilním průmyslu a u lepidel - je čistý amylopektin výhodnější, ale oddělovat tyto dvě složky škrobu je nehospodárné ´vysoce kvalitní škrob Amflory optimalizuje průmyslové procesy: ´papíru dává vyšší lesk ´prodlužuje dobu, v průběhu které mohou být lepidla zpracována ´snižuje se tím spotřeba energie, přísad a surovin (voda) In the natural situation The cultivated potato is ‘tetraploid’ (every chromosome occurs 4 times) and therefore naturally contains 4 gbss genes. When gbss genes are expressed, first an RNA copy is made from these genes (an RNA copy is made from DNA). Then, the copy is transported to another place in the cell, where the various amino acids are put together based on the building block order of the RNA copy, to form the GBSS enzyme. The synthesized enzyme can then start its work and produce amylose. In the Amflora potato This process is interrupted in the Amflora potato. The additional copy of the gbss gene initiates a pathway that breaks up the RNA copies that have been made. And without RNA copies, no GBSS enzyme can be formed. As a result, no more amylose is synthesized. Amflora – GM brambor ´Ludwigshafen, Německo - 2. březen 2010 – Evropská komise povolila Amfloru, geneticky modifikovanou bramboru firmy BASF s optimalizovaným obsahem škrobu, pro komerční použití v Evropě ´žádost o schválení Amflory byla ve Švédsku podána již v roce 1996. ´Odrůda této brambory tak mohla být používána pro výrobu průmyslového škrobu. ´Evropská agentura pro bezpečnost potravin (EFSA) při několika příležitostech v průběhu schvalovacího procesu opakovaně zdůraznila bezpečnost Amflory pro lidi, zvířata a životní prostředí. Amflora Amflora v ČR ´první sklizeň 26.10. 2010 (150 ha polí) ´3 zemědělské podniky a zároveň vlastníci škrobárny v Hodíškově v kraji Vysočina ´celkem mělo být vyrobeno cca 1.000 tun škrobu. ´98% amylopektinu (místo původních 80% amylopektinu: 20% amylózy) ´pěstování Amflory se nijak neliší od klasických agronomických postupů ´Staženo z evropského trhu 2012 ´2013 EU zrušila schválení Amflory ´pro pěstování v EU amflora2 Cílená metylace promotoru ´metoda RdDM (na RNA závislá methylace DNA) umožňuje umlčet nežádoucí gen - spočívá ve „vypnutí genu" navázáním methyl-skupin na promotor příslušného genu, tedy na regulační úsek, který „spouští„ expresi genu (epigenetický proces) ´Cílenou methylaci vyvolá RNA se sekvencí odpovídající promotoru, který má být „uspán". Aby v buňce vznikla, je do ní vložen syntetický gen s příslušnou sekvencí, který požadovanou RNA kóduje. Přechodným stupněm je tedy transgenní rostlina. ´Methylovaný nefunkční promotor se dědí, kdežto transgen se odstraní. ´Potomstvo má tak „uspaný" nežádoucí gen, ale není transgenní. http://www.eurekaselect.com/images/graphical-abstract/cg/16/1/0005Q.jpg siRNA - small interfering RNA Agro-infiltrace ´přímá aplikace suspenze Agrobacteria do rostlinných pletiv (např. listů) pomocí injekční stříkačky nebo pomocí vakua (do listu nebo celé rostliny) ´Suspenze Agrobacteria proniká přes stomata do mezibuněčných prostor ´Aplikace: tvorba protilátek, vakcíny, produkce proteinů,… vhodná metoda pro průmyslové využití ´ Výsledek obrázku pro agro infiltration Reverse-breeding ´zahrnuje dva nezbytné kroky: suprese crossoverové rekombinace v selektované rostlině následovaná regenerací dvojitých haploidů ze spór, které obsahují nerekombinantní chromosomy (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2784905/) ´ ´ Výsledek obrázku pro reverse breeding Metoda roubování (grafting) ´vhodná všude tam, kde transgenem vnesené vlastnosti jsou výhodné pro kořeny - např. necitlivost na choroby nebo kořenové škůdce a roubování se vyplatí (u révy, broskví, jabloní apod.) ´vyloučí se tím šíření transgenu pylem a semeny, neboť semena a plody nejsou transgenní („geneticky modifikované„) ´takto byl připraven např. eukalypt rostoucí v půdě s vysokým obsahem solí. Podnož byla transgenní halotolerantní a na ní naroubován běžný eukalypt. Úprava genů – ODM (oligonucleotide directed mutagenesis) ´nedochází k vnesení cizorodých genů, ale pouze ke změně několika nukleotidů v rostlinné DNA ´2015 - firma Cibus (USA) - herbicidně tolerantní řepka v USA a Kanadě (změna jediné báze, vyskytuje se u divokých příbuzných) ´riziko: možnost potencionální nechtěné změny v genech ´ ´ nejasná legislativa v EU (také ostatní nové metody) ´ Zinc finger nucleases (ZFN) a Transcription activator-like effector nucleases (TALEN) ´Restrikční enzymy, které dokáží rozřezat specifické úseky DNA ´Indukují DSB – double-strand breaks ´přirozená oprava DSB v buňkách pomocí ´NHEJ (Non-homologous end joining) – spojení volných konců, ikdyž se sekvence málo nebo vůbec nepřekrývají, porušení genu ´HDR (Homology Directed Repair) – vložení nebo změna specificky ´Deaktivace genu nebo vložení nového genu Výsledek obrázku pro ZFN Výsledek obrázku pro talen Výsledek obrázku pro zinc finger Zinc finger – proteinový motiv, který tvoří kompatktní globulární strukturu s navázaným jedním nebo více zinkovými ionty, TALEN vs. ZFN -„cílení“ (targeting) je založeno na modulárních, proteinově založených rozeznávacích doménách -Jeden proteinový monomer se váže na jeden nukleotid = vysoká specificita (TALEN) Fokl je endonukleáza CRISPR/Cas9 ´segmenty nahromaděných pravidelně rozmístěných krátkých palindromických repetic (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) ´jsou to úseky prokaryotické DNA obsahující krátké repetice nukleotidů. Každá z repetic je následována krátkými segmenty tzv. spacer DNA, získanými při předchozích setkáních s příslušnými bakteriálními viry nebo plazmidy. ´prokaryotický imunitní systém, zajišťující rezistenci vůči cizím genetickým elementům, jako jsou plazmidy nebo fágy ´ Cas9 je nukleáza, enzym, specializovaný pro stříhání DNA ´gRNA je naváděcí RNA se sekvencí nukleotidů odpovídající sekvenci na DNA, kterou chceme upravit CRISPR/Cas9 ´ Výsledek obrázku pro crispr https://www.cambridge.org/core/journals/mrs-bulletin/news/crispr-implications-for-materials-science Výsledek obrázku pro crispr Základní postup pro editování genu pomocí CRISPR/Cas9 v rostlinách ´ Figure 2 In planta gene targeting http://www.botanik.kit.edu/molbio/img/content/Forschung_Figure_1_GT.png Principle of the in planta gene targeting system. Upon expression of the stably transformed CRISPR/Cas nuclease, three DSBs are introduced: one is formed in the desired target locus, activating it for homologous recombination (HR). The other two the so-called GT vector, which is located on the same T-DNA as the nuclease. The transgene on the GT vector then integrates into the activated target locus by HR, using the flanking homologies. The result is a site-specific and heritable integration of the transgene. http://www.botanik.kit.edu/molbio/15.php GT – gene targeting Waxy Corn – kukuřice vosková ´Přirozeně se vyskytující mutace, gen recesivní, proto není v populaci častý ´První plodina s upraveným genomem pomocí CRISPR-cas9 (společnost DuPont Pioneer, USA) ´Inaktivace genu vedoucí k vysokému obsahu amylopektinu (normální kukuřice obsahuje 75% amylopektinu a 25% amylosy, delece v genu vede k obsahu 97% amylopektinu). ´Mohla by se využívat jako jídlo i pro nepotravinářské účely (lepidla) ´V dubnu 2016 v USA povoleno, protože neobsahuje cizí geny. ´ ´ Novinky v oblasti NBT, www.biotrin.cz ´http://www.biotrin.cz/novinky-v-oblasti-nbt-i/ - článek 13.2.2018 ´ Off-site effects ´Mutace uvedené do nespecifických míst s podobnou (ale ne identickou) homologií k cílovým místům ´Je obtížné je identifikovat a vyžadují sekvenaci genomu a hledání změn v místech, která se podobají sekvencí cílové gRNA ´ https://www.broadinstitute.org/files/generic-page/images/2017/CRISPR-social-media-graphic.png https://www.broadinstitute.org/research-highlights-crispr CRISPR - dostupnost ´Sigma-Aldrich: CRISPR Plants: https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/crisprpl?lang=en®ion=CZ ´ (soubor crisprproductinfo sigma.pdf) ´ ´www.addgene.org (nezisková organizace pro sdílení plasmidů): https://www.addgene.org/crispr/plant/ ´ Výsledek obrázku pro crispr joke