Uzavření molekulárního modelu Molekulární „pharming“, tvorba sekundárních metabolitů H. Cempírková, Principy rostlinných biotechnologií Cíle ´ pochopení výhod využívání rostlin k tvorbě léčivých látek ´ ´ získání přehledu několika základních metod pro produkci protilátek a sekundárních metabolitů v rostlinách ´ ´ ´ ´ Hlavní směry biofarmingu ´produkce protilátek v rostlinách ´produkce peptidů, proteinů a enzymů cenných pro průmysl a farmacii ´transgenní rostliny jako systém produkce vakcín ´manipulace s metabolismem rostlin pro produkci nových sloučenin a sekundárních metabolitů s medicinální hodnotou Rostliny jako továrny na syntézu léčebných proteinů Klíčová nezelená sadba na vozovce ´možnost GM plodin pro produkci terapeutických proteinů ´ ´ve srovnání s kulturami bakterií, či živočišných buněk = pěstování GM rostlin = levnější produkce ´ ´v současné době se rozvíjí jako „plant-made pharmaceuticals (PMPs)“ = „farming“, molekulární farming nebo biofarming Protilátky ´Bílkoviny produkované imunitním systémem obratlovců ´specificky se vážou na antigen, což umožňuje aplikace v diagnóze, prevenci a léčbě lidských a zvířecích nemocí (rakovina, infekční nemoci, „odhojování“ (rejekce) transplantací…) ´ ´Potřeba technik, které výkonné, ekonomicky výhodné a bezpečné ´Většinou v mikrobiálních nebo savčích bioreaktorových systémech Savčí buněčné kultury ´Rozdíly mezi strukturou protilátek z hlodavců a lidí (vaječné buňky křečků vs. lidské jaterní buněčné kultury) ´Vysoké počáteční i udržovací náklady ´Limitované možnosti pro produkci velkého množství ´Možná kontaminace lidskými patogeny ´ ´Bakteriální fermentační systémy: ekonomicky výhodnější, ale problémy se správným skládáním (folding) proteinů ´ ´ALE: jsou dobře charakterizované a zavedené, proto vyhovují náročným regulacím v biofarmaceutickém průmyslu Další systémy pro tvorbu protilátek ´Kvasinky a vláknité houby – výhody bakterií, ale nevyhovující protilátky ´Hmyzí buňky – stejný způsob kultivace jako savčí, správné struktury ´Z mléka transgenních živočichů – obavy z přenosu patogenů nebo onkogenních DNA sekvencí ´Ze slepičích vajíček – bohaté na proteiny, obsahují protilátky, ale zatím málo prozkoumáno ´ ´Rostliny – nízké náklady (využití zemědělských technik bez nutné odbornosti pracovníků), možnost vysoké produkce a minimální rizika spojená s kontaminací Rostliny a tvorba protilátek ´Obecné základy stavby a tvorby proteinů stejné ve všech eukaryotech ´Posttranslační modifikace jsou velmi podobné ´Minimální rozdíly ve struktuře (zbytky alpha-1,3-fucosy a beta-1,2-xylosy), které mohou způsobit imunologickou odpověď v lidech, ale ne v myších – ale už umíme odstranit ´ ´ Rostliny a tvorba protilátek ´ Edgue, G., Twyman, R. M., Beiss, V., Fischer, R. and Sack, M. (2017), Antibodies from plants for bionanomaterials. WIREs Nanomed Nanobiotechnol, 9: n/a, e1462. doi:10.1002/wnan.1462 Rostliny a tvorba protilátek Rostliny a tvorba protilátek Další systémy tvorby protilátek v rostlinách ´Kultivace jednotlivých orgánů ´Suspenzní buněčné kultury ´Rhizosekrece, phyllosekrece ´Hairy roots ´Kultury jednobuněčných rostlin a vodních rostlin – např. řasy, mechy, okřehek (Lemna spp.) Transientní exprese Transientní transfekce ´ nevkládá se cizorodý gen do celé rostliny, jen do nereproduktivních pletiv ´ agroinfiltrace, biolisticky ´ rychlejší než tvorba transgenních rostlin ´ produkt během několika dnů, jednoduché převedení do většího měřítka ´ 2006 první vakcína z rostlin proti nemoci drůbeže (USA, ekonomicky neúspěšné) ´ firma Medicago (Kanada) – vakcína proti COVID-19 v listech Nicotiana benthamiana (tvorba virus-like particles), schváleno v Kanadě březen 2022 Transient Gene Expression Seeds Plant-Based Bioproduction Systems ´1. „PAT Plant milking“ - získávání sekundárních metabolitů z kořenových exudátů: ´Rostliny pěstované aeroponicky ´Zvýšení tvorby sek. met. pomocí elicitorů (útok obrana zvýšením tvorby exudátů) ´až 8 cyklů ročně ´Např. látky při léčbě osteoporózy, Alzheimera, proti-rakovinové ´2. „PAT Friday“ – GMO rostliny se sekrety, např. masožravé ´Do DNA rostlin vložena informace pro tvorbu terapeutického proteinu v sekretu ´Zisk proteinu nedestruktivně ´Např. Nepenthes, Drosera pat_greentech_biotech_plant_advanced_technologies_drosera_npthes_cosmetic https://labiotech.eu/for-anti-ageing-creams-to-alzheimers-this-biotech-milks-tropical-plants/ plant_milking_reuters_plant_advanced_technologies_biotech_medicinal_pat_france plant_advanced_Technologies_biotech_greentech_carnivorous_medicine_cosmetics http://www.plantadvanced.com/home Produkce vakcín a proteinů ´transgenní rostliny produkce antigenů patogenů ´ po požití imunizace živočichů (resp. člověka) ´ ´úspěšně testováno na myších i lidech ´plodiny využitelné jako jedlé vakcíny = ´ovoce a zelenina (poživatelná bez tepelné úpravy, cílem jsou brambory, banány, rajčata) Produkce vakcín a proteinů Jehla a lahvička ´vakcíny proti: ´virovým a bakteriálním původcům průjmových onemocnění ´HIV ´vzteklině §hepatitida B 2015 - Američané zveřejnili, že začínají klinické zkoušky s GM bramborami navozujícími u konzumentů odolnost proti hepatitidě B ´ ´lékařsky důležité proteiny: ´růstové hormony ´inzulín ´krevní náhrady ´inhibitory trypsinu ´ Edgue, G., Twyman, R. M., Beiss, V., Fischer, R. and Sack, M. (2017), Antibodies from plants for bionanomaterials. WIREs Nanomed Nanobiotechnol, 9: n/a, e1462. doi:10.1002/wnan.1462 Sekundární metabolity v in vitro Využití tkáňových a buněčných kultur pro produkci sekundárních metabolitů množení rostlin - nahrazuje úbytek z přírodních lokalit produkce sekundárních metabolitů in vitro kalusy buněčné suspenze kultury orgánů výhody: 1. řízené prostředí bez klimatických vlivů 2. absence mikroorganismů a škůdců 3. možnost selekce produktivních linií 4. automatizace (bioreaktory) - definovaná kvalita, pokles výrobní ceny, kontinuální produkce Obecná metodologie biotechnologických postupů pro produkci SM (ZENK 1978) plané nebo pěstované rostliny vysoce produktivní rostliny primární kalus stabilní produktivní klony optimální podmínky masová kultura v bioreaktorech výběr iniciace kultury selekce klonů optimalizace kultury zvětšení objemu Strategie metabolického inženýrství 1.nadprodukce enzymů nebo transportérů 2.eliminace kompetitivní dráhy nebo anti-sense technologie 3.přidání enzymů nové dráhy 4.blokace aktivity katabolických enzymů nebo přesun metabolitů do vakuoly „Anti-sense“ inaktivace Romer et al., 2002 ´metabolické inženýrství = brambor bohatý na zeaxanthin ´ ´„antisense“ inaktivace a kosuprese epoxidace karotenoidů ´„sense“ a „antisense“ konstrukty kódující zeaxanthin epoxidasu ´vložené do genomu bramboru ´inhibice konverze zeaxanthinu na violaxanthin ´vyšší hladina zeaxanthinu ´ ´simultánní zvýšení celkového obsahu karotenoidů (až 5.7x) ´ ´ Elicitace Thakur et al. 2019: Improving production of plant secondary metabolites through biotic and abiotic elicitation Biokonverze Kultury rostlinných buněk obsahují enzymy, které mohou katalyzovat velký počet reakcí. Výhodou aplikace rostlinných enzymů při biosyntéze je, že jsou tak produkovány čisté stereochemické látky (a ne směsi izomerů jako při chemické syntéze). Biokonverze - postup, při kterém se používají buněčné kultury, kterým se přidá prekurzor a v průběhu kultivace dojde k jeho přeměně na žádaný sekundární metabolit. = levnější než biosyntéza SM od počátku produkce SM není zatím (až na výjimky) komerčně úspěšná Nevýhody tkáňových a buněčných kultur pro produkci sekundárních metabolitů 1. nízká produkce SM x vysoké náklady 2. absence SM v buněčných kulturách (narozdíl od mateřských rostlin nebyly SM u mnoha kalusových a buněčných kultur zjištěny. Produkce SM začíná až při tvorbě kořenů nebo prýtů či při embryogenezi = nutnost diferenciace pletiv Důvody absence SM v buněčných kulturách ´přesun prekurzorů do primárního metabolismu ´ ´suprese nebo redukce exprese klíčových enzymů biosyntézy ´ ´absence diferenciace = nedostatek vhodných skladovacích míst, jako jsou sekreční buňky, dutiny nebo váčky, latexová pletiva nebo žlaznaté trichomy - vyskytující se pouze v diferencovaných pletivech Choi et al. 2002 35g 40 dnů 576g 1/3MS Sibiřský žen-šen – mikropropagace pomocí SE Eleutherococcus senticosus (=Acanthopanax senticosus, Araliaceae) SE perivincle periv_kalusy Vinca rosea, barvínek z Madagaskaru vincristin a vinblastin antikancerogeny kalusové linie Vinca rosea variabilita mezi liniemi To develop a genetic transformation method for C. roseus, Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 was employed which harbors a binary vector pCAMBIA2301 containing a report β-glucuronidase (GUS) gene and a selectable marker neomycin phosphotransferase II gene (NTPII). The influential factors were investigated systematically and the optimal transformation condition was achieved using hypocotyls as explants, including the sonication treatment of 10 min with 80 W, A. tumefaciensinfection of 30 min and co-cultivation of 2 d in 1/2 MS medium containing 100 μM acetosyringone. With a series of selection in callus, shoot and root inducing kanamycin-containing resistance media, we successfully obtained stable transgenic regeneration plants. The expression of GUS gene was confirmed by histochemistry, polymerase chain reaction, and genomic southern blot analysis. To prove the efficiency of the established genetic transformation system, the rate-limiting gene in TIAs biosynthetic pathway, DAT, which encodes deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase, was transferred into C. roseus using this established system and 9 independent transgenic plants were obtained. The results of metabolite analysis using high performance liquid chromatography (HPLC) showed that overexpression of DAT increased the yield of vindoline in transgenic plants. Development of efficient catharanthus roseus regeneration and transformation system using agrobacterium tumefaciens and hypocotyls as explants – Wang et al. 2012 digoxin digitoxin SM produkované buněčnými nebo orgánovými kulturami alkaloid ajmalicin Catharanthus roseus antihypertensivum zlepšení cirkulace v mozku berberin antimikrobiální Coptis japonica artemisinin seskviterpen antimalarikum Artemisia annua alkaloid taxol cytostatikum Taxus brevifolia codeine, morphine Papaver somniferum alkaloid alkaloid atropin scopolamine Atropa bella-donna glykosid diterpen Digitalis lanata kardiotonikum Využití transgenoze pro tvorbu SM při produkci SM v kořenech rostlin indukce tvorby kořínků pomocí Agrobacterium rhizogenes z Agrobacterium tumefaciens pro zvýšení produkce prýtů - vnášení genu ipt nebo pro auxiny Nicotiana rustica, Datura stramonium Mentha Georgiev et al. 2007 Indukce kultur kořenů a jejich aplikace Příklady metabolitů získaných z kultur transformovaných kořenů ajmalicin Rauvolfia micrantha antihypertenzivum Sudha et al. 2003 artemisinin Artemisia annua antimalarikum Weathers et al. 2005 betalainy Beta vulgaris antioxidant, barvivo Pavlov and Bley 2006 camptothecin Camptotheca acuminata antitumor Lorence et al. 2004 rutin, hispidulin a syringin Saussurea involucrata protizánětlivý, fungicidní Fu et al. 2006 scopolamin a hyoscyamin Datura innoxia anticholinergní Dechaux and Boitel-Conti 2005 taxol Taxus brevifolia antikancer Huang et al. 1997 6-methoxy-podophyllotoxin Linum album; Linum persicum antikancer Wink et al. 2005 Georgiev et al. 2007 -Produkce proteinů v trichomech listů tabáku -Vývoj pesticidů z proteinu z povrchu listů Shrnutí Protein Expression in Plant System - Lifeasible