Agronomické využití toxinu Bacillus thuringiensis Výsledek obrázku pro bt crops Bacillus thuringiensis ´v přírodě běžný mikrob = grampozitivní půdní bakterie z kmene Firmicutes ´je aerobní ´produkuje sporu, která má zachovat rod po dobu nepříznivých podmínek a současně syntetizuje zvláštní bílkovinu, která v buňce vykrystalizuje = bílkovina Cry (dříve d-endotoxin) ´specifickým úkolem Cry je velmi výběrově zabíjet určitý hmyz, který se pak stane zdrojem výživy pro potomky bacila, které vyklíčí ze spor Paleta kmenů B. thuringiensis ´tisíce kmenů s různou výběrovostí toxického účinku, v mnoha případech omezenou na velmi úzké skupiny hmyzu: ´Lepidoptera (motýli, můry, moli) ´Diptera (mouchy) ´Hymenoptera (vosy, včely) ´Coleoptera (brouci) ´Nematoda (háďátka) - jen vzácně ´ ´toxin Cry1Ba s širokým spektrem účinnosti, je spíše výjimkou Podstata toxicity Cry ´po pozření krystalu proteinu se bílkovina Cry začne v zažívacím traktu hmyzu rozpouštět ´toxický účinek bílkoviny vzniká až trávicí proteázy upraví molekuly odštěpením jednoho nebo obou konců - tím začíná první hrubý výběr oběti, krystal se rozpouští jen za určité kyselosti prostředí (pH) ´larvy motýlů a much mají silně alkalické prostředí v zažívací trubici, brouci a jejich larvy neutrální nebo mírně kyselé - toxiny působící na prvou skupinu mají ve struktuře převahu argininu, pro brouky méně zásaditý lysin ´místem účinku upravených peptidů jsou specifické povrchové receptory na epitelu hmyzí trávicí trubice – po vazbě peptidu, změní formu své molekuly a v membráně buňky vytvoří otvor, který buňka není schopna zacelit ´důsledkem toho hyne ten, kdo krystal pozřel = hmyzí larva nebo dospělec ´ Mechanism of Cry protein toxicity. A: Ingestion of spores or... | Download Scientific Diagram Využití toxinu z Bacillus thuringiensis ´70. léta 20. století ´kultury Bacillus thuringiensis jako specifický biologický insekticid ´Agrokombinát Slušovice - velkoobjemová fermentace kultur a jejich polní použití (postřik plodin) ´obchodní název přípravku Bathurin Využití Bathurinu a boraxu pro kontrolu mravenců Monomorium pharaonis ´2 možné způsoby boje proti mravencům: ´biologický: nástrahy Bathurin v kombinaci s boraxem v koncentraci 1.3% (1. týden borax do mletého masa, další 3 týdny přidávaný Bathurin – opakováno 5x) ´chemický: insekticid Anthrix – méně úspěšný ´ ´výsledek: biologická cesta pracnější a zdlouhavější, ale mnohem účinnější Vobrázková et al. Angew. Parasitol. 1976 Motýl zavíječ kukuřičný Ostrinia nubilalis ´Kromě jižní Moravy a středních Čech dnes významně škodí ve východních Čechách v oblasti Polabí i v okrese Ústí nad Orlicí ´Na Moravě se zavíječ kukuřičný vyskytuje kromě kukuřičné i po celé oblasti řepařské, především v okresech Prostějov, Vyškov a Kroměříž. ´ ´ ´ Ostrinia Ostrinia_nubilalis_male_dorsal samec, hřbetní strana ztráty způsobené tímto škůdcem v České republice se pohybují v průměru kolem 10 až 20 %, ale mohou dosáhnout i 40 % European corn borer Motýl zavíječ kukuřičný (Ostrinia nubilalis) ´významný škůdce kukuřice ´v posledních letech se rozšířil do všech oblastí pěstování kukuřice v ČR, vyhovuje mu vlhké a zároveň teplé prostředí ´housenky přezimují ve zbytcích stonků a palic na kukuřičném strništi - škodí v porostech kukuřice vyžíráním otvorů a chodeb ve stéblech a palicích - vyvrtané otvory jsou pak vstupní branou pro napadení palic a stonků houbovými chorobami (zejména fuzariózami – výskyt mykotoxinů), zároveň jsou příčinou lámání stébel ´kuklí se přibližně ve druhé polovině května a brzy se začínají objevovat první dospělci - nálety probíhají ve vlnách a trvají většinou až do konce srpna ´způsobuje nejen ztráty výnosu, ale i významně zhoršuje kvalitu produkce ´ Technologie ochrany proti zavíječi kukuřičnému ´ liší se v účinnosti, nákladnosti i možném nepříznivém vlivu na životní prostředí ´přirozená odolnost: zajištěná mechanickými a fyziologickými vlastnostmi odrůdy = dosti nízká ´chemická ochrana: plošná aplikace insekticidů na porost kukuřice - působí proti dospělcům motýlů nebo mají morforegulační účinky proti vajíčkům nebo larvám ´biologická ochrana ´ Biologická ochrana 1.plošná aplikace přípravku se sporami půdní bakterie Bacillus thuringiensis (Bathurin) 2.ruční aplikace kapslí Trichoplus® obsahujících chalcidky - drobné parazitické vosičky rodu Trichogramma prodělávající svůj vývoj ve vajíčcích motýlů 3.pěstování insekt-rezistentních geneticky modifikovaných hybridů kukuřice (Bt), do jejichž genomu byla genetickou manipulací vnesena část genetické informace půdní bakterie Bacillus thuringiensis ´ ´ Poznámka: Úspěšnost chemické ochrany, postřiku biologickým přípravkem nebo užití chalcidek jsou podmíněny aplikací těchto přípravků v klíčových momentech rozmnožovacího cyklu zavíječe, vždy na základě doporučení výrobce přípravku (podle signalizace - aplikace o několik dní dříve nebo později je jen málo účinná či zcela neúčinná) Transgenní Bt plodiny ´do rostlinného genomu je vložen gen řídící tvorbu toxické části bílkoviny Cry ´enzymatické úpravy již nejsou nutné ´je zachována specifita pro receptory = Bt plodiny zneškodňují jen určitou skupinu hmyzích škůdců ´Bt kukuřice MON 810 má přidaný gen pro toxin cry1Ab - je proto toxická jen pro larvy motýlů (zavíječ kukuřičný - Ostrinia nubilalis), ale již ne pro brouky, jako je bázlivec kukuřičný (Diabrotica virgifera) ´toxicitu pro brouky zajistí gen cry3Bb1 tvořící peptid toxický pro brouky (Coleoptera) ´připravují se hybridy transgenních linií kukuřice Bázlivec kukuřičný Diabrotica virgifera ´ larvy žijící v půdě mohou vážně poškodit kořeny kukuřice a způsobit ztráty na výnosu Diabrotica1_001 Diabrotica2_001 http://www.eppo.org http://www.vodoley.dn.ua/eng/diabrotica.html DIAB_larvy_03 Diabrotica_larvae western corn rootworm Bázlivec kukuřičný Diabrotica virgifera ´jeden z nejvýznamnějších hmyzích škůdců zavlečených v posledních padesáti letech do Evropy ´zavlečen ze Severní Ameriky koncem 20. století ´prvotní ohnisko v Srbsku – 1992 lokalita Surcin blízko mezinárodního letiště Bělehrad – i jinde pak kolem letišť ´v České republice poprvé nalezen v Čejči v roce 2002 DIABROTICA_map2010 2010 2011 Transgenní Bt plodiny ´rostlina sama toxin produkuje uvnitř svých buněk = odpadají náklady ´na insekticidy ´výjezdy techniky ´i starost s načasováním zásahu ´toxin zneškodní i larvu ukrytou uvnitř stonku (při používání insekticidů postřikem ne) ´to že rostlina tvoří "insekticid" ve svých buňkách je v přírodě časté: většina rostlin se podobně tvorbou repelentů brání býložravcům: štiplavé silice cibule, solanin v bramborech nebo alylisothiokyanát křenu, bez černý má proti savcům jed v kůře (lektin) - proto jej zajíc neohryže ´přítomnost bílkoviny Cry uvnitř buněk Bt rostliny je výhodná: hmyz s ní přijde do styku až když "si kousne“ a bílkovina přejde do jeho zažívací trubice – tak je definován jako škůdce, protože málokdy označujeme hmyz okusující plodiny za užitečný ´hmyz si na toxin nemůže „zvyknout“ - dokud toxin nereaguje s receptory intestinálních buněk, hmyz o jeho přítomnosti „neví“ (ALE může vzniknout rezistence, podrobnosti v dalších slidech) Kukuřice (Bt) ´v EU: ´MON 810 (Bt) odolná proti napadení zavíječem kukuřičným (Monsanto) ´Bt11 – insekticid i herbicid-rezistentní (Syngenta) ´1507 - insekticid i herbicid-rezistentní, syntetický Cry (DuPont) ´ ´ ´MON89034 x MON88017 produkuje 3 rozdílné Bt proteiny – 2 proti napadení zavíječem kukuřičným a 1 proti napadení bázlivcem kukuřičným – na univerzitě ve Würzburgu prokázali, že jejich pyl není toxický pro včely Vývoj ploch a počtu pěstitelů GM kukuřice v ČR Rok Plocha (ha) Počet pěstitelů 2005 150 51 2006 1 290 82 2007 5 000 126 2008 8 380 167 2009 6 480 121 2010 4 680 82 2011 5 090 64 2012 3 050 41 2013 2 560 31 2014 1 754 18 2015 997 11 2016 75 1 2017 0 0 2018 0 0 Pramen: Mze. Tab. Pěstování GM kukuřice v EU (ha) 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018* Španělsko 53 200 53 670 75 148 79 269 79 706 76 575 97 346 116 307 136 962 131 537 107 749 129 081 124 228 115 246 Portugalsko 780 1 250 4 199 4 856 5 094 4 869 7 724 7 700 8 202 8 542 8 017 7 056 7 307 5 733 ČR 150 1 290 5 000 8 380 6 480 4 677 5 091 3 053 2 561 1 754 997 1 0 0 Polsko 0 100 100 300 3 000 3 500 3 900 4 000 0 0 0 0 0 0 Slovensko 0 930 930 1 930 875 1 281 760 189 100 411 400 112 0 0 Rumunsko 0 331 331 7 146 3 400 822 588 217 834 771 3 0 0 0 Francie 500 22 135 22 135 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Německo 340 2 685 2 685 3 171 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 CELKEM 54 970 82 391 110 528 105 052 98 555 91 724 115 409 131 466 148 659 143 015 117 166 136 250 131 535 120 979 Pramen: FAS, ISAAA, MZe, REA, Ministerstvo zemědělství Španělska. Pozn: *odhad kromě ČR, kde se jedná o konečný údaj. Bt bavlník ´Zavedení Bt plodin znamená značný přínos pro všechny zemědělce, ale zejména pro chudé země v subtropickém pásmu. ´V roce 2017 se pěstovalo 33.1 mil. ha Bt bavlníku (USA, Čína, Indie, JAR, Mexiko, Argentina, Pakistán) – více než 90 % celk. produkce ´Bavlník je obzvláště sužován hmyzími škůdci. Má-li jich být zbaven, musí se použít někdy až 28 postřiků (průměrně 11) chemickým insekticidem – za sezónu se utratí za insekticidy okolo 500 USD na hektar. ´kde na to rolník nemá - má velké ztráty na úrodě ´Když si může koupit insekticid a nikoli však potřebnou techniku, vyvolává jeho nechráněné použití mnoho otrav, dokonce i u dětí. ´Světová zdravotnická organizace (WHO) udává půl milionu případů otrav a z toho pět tisíc úmrtí. seminar+report+on+bt+cotton Bavlník v Indii ´ 3 4 - V současnosti ca. 90% bavlníku v Indii je bt bavlník (jediná GM rostlina povolená v Indii) Současný stav Bt plodin (2017) http://www.isaaa.org/resources/publications/pocketk/6/default.asp 247 milionů akrů celkem Některé poznatky získané při pěstování Bt hybridů v odrůdových pokusech ÚKZÚZ v letech 2004 až 2006 Registrační zkoušky Bt-hybridů kukuřice ´probíhaly v ČR od roku 2004 ´Bt-hybridy byly zkoušeny v rámci běžných registračních zkoušek kukuřice ´Zkoušení hybridů kukuřice bylo rozděleno do čtyř samostatných skupin ranosti: velmi raný, raný, středně raný, středně pozdní. Každá skupina byla zkoušena minimálně na čtyřech až šesti lokalitách, zkoušky trvají obvykle 2 - 3 roky. ´Zkoušení bylo organizováno v maloparcelkových pokusech v neúplných blocích typu alfa-design, ve třech opakováních. ´Během vegetace se hodnotily významné hospodářské vlastnosti hybridů, pokus se ukončil sklizní a zjištěním výnosových a kvalitativních ukazatelů. ´Výsledky pokusů (zkoušek užitné hodnoty) byly zpracovány, statisticky vyhodnoceny a slouží ÚKZÚZ jednak jako součást podkladu pro rozhodnutí o registraci a jednak jsou publikovány pro uživatele v praxi. Přednosti Bt hybridů kukuřice ´ uplatnění především v oblastech se silným výskytem zavíječe ´stébla a palice nejsou poškozována požerem zavíječe, méně se lámou, déle asimilují, snižují se ztráty při sklizni ´v závislosti na stupni napadení porostu zavíječem mohou dosahovat vyšších výnosů než konvenční hybridy (ve zkouškách ÚKZÚZ byl zjištěn nárůst kolem 10 - 15 %, na lokalitách se silným výskytem zavíječe až 30 %) ´jsou méně napadány fuzariózami palic, lze předpokládat i nižší obsah mykotoxinů v produktu (v ČR není registrován žádný fungicidní přípravek účinný proti houbovým chorobám palic kukuřice) ´není potřebná plošná neselektivní nebo jen málo selektivní insekticidní ochrana proti zavíječi Možná negativa při pěstování Bt hybridů ´zavíječem nepoškozené rostliny déle asimilují a vegetují - může se mírně opožďovat dozrávání ve srovnání s konvenčními hybridy stejné kategorie ranosti ´vyšší administrativní náročnost - poskytování informace sousedům a státním orgánům, povinnost dodržování pravidel koexistence, povinnost označovat GM produkt ´možné problémy s odbytem kukuřice nebo s odbytem dalších produktů vzniklých za použití GM produktu Od roku 2017 není v ČR žádná Bt kukuřice pěstována (ani jiná GM plodina) Kauza: Bt kukuřice a monarcha stěhovavý §Losey et al. (1999): Transgenic pollen harms monarch larvae. Nature 399:214 §Pouze laboratorní testy toxicity §pyl většiny hybridů kukuřice obsahuje mnohem méně Bt než zbytek rostliny §Kontaminace pylu prašníky a jinými částmi rostlinného květu, které obsahují velké množství toxinu By William Warby §Sears et al. (2001): Impact of Bt corn pollen on monarch butterfly populations: A risk assessment. PNAS 98 (21): 11937-11942. §Kombinace laboratorních i polních testů, zvážení ostatních faktorů §pyl jen určitou část roku, rozmnožovací sezóna motýlů je delší §Poměr nezemědělských porostů vs. zemědělských porostů (larvy se neživí jen na kukuřičných polích…) §Pyl kukuřice přenášen do malé vzdálenosti – snižování koncentrace mimo pole kukuřice … § -Larvy motýla se živí pouze rostlinou Asclepias (česky klejicha, ang. milkweed) -Klejicha roste často na polích kukuřice v CA a USA -Pojídání pylu spadlého z květů kukuřic v době otvírání prašníků Obavy z rezistence hmyzu ´ ´ ´ ´ ´ ´ ´Nutnost dodržování bezpečnostních agronomických postupů - tzv. refugia – kolem GMO plodin se pěstují nemodifikované rostliny – hmyz s odolností vůči toxinu se kříží s hmyzem z těchto refugií, čímž odolnost zanikne (recesivní znak) ´ Výsledek obrázku pro bt crops https://3c1703fe8d.site.internapcdn.net/newman/gfx/news/hires/2013/2-biotechcrops.jpg By 2011, the area planted worldwide to genetically engineered Bt corn and Bt cotton increased to 66 million hectares (160 million acres) and the number of pest species with resistance causing reducing efficacy of Bt crops climbed to five. The asterisk indicates the number of resistant pests could be underestimated for 2011 because reports of field-evolved resistance typically are published two or more years after resistance is first detected. Image courtesy of Nature Biotechnology Read more at: https://phys.org/news/2013-06-pests-resistant-gm-crops.html#jCp Herbicid tolerantní plodiny Roundup System Herbicid tolerantní plodiny ´transgenní plodiny tolerující nespecifické herbicidy (HTP) ´jejich použití je z hlediska ochrany rostlin složitější - umožňují získat prakticky čistou monokulturu = kritika z hlediska biologické rozmanitosti ´rizikem je vznik plevelů tolerujících herbicid podobně jako transgenní plodina - mohou vznikat jak přirozenými mutacemi, tak přímým přenosem transgenu podmiňujícího necitlivost (v případě křížitelnosti a vzniku plodného potomstva) – u nás je rizikem řepka Herbicid tolerantní plodiny ´Roundup Ready sója pěstovaná od roku 1996 ´Roundup Ready 2 Yields - výnosy významně vyšší = povolena v 10 zemích: USA, Austrálii, Kanadě, Číně, Japonsku, Mexiku, Novém Zélandu, Filipínách, Tchajwanu ´od 2008 i v Evropské unii ´ ´ Roundup ´širokospektrý herbicid, firma Monsanto ´účinnou látkou je glyfosát (analog glycinu) ´je absorbován listy a přenášen do rostoucích pletiv (meristémů) ´funguje jako inhibitor enzymů, které fungují v syntéze aromatických aminokyselin (tyrosin, tryptofan, fenylalanin) ´ ´ https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/04/Glyphosate.svg/620px-Glyphosate.svg.png Roundup ´Glyfosát působí na vazebném místě fosfoenol-pyruvátu ´ ´„RoundupReady“ systém představuje stabilní gen, který zabraňuje vazbu glyfosátu a tak umožňuje tvorbu esenciálních aromatických aminokyselin Roundup ´tato chemická cesta není u zvířat (musí aromatické aminokyseliny získávat z jídla) ´ovlivňuje některé živočišné enzymy ´hodnocen jako velmi málo toxický, nekarcinogenní, neteratogenní ´ale evidovány případy kontaktního popálení u pracovníků na farmách Degradace v prostředí ´při kontaktu s půdou se glyfosát váže na půdní částice a je inaktivován ´nevázaný glyfosát může být degradován bakteriemi ´absorpce glyfosátu závisí na typu půdy ´poločas rozpadu může být 3 dny (Texas) až 141 dnů (Iowa) ´metabolit vzniklý rozpadem glyfosátu byl nalezen v půdě ve Švédsku až po dobu 2 let ´ Zvýšení spotřeby glyfosátu po zavedení Roundup Ready plodin od r. 1996 ´ Díky pěstování HT plodin farmáři nepoužívají orbu nebo ji snižují – snížení spotřeby paliva, snížení poškození vrchní vrstvy půdy. ALE! Orba má i jiné vyhody než redukci plevele (viz přemnožení hrabošů) Zvyšování počtu rezistentních plevelů ´ https://www.alexfergus.com/blog/glyphosate-the-weed-killer-found-in-our-food-water Stav v EU, ČR a světě (2017) ´EU: Odrůda GA21 (Monsanto) – obch. název Roundup Ready™ Maize, Agrisure™GT a někteří hybridi (např. Bt11 x GA21) ´ ´V ČR oprávnění zaniklo 2011 ´ From 1996 to 2017, HT crops consistently occupied the largest planting area of biotech crops. In 2017 alone, HT crops occupied 88.7 million hectares or 47% of the 189.8 million hectares of biotech crops planted globally. The most common are the glyphosate and glufosinate tolerant varieties. The following table shows countries that have approved major HT (with single and stacked genes) crops for food, feed, and/or cultivation. Plodina Země HT plodiny 2017 ISAAA GM Approval Database. http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/.