ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR Tipy na začátek • Experimentální design – Co dělám? – Proč to dělám? – Jak to dělám? • Kontrola všech chemikálií – Voda – alikvoty – Kit na RT – jen pro 1 studenta – Master mixy – omezené množství lidí Tipy na začátek • Oddělení místností pre a post PCR – Izolace DNA, RNA – RT – PCR a post-PCR Tipy na začátek • Negativní kontrola, pozitivní kontrola • Příprava rozložení vzorků na destičce – no template control tak, aby nedošlo ke kontaminaci – co nejdále od vzorků s vysokou koncentrací • Všechno rozmrazit na ledu, v temnu • Reakční směs zhruba o 10% víc než je potřeba • Destičku lze uchovat až 10 h v temnu a chladu • Správně a úplně zalepit destičku fólií i na okrajích • Alespoň duplikáty • Po napipetování spin na centrifuze Kontroly Frekvence kontrol Negativní kontroly • No RT- pokud ukáže amplifikaci - kontaminace genomovou DNA • NTC - voda a reakční směs – žádný signál nebo alespoň o 8 cyklů později, 2 krát • NAC - no amplification control, bez polymerázy • IPC – interplate control – zbavit se batch effektu Pozitivní kontroly • Detekce kvality reagencií, přítomnost inhibitorů, poškozený vzorek • Endogenní- druhý target kromě detekovaného genu, v multiplexu nebo zvlášť, standardizace množství DNA n RNA • Exogenní- je známa exprese daného genu (předchozí reakce, plazmid….) • Spike control Interplate control • Interplate calibrators are used to compensate for variations between runs due to instrument settings (base-line correction and threshold settings). These variations are independent of assay, but depend on instrument channel used. • The Cq of an interplate calibrator must be determined with very high accuracy, else interplate calibration may add more variance to the data than the systematic variation it removes. • It is highly discouraged to perform independent interplate calibrations per assay! Interplate control • When expression of genes and samples is compared, multiple runs can be merged for common analysis without correction if either: – All genes analyzed for each sample are assayed in the same plate (“All genes”) – All samples analyzed for each gene are assayed in the same plate (“All samples”) – MIXED analysis: Requires interplate calibration • very robust assay • SD of triplicate < 0.1 Cq • uncomplicated and stabilized template at fairly high concentration (15 < Cq< 20) • provided in 50 aliquots ready to use (-20°C storage) • IPC should be run in replicates (minimum triplicates) Kdy není potřeba IPC – ALL GENES Kdy není potřeba IPC – ALL SAMPLES Kdy je potřeba IPC - MIXED Kontroly RT-qPCR • Accuracy, sensitivity, fast results • Monitoring of amplification in real-time Bustin, 2010 RT-PCR • Experimental design • RNA extraction • RNA quality control • Reverse transcription • Primer and amplicon design • qPCR validation • Choice of reference genes • Experimental reproducibility Experimental design • mRNA transcription sensitive to external stimuli- need to minimize • Define – procedures – control groups – type and number of replicates – experimental conditions- minimize variability RNA extraction • From ‘fresh’ material if possible • RNA stored at -80C or in RNA storage solution • Minimize handling time- 10-20 samples • DNAse I treatment RNA quality control • High purity (no contamination) • High integrity (not degraded) • Impurities- PCR inhibition • Purity- protein contamination • OD 260/280 1.8-2.0 no protein • OD 260/230 1.8-2.0 no organic contaminants • RIN>7 • Consistency in purity and integrity-reduction of variability of samples • Immediately follow with procedures, store only cDNA Reverse Transcription • Immediately after isolation- no degradation of RNA from freeze/thaw • Consistent and complete coverage of transcribed regions • Always enter same amount of RNA and same reaction time for all samples • Ctrl – no RT samples (contamination with genomic DNA) – no template control (contamination) • RT Buffer – mix of random primers – RNAse H – RT enzyme- broad dynamic range Primer and amplicon design • Essential for specific and efficient amplification • Target sequences – Unique – 75-100 bp – GC content 50-60% – No secondary structures • Primers – GC content 50-60% – Melting temperature 55-65C – No long stretches of G or C – G or C at the end of primer – Primer blast, MFOLD, experience qPCR validation • Assessed for optimal range of primer annealing temperatures, efficiency, specificity using a standard set of samples • Reaction conditions, buffers, primers optimized • cDNA samples not contaminated • www.bio-rad.com/genomics/pcrsupport qPCR validation • Optimal annealing T for primers- temperature gradient • Analysis of PCR product- melt curve analysis (single sharp peak) • Samples run on gel • NTC necessary (primer-dimer, DNA contamination) PCR efficiency • Measure of rate at which polymerase converts the reagents to amplicon • Maximum increase per cycle is 2-fold – 100% efficiency • Low efficiency – inhibitors of polymerase – high or suboptimal annealing temperature – old/inactive Taq – poorly designed primers – secondary structures Standard curve • 10-fold dilution – 8 points • Broad dynamic range • For each point- in triplicates, get Ct values • Need tight technical replicates • If OK- Ct values separated by 3.32 cycles • Need 90-110% Efficiency • R values- how well data fit on curve • R2>0.985 OK • Will define dynamic range of reaction qPCR • Commercial qPCR kits • Sample volumes- 10-50ul in 96 well plate format • Software analysis – Flexibility in set up info – Group wells – Gene expression analysis – Ability to combine multiple plates Choice of reference genes • Perfect reference gene- no expression changes between samples from various experimental conditions, time points • How to find: – Extract RNA from 1-2 samples from each condition or time point, confirm purity and quality – Normalize concentration, do RT from same volume – Do qPCR from same volume of cDNA – geNorm method to calculate stability (med-gen.ugent.be/genorm/ – Need 3-5 genes Experimental reproducibility • 2 sources of variability: – Biological- differences of organisms, tissues, cell cultures – Technical- pipetting, samples quality... • 3 biological and 2 technical replicates • 3 biological replicates- separate and independent experiments Key steps for qPCR • Appropriate number of biological replicates and control samples • Strict protocols for acquisition, processing and storage • RNA purity and integrity • Reverse Transcription • Proper design of PCR Kvantitativní vztah mezi množstvím PCR produktu (amplikonu) a intenzitou fluorescence • Amplifikační práh detekce (Ct) Real – time detekce amplifikace Plateau fáze Exponenciální amplifikace pod úrovní pozadí Exponenciální fáze „end point“ „real-time“ Threshold cycle „Ct“ – určený na základě hodnoty fluorescence pozadí (backround) a aktuální fluorescence vzorku – kvantitativní výstup pro každý vzorek Real – time detekce amplifikace - Ct Threshold Threshold cyclesBackground Fluorescence Threshold cycle „Ct“ - počáteční množství kopií templátu - definovaný v exponenciální fázi PCR - stejná účinnost PCR ve všech reakcích - účinnost štěpení fluorogenní sondy nebo vazby fluoroforu na DNA - citlivost detekce - čím menší Ct - tím větší počet kopií templátu na začátku reakce Real – time detekce amplifikace - Ct A CB A CB> > - rozdíl 1 Ct – dvojnásobné množství templátu 21 = 2 - kolika cyklům odpovídá odpovídá 10ti násobný rozdíl v množství templátu? (předpokládáme 100% účinnost PCR) 2n = 10 Threshold cycle „Ct“ Real – time detekce amplifikace - Ct 50 100 150 250 300 0 c [ng/l] Ct 50 28,16 100 27,16 150 26,66 250 26,06 300 25,66 n=3,32 Kontaminace PCR Cross contamination Carry-over contamination PCR 1 PCR 2 PCR 2PCR 1 Vzorek 1 Vzorek 2 Přenos amplikonu do dalších PCR Vzájemná kontaminace vzorků Jak předejít kontaminaci Kontaminace • Správná laboratorní praxe • Plastik v RNA kvalitě • Automatizace  www.millipore.com; www.appliedbiosystems.com Application note: Contamination-pipetting: relative efficiency of filter tips compared to Microman® positive displacement pipette. Nature Methods 3 June 2006 Prevence kontaminace • Fyzické oddělení pre a postPCR procesů • Pipety a jiné nástroje oddělit • Rukavice měnit často • Reakci připravit v laminárním boxu • Filtrované špičky • Reagencie – pracovat opatrně, zabránit kontaminaci • UV světlo pro dekontaminaci místnosti, 10% savo Nejčastější důvody špatné PCR • Špatný design primerů a sond • Špatná kvalita RNA • Nepoužívání master mixů • Cross-contamination • Nepoužití no RT control (NAC ctrl) • Špatná normalizační kontrola • Sybr green – melting curve • Ct cycle – v exponenciální oblasti • Špatná efektivita reakce • Špatně udělaná standardní křivky Co je sonda • qPCR založeno na detekci fluorescenčního signálu – Taqman probes (FRET) – Molecular beacons (FRET) – Scorpions (FRET) – Sybr green • Detekce PCR produktů vyrobením fluorescenčního signálu Co jsou primery • Sekvenčně specifické úseky DNA