ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR VII. Troubleshooting 3 qPCR parameters • Baseline – determined during early phases of qPCR across the entire plate, background signal • Threshold – numerical value determined for each run, statistically significant point above the calculated baseline • Ct – threshold cycle – cycle number where fluorescence crosses the threshold Baseline • Software – 3-15 cyklus reakce Baseline Problémy v qRT-PCR analýze Jak vypadá správný amplifikační výstup? Ct1 18,06 Ct2 18,04 Duplikátní reakce • Exponenciální amplifikace • Identická amplifikace • Podobné/shodné Ct • Odpovídající fluorescence jednotlivých reportérů Problémy v qRT-PCR analýze Problém 1: Příliš mnoho templátu • Vysoká hodnota pozadí • Fluorescence v prvních cyklech (ze kterých se počítá baseline) je vyšší, než fluorescence na konci reakce Řešení: • Ředit templát 1:100 – 1:1000 a zopakovat PCR • Změnit manuálně treshold nebo nastavení baseline  Baseline 3.-25. cyklus Baseline 3.-13 cyklus ➔ Problémy v qRT-PCR analýze Problém 2: Amlifikace není exponenciální Pravděpodobně přítomnost inhibitorů v konkrétním vzorku Řešení: Ředění templátu 1:10-100 Ct 16,07 – 21,97 Ct 37,86-38,64 „Undetermined“ Problémy v qRT-PCR analýze Problém 3: Ct duplikátních reakcí se výrazně liší • pravděpodobně nedošlo k amplifikaci • gelová elektroforéza PCR reakcí nebo • multikomponentní záznam fluorescence • nepřesné pipetování, Monte Carlo efekt, přítomnost inhibitoru v reakci Řešení: • Zopakovat reakce nebo (pokud už nemáme vzorky) • vzít v úvahu Ct z exponenciální reakce • přijít na příčinu problému (otestovat příslušnou jamku v bloku, reagencie atd.) FAM duplikát 1 FAM duplikát 2 RO X Duplikát 2 Duplikát 1 Problémy v qRT-PCR analýze Problém 4: Nedošlo k amplifikaci u žádného vzorku Řešení: • Zopakovat reakce včetně pozitivní kontroly • Pokud opět nedošlo k amplifikaci u žádného vzorku, zkontrolovat společné chemikálie (voda, master mix, sonda) • Zkontrolovat reakci na agarózovém gelu a vyloučit selhání sondy, eventuálně provést reakci spolu se SYBR green • Pokud se problém vyskytuje pouze u některých vzoků je problém s těmito vzorky (kvalita templátu, inhibice) Problémy v qRT-PCR analýze Problém 5: Nefunguje sonda Řešení: • Vyloučit lidskou chybu, přítomnost inhibitorů, nekvalitní templát, chyby v RT • Kontrola pomocí SYBR Green nebo v agarózovém gelu • Pokud je vyloučeno selhání amplifikace, provést test s DNázou I DNázaI - oddělí fluorofor od zhášeče a umožní fluorescenci - problémy ve značení nebo purifikaci sondy Problémy v qRT-PCR analýze Problém 6: Směrnice kalibrační křivky je menší než -3,3 • Efektivita PCR reakce je menší než 100% Řešení: • chyba výpočtu, inhibitory v reakci, chyba při pipetování • nové standardy • kontaminace templátu, koncentrace MgCl2 y = -4,5144x + 36,21 R² = 0,9934 24,5 25 25,5 26 26,5 27 27,5 28 28,5 29 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 2,6 Problémy v qRT-PCR analýze Problém 7: Směrnice kalibrační křivky je větší než -3,3 • Účinnost PCR vyšší než 100% • V případě specifické detekce (TaqMan) většinou pipetovací chyby nebo chyby ředění - event. změnit některé parametry analýzy (zejména baseline) • SYBR Green – možné nespecifické produkty (primer dimery) Řešení: • nová reakce • optimalizace PCR Problémy v qRT-PCR analýze Problém 8: Nelze naředit standardy na nižší koncentraci • Přítomnost kontaminující DNA Řešení: • nové standardy • ověřit čistotu RNA vstupující do procesu Problémy v qRT-PCR analýze Problém 9: Amplifikační grafy vypadají divně • příliš mnoho templátu • chybné nastavení baseline Řešení: • naředit vzorky • změnit nastavení baseline – vyloučit cykly, ve kterých je abnormální fluorescence • změnit algoritmus výpočtu Problémy v qRT-PCR analýze Problém 9: Amplifikační grafy vypadají „divně“ • změnit algoritmus výpočtu – tzv. adaptivní nastavení baseline – pro každý cyklus jednotlivě