Posttranslační modifikace a jejich význam C2138 Pokročilá bioinformatika, jaro 2022 Lenka Malinovská Proteom a proteomika • Proteom – soubor všech forem proteinů existujících v buňce (organismu, biologickém vzorku) v určitém čase a za určitých podmínek. • Proteomika – studium proteomů. • Proteomika – věda zabývající se komplexní analýzou proteinů (identifikace, exprese, charakterizace). • Proteomika – analýza proteinů ve velkém rozsahu (struktura, funkce, interakce). • Proteomika – vyžaduje separační techniky, hmotnostní spektrometrii, bioinformatiku, databáze genů a proteinů. • Proteom – soubor všech forem proteinů existujících v buňce (organismu, biologickém vzorku) v určitém čase a za určitých podmínek. Množství kovalentních forem proteinů přesahuje množství proteinů predikovaných z DNA (genom). Proteomy jsou složitější než genomy. 1 genom – mnoho proteomů. • 1 gen může být exprimován ve více než 20 různých variantách proteinu. Například α1-antitrypsin se může vyskytovat ve 22 různých formách. • 25 000 genů – 0,5 - 1 milion proteinů. Proteom a proteomika • Proteom – soubor všech forem proteinů existujících v buňce (organismu, biologickém vzorku) v určitém čase a za určitých podmínek. Množství kovalentních forem proteinů přesahuje množství proteinů predikovaných z DNA (genom). Proteomy jsou složitější než genomy. 1 genom – mnoho proteomů. • Navýšení kódovací kapacity genomu: alternativní sestřih, posttranslační modifikace (PTM). Proteom a proteomika Posttranslační modifikace • Posttranslační modifikace – kovalentní modifikace proteinů po transkripci DNA a translaci RNA. Posttranslační modifikace – probíhají i u prokaryot Posttranslační modifikace jsou prováděny enzymy. Enzymy rozeznávají specifické signály – aminokyselinové sekvence v proteinech. Identifikace těchto sekvenčních motivů umožňuje predikci PTM. Člověk: 500 proteinkinas, 150 proteinfosfatas, 500 proteas. 5 % genomu vyšších eukaryot – zapojení do PTM. • Klasifikace posttranslačních modifikací – typ modifikované aminokyseliny, podle modifikujícího enzymu, reverzibilita modifikací. Posttranslační modifikace - typy DOI: 10.1002/anie.200501023 Posttranslační modifikace - význam • Ovlivňují 3D a 4D strukturu proteinů, aktivitu a funkci (rozpustnost, stabilita, interakce, vypnuto/zapnuto). • Mohou ovlivňovat lokalizaci proteinu v buňce (prenylace a jiné – připojení hydrofobní skupiny umožňuje lokalizaci do membrány). • Tvorba disulfidických můstků může být nezbytná pro správné sbalení proteinů. • Význam pro imunitní systém – glykosylace. Posttranslační modifikace - příklady • Kovalentní připojení malé molekuly (funkční skupiny): • Fosforylace (serin, threonin, tyrosin, histidin, arginin, lysin), aktivace/inhibice enzymů. Nejstudovanější PTM. • Glykosylace (N-glykosylace, O-glykosylace, GPI kotva, C-mannosylace). • S-nitrosylace (cystein). Neenzymatické připojení NO. Vazba je labilní, náročná experimentální identifikace! • Kovalentní připojení acylových řetězců: • Kovalentní připojení malých proteinů: • Ubikvitinace (lysin). Regulace odbourávání proteinů, regulace funkce proteinů. Met-Gly-X-X-X- Ser/Thr Posttranslační modifikace - příklady • Kovalentní připojení malé molekuly (funkční skupiny): • Fosforylace (serin, threonin, tyrosin, histidin, arginin, lysin), aktivace/inhibice enzymů. Nejstudovanější PTM. https://info.gbiosciences.com/blog/protein-phosphorylation-natures-favorite-way-of-decorating-proteins • Ovlivňují 3D a 4D strukturu proteinů, aktivitu a funkci (rozpustnost, stabilita, interakce, vypnuto/zapnuto). Posttranslační modifikace - význam DOI 10.1007/s10545-015-9851-7 Posttranslační modifikace - význam DOI 10.1007/s10545-015-9851-7 Posttranslační modifikace - význam https://omim.org OMIM databáze – geny a geneticky podmíněné choroby Posttranslační modifikace - význam https://omim.org Posttranslační modifikace a proteomika • Proteomika – vyžaduje separační techniky, hmotnostní spektrometrii, bioinformatiku, databáze genů a proteinů. • Proteomika – diagnostika (markery), „drug targets“, zkoumání vlivu léčiv na organismus. Podmíněno schopností identifikovat, charakterizovat a kvantifikovat výskyt jednotlivých proteinů v komplexním vzorku. Bioinformatics‐From Genomes to Therapies. Editors(s):Prof. Dr. Thomas Lengauer Posttranslační modifikace Experimentální identifikace • Problémy při identifikaci posttranslačních modifikací: modifikovaná je jen frakce proteinu (nízká koncentrace, nutné citlivé metody), kovalentní vazba PTM je labilní – nemusí vydržet zpracování vzorku a analýzu. • Identifikace a analýza PTM: kombinace separační metody a MS analýzy. 2-DE, 2D-PAGE Dvourozměrná gelová elektroforéza Izoelektrická fokusace Rozdělení podle pI SDS-PAGE Rozdělenípodlemolekulovéhmotnosti Hmotnostní spektrometrie Posttranslační modifikace Experimentální identifikace • Problémy při identifikaci posttranslačních modifikací: modifikovaná je jen frakce proteinu (nízká koncentrace, nutné citlivé metody), kovalentní vazba PTM je labilní – nemusí vydržet zpracování vzorku a analýzu. • Identifikace a analýza PTM: kombinace LC a MS analýzy. Posttranslační modifikace Predikce • Posttranslační modifikace jsou prováděny enzymy. Enzymy rozeznávají specifické signály – aminokyselinové sekvence v proteinech. Identifikace těchto sekvenčních motivů umožňuje predikci PTM. • Problémy predikce: • Může být těžké vytvořit „průměrný“ sekvenční motiv vhodný pro predikci. • Proteiny jsou modifikovány různými enzymy s různou specifitou. • Vliv okolních aminokyselin – ovlivnění náboje, hydrofility části proteinu v kontaktu s enzymem. • Vliv 3D/4D struktury. https://services.healthtech.dtu.dk/ DTU - Technical University of Denmark Expert Protein Analysis System http://www.expasy.org https://services.healthtech.dtu.dk/ DTU - Technical University of Denmark Posttranslační modifikace Experimentální identifikace Predikce Experimentální identifikace/ ověření PTM. Databáze PTM. Databáze modifikovaných proteinů. Predikce PTM na základě homologie. Predikce na základě sekvenčních motivů. Predikce PTM Vyhodnocování experimentálních dat Posttranslační modifikace - databáze https://pir.georgetown.edu/resid/ Posttranslační modifikace - databáze https://www.phosphosite.org/homeAction Posttranslační modifikace - databáze https://www.phosphosite.org/homeAction Posttranslační modifikace - databáze https://awi.cuhk.edu.cn/dbPTM/index.php https://awi.cuhk.edu.cn/dbPTM/index.php Posttranslační modifikace – „crosstalk“ Pozitivní Negativní • Pozitivní – první PTM slouží jako signál pro připojení (odstranění) jiné PTM. • Negativní – přímá kompetice dvou PTM o stejnou aminokyselinu, případně první PTM „maskuje“ místo pro druhou PTM a zabrání jejímu připojení/odstranění. Hart et al. - “yin-yang hypothesis” O-fosforylace/O-glykosylace (O-GlcNAc) Kompetice o Ser/Thr. • Pozitivní – první PTM slouží jako signál pro připojení (odstranění) jiné PTM. • Negativní – přímá kompetice dvou PTM o stejnou aminokyselinu, případně první PTM „maskuje“ místo pro druhou PTM a zabrání jejímu připojení/odstranění. Posttranslační modifikace – „crosstalk“ • „Crosstalks“ – vyšší úroveň regulace aktivity proteinů, prevence „chybných“ aktivací/inaktivací. Složitější regulace při zachování stejného množství PTM – různé kombinace, různé efekty, případně různé úrovně odezvy. • Různé proteiny s různou funkcí – nohou podléhat stejným „crosstalk“ mechanismům. • Histon H3 a protein p53 – specifická methylace konkrétního lysinu vyvolá acetylaci druhého lysinu, ve vzdálenosti deset aminokyselin od prvního. • Existuje obecný „PTM kód“ sloužící k lepší regulaci aktivity proteinů??? Posttranslační modifikace – „crosstalk“ http://ptmcode.embl.de/ A: Dvě modifikovaná rezidua jsou evolučně konzervovaná. B: Dvě modifikovaná rezidua jsou blíž, než je pro PTM typické. C: Dvě PTM probíhají ve stejném místě. D: Manuální anotace (publikace). Známé experimentální „crosstalks“. E: „Hotspots“ – oblasti proteinu s vysokým výskytem modifikací. Posttranslační modifikace - vizualizace Posttranslační modifikace - vizualizace PyTMs https://pymolwiki.org/index.php/Pytms Posttranslační modifikace - vizualizace Použitá a doporučená literatura Bioinformatics‐From Genomes to Therapies. Editors(s):Prof. Dr. Thomas Lengauer. Jin Xiong. Essential Bioinformatics. Essentials of Glycobiology, 2nd edition Chapter42 Genetic Disorders of Glycosylation