V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
A. AMINOKYSELINY, PEPTIDY A BÍLKOVINY
Chování disociabilních skupin podstatně ovlivňuje vlastnosti aminokyselin a bílkovin: pKai pKa2 R-CH-COOH    o      R-CH-COO- o R-CH-COO
	NH3+		NH3+	NH2
Tabulka I. Disociační konstanty aminokyselin				
	pKal	pKa2	pKa boční řetězec protonovaný	-> deprotonovaný
Ala	2,3	9,9		
Gly	2,4	9,8		
Phe	1,8	9,1		
Ser	2,1	9,2		
Val	2,3	9,6		
Asp	2,0	10,0	3,9 -COOH	-> -coo-
Glu	2,2	9,7	4,3 -COOH	-> -coo-
His	1,8	9,2	6,0 -imidazolium+	-> -imidazol
Cys	1,8	10,8	8,3 -SH	-> -s-
Tyr	2,2	9,1	10,9-fenyl-OH	-> -fenyl-O"
Lys	2,2	9,2	10,8-NH3+	-> -NH2
Arg	1,8	9,0	12,5-guanidinium+	->-guanidin
As n	2,0	8,8		
Gin	2,2	9,1		
Trp	2,4	9,4		
Leu	2,4	9,6		
lle	2,3	9,6		
Met	2,3	9,2		
Thr	2,2	9,1		
Pro	2,0	10,6		
IZOELEKTRICKÝ BOD (pl) AMINOKYSELIN
-odpovídá hodnotě pH, při které je aminokyselina elektroneutrální
Výpočet pl
Obecně: pl = 1/2 (pKai + pK92)
pl je aritmetickým průměrem pKa kyselé a bazické skupiny
Bazické aminokyseliny: pl = 1/2 (pK92 + pK93)
pl bazické aminokyseliny je průměrem pKa obou bazických skupin
Kyselé aminokyseliny: pl = 1/2 (pKai + pK93)
pl kyselé aminokyseliny je průměrem pKa obou kyselých skupin)
Velmi slabě kyselé AK (Tyr, Cys) pl = -1/2 log(Kai.Ka2+Kai.Ka3)
Při výpočtu pl pro Tyr, Cys je třeba zohlednit příspěvky všech disociabilních skupin
i
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
PEPTIDY
Peptidy a bílkoviny zapisujeme zleva od N-konce k C-konci.
Disociace peptidů s více disociabilními skupinami:
—l
COOH NHa+ A2+
J— COOH
COO- NHa-* A"
]—COO-
K,
H-?N-
COO- NH2
1— COO-
4H^
ir
COOH NHa4 A+
K,
]—COO-
COO- NHa4 A„
]—COO-
Výpočet pl peptidů a bílkovin:
internetové algoritmy např. na http://www.expasv.org -> pl/MW tool -zde také další nástroje pro analýzu primární struktury bílkovin
2
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
BÍLKOVINY
Primární struktura bílkovin a její studium
Enzymy a činidla štěpící peptidové vazby:
Enzym/činidlo	Místo hydrolýzy
Trypsin	Lys, Arg (C strana) pokud nenásleduje Pro
Chymotrypsin	Phe, Trp, Tyr (C strana)
Bromkyan	Met (C strana)
Aminopeptidáza	odštěpení N-teminální aminokyseliny
Karboxypeptidáza	odštěpení C-terminální aminokyseliny
Další reagens:
LiBhU - redukce -COOH -> -CH2OH
ninhydrin - reakce s -NH2 -> fialové zbarvení (důkaz bílkovin), s Pro žluté zbarvení
močovina - chaotropní činidlo SDS - detergent
merkaptoethanol, dithiothreitol- redukční činidla (viz obrázek)
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
Sangerova reakce
Sangerovo činidlo (2,4-DNFB)
Edmanovo odbourávání
Fenylisothiokyanat
Hmotnostní spektrometrie
-rutinní identifikace a kvantifikace proteinů na základě sekvenace (fragmentace) peptidů
vzniklých štěpením trypsinem ("bottom-up" proteomika)
-sekvenace intaktních proteinů ("top-down" proteomika, technická omezení)
4
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
Sekundární struktura bílkovin
Sekundární struktura bílkovin je důsledkem její primární struktury. Sekundární strukturu bílkoviny proto lze předpovědět ze znalosti primární struktury např. pomocí počítačového modelování.
K základním typům sekudární struktury bílkovin patří: helikální struktury: a-helix, další helixy,... p-struktury: skládaný list (paralelní x antiparalelní),... reverzní smyčka (p-otočka),...
Relativní pravděpodobnost, že se daná aminokyselina vyskytne v a-šroubovici, skládaném listu nebo v reverzní smyčce je udána v následujícím grafu:
a helix
(1 sheet
flbervd
Terciární struktura bílkovin
-fibrilární a globulární proteiny -studium: rentgenová strukturní analýza
Kvarterní struktura bílkovin
-funkční enzym je tvořen více polypeptidovými podjednotkami
Stabilita proteinů
-elektrostatické síly -vodíkové můstky -hydrofobní interakce -disulfidové vazby
5
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
ÚLOHY
1. Napište vzorce aminokyselin
a) majících aromatické jádro
b) obsahujících síru
c) majících při pH 7 celkový kladný náboj
d) majících při pH 7 celkový záporný náboj
e) majících alifatický řetězec
f) která aminokyselina nemá žádný asymetrický uhlíkový atom a která má dva asymetrické atomy?
2. Zakreslete titrační křivku a popište inflexní bod
a) slabé kyseliny (kys. octové)
b) aminokyseliny (glycinu)
3. Vypočítejte procentuální obsah disociované formy karboxylové skupiny a NH3+ skupiny glycinu při pH: 3,0 a 11,0.
(pKai=2,4, pKa2=9,0)
4. Peptidová vazba mezi glycinem a threoninem může vzniknout dvěma způsoby. Napište vzorce obou variant. Analýzou bylo zjištěno, že izoelektrický bod jednoho z peptidů je při pH 6,38. O který peptid se jedná? Disociační konstanty glycinu:
pKai=2,34, pKa2= 9,60 Disociační konstanty threoninu:
pKai= 2,63, pKa2= 10,43 (Při výpočtu zanedbáme fakt, že disociační konstanty koncových skupin dipeptidu se mohou po kondenzaci změnit)
5. Odhadněte celkový náboj peptidu při pH 5 a při pH 9.
Arg-His-Gly-Phe-Gly-Glu-Lys-Tyr-Cys-Ala Hodnoty pKa koncových disociabilních skupin jsou: pKai=3,6, pKa2=7,9
6. Jakého pH je nutno použít, aby se každý z peptidů pohyboval při elektroforéze na opačnou stranu. A. Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Gly
B. Val-Cys-Phe-Glu-Ala-Lys-Leu-GIn-Gly Hodnoty pKa koncových disociabilních skupin jsou: pKai=3,6, pKa2=7,9
7. Následující směs aminokyselin byla podrobena elekroforéze. Rozdělte aminokyseliny podle směru migrace při pH 3 a při pH 7:
Gly, Ala, Glu, Lys, Arg, Ser, Asp, Asn
6
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
8. Směs aminokyselin byla nasazena na katex v 0,1 mol.ľ1 HCI. Napište, které aminokyseliny se pravděpodobně zachytí a které z kolony vytečou.
Poté byla kolona promývána pufrem o pH 6. Které aminokyseliny se uvolní a které zůstanou vázány: Gly, Ala, Glu, Lys, Arg, Ser
9. Směs aminokyselin byla nasazena na anex při pH=11
Arg, Ala, Glu, Tyr, Ser
a) Jaký bude celkový náboj každé z aminokyselin? Které aminokyseliny se zachytí na koloně a které vytečou?
b) Poté byl na kolonu nasazen pufr o pH=8. Jaký bude celkový náboj každé aminokyseliny a které aminokyseliny z kolony vytečou?
10. Směs aminokyselin byla nasazena na katex v 0,1 M HCI. Vypočítejte izolelektrický bod každé z aminokyselin.
Napište pořadí, v jakém se budou tyto látky z kolony eluovat při postupném zvyšováni pH:
Glu, Ala, His, Lys, Tyr
11. Směs aminokyselin byla nasazena na anex při pH 10. Které aminokyseliny se nezachytí a které zůstanou vázány: Cys, Glu, Ser, Ala, Lys, His
12. Jaké musí být pH pufru, aby bylo možno od sebe oddělit tyto dva peptidy:
a) na sloupci katexu:      NH2-Ala-Glu-Gly-Tyr-Lys-COOH (I)
NH2-Gly-Asp-His-Tyr-Lys-COOH (II)
b) na sloupci anexu:      NH2-Ser-Tyr-Met-Glu-His-Phe-Arg-Gly-COOH (III)
NH2-Val-Cys-Phe-Glu-Ala-Lys-Leu-Gln-Gly-COOH (IV) Jaký bude náboj každého peptidu při tomto pH? Popište, zda se peptid zachytí na koloně nebo vyteče.
13. Směs aminokyselin byla nasazena na katex při pH 1,0. Eluce byla provedena gradientem rostoucího pH. Odhadněte pořadí eluce aminokyselin: Gly, Asp, Tyr, Ala, His, Arg
14. Tetrapeptid byl zpracován 2,4-DNFB a hydrolyzován. Značenou aminokyselinou byl 2,4-DNFB-valin a lysin. Hydrolýza trypsinem dala dva štěpy, z nichž první obsahoval aminokyselinu, která po redukci LÍBH4 dává CH2(NH2)CH2OH a navíc obsahuje aminokyselinu, která se ninhydrinem barví žlutě. Určete sekvenci tohoto peptidu.
15. Napište, jak byste stanovili sekvenci následujícího peptidu pomocí selektivní hydrolýzy trypsinem a 2,4-dinitrifluorbenzenu.
NH2-Ala-Lys-Glu-Gly-COOH Při dělení meziproduktu hydrolýzy trypsinem použijte metodu iontoměničové chromatografie, popište její podmínky.
7
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
16. Určete primární strukturu peptidu P na základě následujících reakcí:
a) redukce p-merkaptoethanolem pokytne dva peptidy B a C
b) Po působení DNFB na peptid P a kyselé hydrolýze v přítomnosti p-merkaptoethanolu získáme následující aminokyseliny: DNP-Asp, DNP-Leu, 2 Lys, 2 Cys, 1 Gly, 1 Glu, 1 Met, 1 Pne, 1 Ala
c) peptid B je podroben působení chymotrypsinu , získáme Ala, hydrolýza trypsinem dává 2 tripeptidy. Sangerova metoda aplikovaná na tyto 2 tripeptidy prokázala přítomnost DNP-Leu, DNP-Cys
d) působením bromkyanu na peptid C získáme Glu, trypsinolýza dává jeden dipeptid a jeden tripeptid: Sangerova metoda aplikovaná na tento tripeptid prokázala přítomnost DNP-Asp
Jaká je struktura, B, C a P?
17. Složení heptapeptidu P je následující: Glu, Ala, Lys, Arg, Cys, Met, Tyr
a) aminopeptidáza a karboxypeptidáza nemají žádný účinek
b) po působení chymotrypsinu vzniká jeden hexapeptid, který po Sangerově reakci dává DNP-Cys
c) po působení trypsinu vznikají dva peptidy: Jeden tripeptid, který po Sangerově reakci a hydrolýze dává DNP-Glu a DNP-Lys a dále jeden tetrapeptid, který působením aminopeptidázy uvolní nejdříve Met a potom Tyr
Určete sekvenci peptidu P
18. Polypeptid byl redukován p-merkaptoethanolem a výsledkem reakce byly dva peptidy o následující sekvenci: Asn-Cys-Phe-Thr-Lys-Lys-Trp-Cys-Arg-Ala-Val-Cys Cys-Thr-Pro-Tyr-Cys-Phe-Pro-Cys
Nativní peptid byl hydrolyzován thermolysinem: Za experimentálních podmínek hydrolyzuje tento enzym peptidové vazby v místě aminoskupiny následujících aminokyselin: Leu, Phe, Trp, Tyr, Val. Byly získány 4 peptidy o tomto složení:
A) Asn, 2 Cys, Val
B) 2 Lys, Phe, Thr
C) Arg, Ala, Trp, Tyr, 2 Cys
D) 2 Cys, Thr, 2 Pro, Phe
Udejte polohu disulfidických můstků nativního peptidu.
8
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
19. Po tryptické hydrolýze určitého proteinu byl izolován oligopeptid P o následujícím složení:
1 Lys, 1 Asp(n), 1 Thr, 1 Glu(n), 1 Val, 1 Ne, 1 Phe, 1 Leu
Sumární náboj peptidu P při pH 6,5 je negativní. Po reakci peptidu s DNFB byl získán DNP-Thr. Karboxypeptidáza uvolňuje postupně tyto aminokyseliny: Lys, Leu, Ne, Val. Jestliže je peptid P hydrolyzován chymotryspinem, byl získán oligopeptid o následujícím složení: 1 Asp, 1 Val, 1 Leu, 1 Ne, 1 Lys Udejte sekvenci P.
20. Primární struktura bílkoviny, jenž obsahuje prolin a úseky, ve kterých následuje několik aminokyselin se stejným nábojem, znemožňuje tvorbu a-šroubovice. Odhadněte, které úseky následující bílkoviny by mohly mít sekundární strukturu a-šroubovice:
- Leu-Ala-His-Thr-Tyr-Gly-Pro-Phe-Glu-Ala-Ala-Met-Cys-His-
-Glu-Glu-Asp-Pro-Asp-Gly-Met-Gly-Cys-Ala-Phe-His-Jak by vypadala situace v případě poklesu pH pod oblast disociační konstanty karboxylových skupin?
21. Určitý peptid je silným inhibitorem vedení nervového vzruchu. Analýza prokázala následující aminokyselinové složení: 5 Ala, Lys, Phe. Reakce intaktního peptidu s 2,4-DNFB prokázala po hydrolýze přítomnost DNF-alaninu. Štěpení pomocí trypsinu dalo tripeptid o (Lys, 2 Ala) a tetrapeptid (3 Ala, Phe). Štěpení pomocí chymotrypsinu poskytlo hexapeptid a volný fenylalanin. Napište sekvenci tohoto peptidu.
22. Určitý protein o sekvenci Met-Ala-(Leu-Phe-Ala)3-(Leu-Met-Phe)3-Pro-Ans-Gly-Met-Leu-Phe je zakotven svým NH2 koncem v hydrofobním sektoru cytoplasmatické membrány. Pokuste se předpovědět jeho sekundární strukturu. Po mutaci byly všechny Leu zbytky nahrazeny Asp. Může to způsobit změnu sekundární struktury?
23. Při denaturaci bílkovin dojde vždy
a) ke změně primární struktury
b) " sekundární struktury
c) " terciární struktury
d) " kvartem í struktury
e) " molekulové hmotnosti
24. Jaká je délka bílkovinného řetězce obsahujícího 153 aminokyselin,
a) pokud byl byl zcela ve formě a-šroubovice a zcela ve formě p-skládaného listu
b) celková délka molekuly určité bílkoviny (153 aminokyselin) obsahující pouze a-šroubovici a p-skládaný list je 4,2 .10~6 cm. Vypočítejte, jaká frakce molekuly obsahuje a-šroubovici.
9
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
25. Jeden vlas roste průměrnou rychlostí 20 cm za rok. Vlas je tvořen a-keratinem složeným z a-šroubovice. Vypočítejte rychlost syntézy peptidových vazeb za jednu vteřinu.
26. Buňka E. coli obsahuje 25 000 ribosomů. Pokud by strukturální proteiny ze všech těchto ribosomů byly nataženy do maximální délky (p-šroubovice), kolikrát by mohly ovinout buňku E. coli. Předpokládejte průměr ribosomů 18 nm o specifické hmotnosti 1, obsahující 40% hmotnosti strukturálních proteinů. Průměrná molekulová hmotnost aminokyseliny je 120. Buňka E. coli je sférická o průměru 1 |j,m.
27. Vypočítejte specifickou hmotnost molekuly tropokolagenu, kterou lze považovat za válec o délce 0,28 |j,m a o průměru 1,4 nm. Obsahuje 3 polypeptidické řetězce se 1000 aminokyselinovými zbytky. Průměrná molekulová hmotnost 1 aminokyseliny je 120.
28. Následující látky jsou velmi často používány při studiu bílkovin :
1/ BrCN (bromkyan)
21 močovina
3/ merkaptoethanol
4/ karboxypeptidáza
5/ 6 M HCI
6/ ninhydrin
II 2,4-dinitrofluorbenzen
a) Která z nich se používá označení N-konce bílkoviny?
b) Která by byla použita pro štěpení peptidické vazby na C-straně methioninu?
c) Která by byla použita pro štěpení intermolekulárních nebo intramolekulárních disulfidických můstků?
d) Která látka se používá pro potlačení vodíkových vazeb?
10
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
B. SACHARIDY
struktura a chem.vlastnosti nejdůležitějších sacharidů - viz prezentace ÚLOHY
1. Nejjednodušší ketosa je a) trehalosa    b) fruktosa
c) erythrulosa   d) dihydroxyaceton
2. Ketosy mají hemiacetalový hydroxyl na uhlíku č.
a) 1    b) 2   c) 3   d) 6
3. Mutarotace je důsledkem přeměny
a) aldosy na ketosu nebo naopak
b) hexosy na pentosu "
c) formy D- na L-
d) formy a- na p-
4. Napište vzorce následujících disacharidů:
a) 4-O-a-D-glukopyranosyl-a-D-glukopyranosa
b) 4-O-p-D-galaktopyranosyl-a-D-glukospyranosa
c) a-D-mannopyranosyl-a-D-glukopyranosid
d) 4-O-p-D-mannopyranosyl-a-D-galaktopyranosa
e) p-D-galaktopyranosyl-p-D-glukopyranosid
5. Která OH skupina glukosy je nejreaktivnější?
Napište vzorec reakčního produktu D-glukosy s methanolem v kyselém prostředí. Napište vzorec produktu reakce galaktosy se silnými alkylačními činidly (CH3I, dimethylsulfát). Tento produkt byl dále podroben mírné kyselé hydrolýze. Napište vzorec výsledné látky.
6. Napište vzorec produktu redukce D-glukosy amalgámem sodíku. Napište vzorec produktu oxidace D-mannosy slabými oxidačními činidly (NalO) a silnými oxidačními činidly (HNO3).
7. Laktosa byla methylována pomocí dimethylsulfátu a poté hydrolyzována zředěnou HCI. Napište vzorce produktů.
8. Kyselá hydrolýza trisacharidu dává D-glukopyranosu a D-galaktopyranosu v poměru koncentrací 2:1. Úplná methylace trisacharidu a následná hydrolýza dává tyto produkty:
2,3,6-tri-O-methyl-D-galaktopyranosa 2,3,4,6-tetra-O-methyl-D-glukopyranosa 2,3,4-tri-O-methyl-D-glukopyranosa Napište vzorec trisacharidu (jsou možné dvě varianty).
11
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
9. 3-0-a-D-mannopyranosyl-a-D-glukopyranosa byla methylována pomocí dimethylsulfátu a pak hydrolyzována zředěnou HCI. Napište vzorce výsledných produktů.
10. 6-O-a-D-galaktopyranosyl-a-D-glukopyranosa byla methylována pomocí dimethylsulfátu a pak hydrolyzována zředěnou HCI. Napište vzorce výsledných produktů.
11. Po methylaci disacharidu dimethylsulfátem a jeho hydrolýze zředěnou HCI byly získány následující sacharidy:
2,3,4,6-tetra-O-methylgalaktopyranosa 2,3-di-O-methylribofuranosa Napište vzorec tohoto disacharidu
12. Při úplné metylaci disacharidu a hydrolýze ve zředěné HCI byly získány následující produkty:
a) 1,3,6-tri-O-metyl-a-D-fruktofuranosa 2,3,4,6-tetra-O-metyl-a-D-galaktopyranosa Napište vzorec tohoto disacharidu.
b) kys. 2,3,4-tri-O-methylmannuronová 2,3,4,6-tetra-O-methyl-a-D-glukopyranosa
Napište vzorec tohoto disacharidu. (Předpokládejte, že eventuální methylester kyseliny se při hydrolýze v HCI zcela hydrolyzoval)
13. Napište vzorec: 3-O-p -D-mannopyranosyl-p-D-fruktofuranosy. Tento disacharid byl metylován pomocí metyljodidu a hydrolyzován v slabé HCI. Napište vzorec produktu.
12
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
C. LIPIDY
Nejdůležitější přirozené mastné kyseliny:
o
OH
kys. stearová
O
kys. arachidonová (20:4) A°'0''
13
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
FOSFOLIPIDY
R,
o
o
o
\
oh"/pí:o o
s
R
R,
když R = H
kys. fosfatidová
když R =
/
CH,
CHQ
NH„
ethanolamin
/
H„C
H2C CH^N+'CH3
CH,
cholin
H,C,
HC I
NH„
O
X
OH
serin
y—oh
OHi/
OH glycerol
OH OH
OH,
OH
H
vOH
H H/
H OH myoinositol
ÚLOHY
1. Všechny lipidy jsou po chemické stránce
a) amidy b) estery c) étery d) acetaly
2. Tekutost lipidů je úměrná obsahu
a) vody   b) volného glycerolu
c) nasycených mastných kyselin
d) nenasycených mastných kyselin
3. Napište vzorce těchto mastných kyselin:
kys. olejová (18:1)Ä9, kys. linolová (18:2)Ä9<12
kys. palmitolejová (16:1)Ä9, kys. linolenová (18:3)Ä9<1215
14
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
4. Napište vzorce těchto fosfolipidů:
a) kys. dipalmitoylfosfatidová
b) 1 -palmitoyl-2-oleylfosfatidylcholin
c) dipalmitoylfosfatidylethanolamin
d) 1 -stearoyl-2-palmitoylfosfatidylglycerol
e) dioleylfosfatidylserin
f) 1 -stearoyl-2-linoloylfosfatidylserin [kys. linolová: (18:2)A9<12]
g) 1 -palmitoyl-2-oleylfosfatidylglycerol [kys. olejová (18:1 )A9]
Jaký bude celkový náboj fosfolipidů při pH 7,5? Hodnoty pKa:
1x substituovaný fosfát pKai= 6,8, pKa2=12,3 2x substituovaný fosfát pKai = 6,8 serin: pKai=2,1, pKa2=9,2
5. Napište vzorec cholesterolu a očíslujte jej.
6. Fosfolipidy jsou důležitými složkami biomembrán, kterým udělují kladné nebo záporné náboje. Jaký bude celkový náboj jednotlivých fosfolipidů a)-c) v úloze 4, bude -li pH prostředí 5 a 8. (pKa fosfátové skupiny je v oblasti 6-7).
7. Vaječný lecithin je heterogenní směs diacylfosfatidylcholinů, z nichž 70% má v poloze
1 kys. palmitovou a 61% v poloze 2 kys. olejovou. Tento lecithin je dostupným zdrojem při syntéze definovaných fosfolipidů. Navrhněte metody syntézy:
a) dipalmitoylfosfatidylcholinu
b) 1 -palmitoyl-2-stearoylfosfatidylcholinu
c) distearoylfosfatidylethanolaminu
Použijte těchto údajů:
1. Selektivního odštěpení acylu v poloze 1 lze dosáhnout fosfolipázou Ai, v poloze 2 fosfolipázou A2.
2. Chemicky lze obě mastné kyseliny odštěpit mírnou alkalickou hydrolýzou za katalýzy tetrabutylamonium hydroxidem.
3. Acylace glycerolu se provádí příslušnými acylchloridy.
4. Hydrolýzu vazby mezi fosfátem a bazí katalyzuje fosfolipasa D. Rovnovážná konstanta této reakce je rovna 1.
15
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
D. TERMODYNAMIKA ENZYMOVÝCH REAKCÍ
Standardní stav v biochemii: . t=25°C .   p=0,101 MPa
• pH=7 (koncentrace [H+] a iontové stavy disociabilních látek)
• jednotkové koncentrace látek
• koncentrace H2O zahrnuta do hodnoty rovnovážné konstanty Základní vztahy
E
aA + bB o  cC + dD
AG' = AG0' + RT In--------
_[A]a[B]b
povaha aktuální reakce podmínky (rovnováha)
V rovnovážném stavu platí AG'=0, proto
AG°' = -RT In K',
AG<0 ... exergonická reakce, samovolně probíhá v daném směru AG=0 ... reakce v rovnováze
AG>0 ... endergonická reakce, samovolně probíhá v opačném směru
Hodnoty AG°' hydrolýzy důležitých makroergických vazeb
			AG°' [kJ.moľ1]
fosfoenolpyruvát	<=>	pyruvát	-61,8
karbamoylfosfát	<=>	karbamát	-51,4
acetylfosfát	<=>	k. octová	-43,0
kreatinfosfát	<=>	kreatin	-43,0
difosfát	<=>	fosfát	-33,4
acetylCoA	<=>	acetát	-31,3
ATP	<=>	ADP	-30,5
ADP	<=>	AMP	-30,5
glu kosa-1-fosfát	<=>	glukosa	-20,9
glukosa-6-fosfát	<=> glukosa		-12,5
(glycerol-3- fosfát	<=>	glycerol	-8,4)
16
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
Struktury některých makroergických sloučenin
o.
• OH O
CH2  ^»^P — OH
O \
OH
Fosfoenolpyruvát
o o
Karbamoylfosfát
Acetylfosfát
O
OH I
OH-P —O-P-OH I II OH O
Difosfát
OH
CH,
OH
H
f) H
O H K
O
O-P-OH
H       OH OH
Glukosa-1-fosfát
OH
ú NH •P-NH—Y
OH
N
/
CH,
Kreatinfosfát
OH
O
OH CH,
H
OH
'" H
OH
O
O H K
OH
H OH
Glukosa-6-fosfát
CH,
Acetyl-KoA
o-prOH
OH
Glycerolfosfát
Spŕažené reakce
Podle zákona zachování energie nezávisí energetická bilance změny systému na cestě, kterou tato změna nastala. Aditivita změn volné energie umožňuje, aby endergonické reakce byly za jistých podmínek poháněny reakcemi exergonickými.
17
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
ÚLOHY
1. Vypočítejte AG°' reakce přeměny dihydroxyacetonfosfátu na glyceraldehydfosfát, je-li K'eq= 0,0475 při 25°C. Vypočítejte AG' reakce, je-li koncentrace dihydroxyacetonfosfátu 2.104mol.ľ1 a glyceraldehydfosfátu 3.106 mol.ľ1.
2. Vypočítejte AG' hydrolýzy ATP na ADP a Pí, jsou-li koncentrace ADP a ATP ekvimolárnía koncentrace fosfátu při 25 °C: a) 1 mol.ľ1, b) 0,001 mol.ľ1.
c) Jaká je AG' hydrolýzy za aktuálních podmínek hydrolýzy ve svalu, kde je koncentrace [ATP] - 5 mmol.ľ1, [ADP] - 0,5 mmol.ľ1, [Pí]- 1 mmol.ľ1 při 25°C.
3. Vypočítejte AG' hydrolýzy difosfátu na fosfát, je-li aktuální koncentrace difosfátu 1 mmol.ľ1, koncentrace fosfátu 150 mmol.ľ1. AG°' reakce je -33,4 kJ.moľ1, teplota 25°C. Vypočítejte rovnovážnou konstantu reakce.
4. Jaká musí být koncentrace malátu, aby reakce:
malát <=> fumarát + H2O byla v rovnováze, je-li koncentrace fumarátu 1 mmol.ľ1, AG°' reakce je +3,1 kJ.moľ1, t= 25°C?
5. Vypočítejte AG°' a Keq reakce při 25°C:
ATP + CH3COCOOH o ADP + CH2C(OP)-COOH Jaký je rovnovážný poměr koncentrací [pyr]/[PEP], je-li poměr [ATP]/[ADP]=10?
6. Tvorba acetyl-CoA probíhá v přítomnosti ATP:
CH3COOH + ATP + HS-CoA o CH3CO-C0A + AMP + PPi (PPijedifosfát).
Vypočítejte AG°' reakce (předpokládejte, že AG°' hydrolýzy ATP-<=> AMP + PPi je stejné jako při vzniku ADP a Pi; PPi je hydrolyzován pyrofosfatázou). Vypočítejte celkové AG°' reakce při 25°C. Jaký je vliv hydrolýzy difosfátu?
7. Vypočítejte AG°' izomerace:
glukosa-6-fosfát <=> glukosa-1 - fosfát Jaký je rovnovážný poměr koncentrace obou látek při 25°C. Jaké je AG' reakce, je-li koncentrace glukosa-6-fosfátu 10 mmol.ľ1 a koncentrace glukosa-1-fosfátu 2 mmol.ľ1?
8. Kreatinfosfát je hlavní zásobní látkou svalu. Jaké je AG°' reakce:
ATP + kreatin <=> ADP + kreatinfosfát Jaký je rovnovážný poměr kreatin- fosfát /kreatin při 25°C, jsou-li koncentrace ADP a ATP ekvimolární?
18
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
9. Koncentrace glukosy v buňce je 1 mmol.ľ1, koncentrace glukosa-1-fosfátu 0,05 mmol.ľ1.
Jaký musí být poměr koncentrací ATP/ADP, aby reakce:
ATP + glukosa <=> glukosa-1-fosfát + ADP byla při 25°C v rovnováze?
10. Vypočítejte AG°' reakce při 25°C: sacharosa + Pi <=> glukosa-1- fosfát + fruktosa
K dispozici máte tyto údaje:
1/sacharosa   <=> glukosa + fruktosa       K'eq= 1,35.105
21 glukosa-1 - fosfát o glukosa + Pí AG°' = -20,9 kJ.moľ1
Jaká bude volná energie reakce AG' za aktuálních podmínek:
Koncentrace [Pi]=1 mmol.ľ1, [sacharosa]=0,5 mmol.ľ1, [glukosa-1-fosfát]=[fruktosa]=
=4 mmol.ľ1.
Je možno glykosidovou vazbu sacharosy počítat mezi makroergickou vazbu, pokud mezi makroergické vazby počítáme vazby se standardní volnou energií hydrolýzy nižší než -10 kJ.moľ1?
11. Vypočítejte AG°' tvorby aktivované glukosy při 25°C:
glukosa-1 -P + ATP o ADP-glukosa + PPi K dispozici máte tyto údaje:
1 / ADP-glukosa o glukosa + ADP       K'eq= 722 21 ATP o ADP + Pi AG°'= - 30,5 kJ/mol
3/ glukosa-1 -P o glukosa + Pi AG°' = -20,9 kJ.moľ1
4/ hydrolýza PPi: PPi o 2 Pi AG°' = -33,4 kJ.moľ1
Vypočítejte AG' hydrolýzy difosfátu za aktuálních podmínek koncentrace při 25°C: [Pi] = 5 mmol.ľ1, [PPi] = 2 mmol.ľ1.
12. Vypočítejte AG°' hydrolýzy aktivované glukosy při 25°C:
ADP-glukosa + H2O o glukosa + ADP K dispozici máte tyto údaje:
1/ Glukosa-1- fosfát + ATP o ADP-glukosa + PPi   K'eq = 2 21 hydrolýza difosfátu: PPi o 2 Pi AG°' = - 33,4 kJ.moľ1
3/ Glukosa-1 - fosfát o glukosa + Pí AG°' = -20,9 kJ.moľ1
4/ ATP o ADP + Pi AG°' - -30,5 kJ.moľ1
19
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
E. ÚVOD DO ENZYMOLOGIE
TŘÍDY ENZYMŮ A JEJICH SYSTEMATICKÉ NÁZVOSLOVÍ
1. Oxidoreduktasy
A + B <=> A + B"
donor:akceptor-oxidoreduktasa
např. glukosa:02-oxidoreduktasa, triviálně glukosaoxidasa
Pozor: U reakcí s NADH jako donorem resp. NAD+ jako akceptorem se upřednostňuje systematický název donor:NAD+-oxidoreduktasa před NADH:akceptor-oxidoreduktasa
2. Transferasy
A-B + C <=> A + B-C donor:akceptor-skupinatransferasa
např. ATP:glukosa-6-fosfotransferasa, triviálně glukokinasa či hexokinasa
3. Hydrolasy
A-B + H20 o A-H + B-OH substrát-skupinahydrolasa např. protein-amidohydrolasa, triviálně proteasa
4. Lyasy (synthasy)
X Y
A-B <=> A - B + X-Y substrát-skupinalyasa
např. citrát-oxalacetátlyasa, triviálně citrátsynthasa
5. Isomerasy
X Y     Y X
A-B o A-B
komplikované názvosloví, enzym může končit názvem:
racemasa (katalyzuje stereochemické změny substrátu, např. alaninracemasa)
epimerasa (např. UDP-glukosa-4-epimerasa)
isomerasa (obecně substrát-děj-isomerasa, např. maleinát-cis-trans-isomerasa) mutasa (např. chorismátmutasa)
6. Ligasy (synthetasy) A + B <=> A-B
substrát:substrát-ligasa(tvořící nukleotid)
např. alanin:tRNAAla-ligasa(tvořící AMP), triviálně alanyl-tRNA-synthetasa
20
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
KIN ETIKA ENZYMOVÝCH REAKCÍ
Vo... počáteční rychlost enzymové reakce (odpovídá počáteční koncentraci substrátu) Km ... Michaelisova konstanta: Koncentrace substrátu, při níž enzymová reakce probíhá rychlostí rovnou 1/2 vnm viim ... limitní počáteční rychlost
v,im
0 KM        2KM        3KM        4KM 5KM
[S]
Rovnice Michaelise-Mentenové
Jestliže platí [S] -» qo a enzymová reakce probíhá za optimálních podmínek (teplota, pH), pak
v0=
Vlim = kkat[E]t
(limitní počáteční rychlost je za těchto podmínek přímo úměrná koncentraci enzymu [E]t). Limitní rychlost lze tedy za podmínek [S] -» oo , teplotní a pH optimum ztotožnit s enzymovou aktivitou.
Jednotky enzymové aktivity:        1 katal = 1 mol.s1
1 IU   =1 umol. min1 (IU=Mezinárodní jednotka)
Konstanta kkat [s~1] vyjadřuje molekulární aktivitu enzymu (dříve označována jako číslo přeměny)=počet molekul (resp. molů) substrátu přeměněných za jednu sekundu jednou molekulou (resp. jedním molem) enzymu.
21
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
enzymová inhibice
Inhibice kompetitivní:
Km
E + S <=> ES Ki
E + I o El
E + P
Jestliže S^- oo , pak [El] -^0,avo= vnr
Inhibice nekompetitivní:
Km
E + So ES^E + P
K +S E + lo Elo EIS
Km +l
E + So ESo EIS
bílkovinné a nebilkovinne složky enzymu
holoenzv
apoenzym
ionty kovu
kosubstrát prostetická skupina
(podléhá cyklické regeneraci)
úlohy
1. Enzymy v uzavřeném systému
a) posunují rovnováhu reakce ve směru tvorby produktu
b) neovlivňují rovnovážný stav reakce
c) zvyšují AG°' reakce
d) snižují
22
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
2. Pojmenujte enzymy katalyzující následující reakce a zařaďte je podle enzymové nomenklatury (tj. hydrolasa, transferasa, oxidoreduktasa, apod.):
a) oxalacetát + NADH + H+ -» malát + NAD+
b) glutamát + pyruvát -» 2-oxoglutarát + alanin
c) škrob + nhteO^- n (maltosa)
d) formaldehyd + NADH + H+ -» methanol + NAD+
e) fruktosa + ATP -» fruktosa-6-fosfát + ADP
f) močovina + H2O -» amoniak + CO2
g) glukosa-6-fosfát -» glukosa-1-fosfát
h) D-alanin + D-alanin + ATP -» D-alanyl-D-alanin + ADP + Pí
3. Glukokinasa a hexokinasa jsou enzymy katalyzující tutéž reakci:
ATP + glukosa o glukosa-6-P + ADP
Glukokinasa z jater má Km pro glukosu 10 mmol.ľ1, enzymová aktivita je 1,5 umol.min"1. Hexokinasa má Km 0,1 mmol.ľ1, enzymová aktivita je 0,1 umol.min"1. Vypočítejte počáteční rychlost přeměny glukosy při její následující koncentraci (ATP je v nadbytku) a srovnejte hodnoty pro oba enzymy.
a) 0,1 mmol.I1
b) 1 mmol.ľ1
c) 5 mmol.I1 normální hodnota
d) 30 mmol.ľ1 diabetes
4. Aktivita enzymu v roztoku je 0,2 umol.min"1, Michaelisova konstanta enzymu pro daný substrát je 0,2 mmol.I1. Vypočítejte, jakou počáteční rychlostí bude enzymová reakce probíhat, je-li koncentrace substrátu 0,005 mmol.I1.
5. Na základě měření vypočítejte kinetické parametry enzymu, tj. Km a limitní počáteční rychlost. Použijte např. grafické vynesení podle Lineweaver-Burka.
konc. substrátu (mol.I1) v0 (umol.min"1)
0.3,10"5 10,4
0.5,10"5 14,5
1.10"5 22,5
3.10"5 33,8
9.10"5 40,5
6. Jak byste eliminovali působení a) kompetitivního b) nekompetitivního inhibitoru?
23
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
7. Při kinetickém měření závislosti reakční rychlosti na koncentraci substrátu byly zjištěny následující hodnoty:
Vypočítejte Michaelisovu konstantu enzymu pro tento substrát.
8. Určete Km a aktivitu enzymu na základě kinetických měření. Použijte např. grafické vynesení podle Lineweaver-Burka.
[S] (mol.ľ1) v0(|j,mol.min"1) 0,0003 0,026 0,001 0,054 0,002 0,070
9. Vypočítejte Michaelisovu konstantu a maximální rychlost reakce na základě kinetických měření. Použijte např. grafické vynesení podle Lineweaver-Burka.
[S] (mol.ľ1)   počáteční rychlost (nmol.s1) 1.104 0,45 5.104 2,3 2.103 5,3 4.103 6,5
10. Vypočítejte, jakou aktivitu (|j,mol/min) bude mít 2,5.104 mg zcela čistého enzymu o molek. hmotnosti 400 000, je-li molekulární aktivita (číslo přeměny) 2500 s~1.
11. Vypočítejte molekulární aktivitu enzymu, jestliže 5.104 mg zcela čistého enzymu má aktivitu 20 mezinárodních jednotek. Molekulová hmostnost enzymu je 240000.
[S] (mmol.ľ1)
Vo (mmol.min
0,1 0,2 0,4 1,0 2,0
0,046 0,086 0,150 0,270 0,370
24
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
F. GLYKOLÝZA, METABOLISMUS SACHARIDŮ
HfČUH
25
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
1. Napište vzorce: kys. 1,3 bis fosfoglycerové, fosfoenolpyruvátu. K aldolase byl přidán fruktosa 1,6 bis fosfát značený na C2. Jaká bude distribuce radioaktivity ve vzniklé triose?
2. K enzymům anaerobní glykolysy byla přidána kys. 3-fosfoglycerová značená na uhlíku C2. Zvratem anaerobní glykolysy byl z této kyseliny synthezován fruktosa-1,6-bis fosfát. Jaká bude distribuce radioaktivity v tomto fruktosa-1,6 bis fosfátu?
3. Fruktosa 1,6-bisfosfát byl značen fosfátem 32P na uhlíku číslo 1. Prokažte, zda se tento značený fosfát objeví ve formě ATP, pokud anaerobní glykolýza proběhla do stadia kys. 3-fosfoglycerové.
4. Napište bilanční rovnici přeměny glyceraldehyd-3-P na fruktosa-6-P v procesu glukoneogeneze:
Glyceraldehyd-3-fosfát + A + B +... o fruktosa-6-P + X + Y + ...
5. Napište bilanční rovnici přeměny fruktosa-6-fosfátu na kys. 3-fosfoglycerovou v procesu anaerobní glykolýzy.
Fru-6-P + X + Y + ... o kys.3-P-glycer. + A + B +...
6. Látka A je produktem anaerobní glykolýzy. Její redukcí NADH vzniká látka B. Transaminací látky A vzniká látka C. Napište názvy a vzorce látek A,B,C.
7. Napište bilanční rovnici přeměny fruktosy na pyruvát v procesu anaerobní glykolysy za předpokladu: a) fosforylace fruktosy hexokinasou
fruktosa + ATP ofruktosa-6-P + ADP
b) fosforylace fruktosy fruktokinasou
fruktosa + ATP ofruktosa-1-P + ADP
8.. Napište bilanční rovnici přeměny fruktosa-1,6-bisfosfátu na fosfoenolpyruvát při anaerobní glykolýze
a) v přítomnosti NAD, Pí a ADP
b) v přítomnosti NAD+, ADP, arseničnanu
9. Glukosa byla značena 14C. Jaká bude distribuce značeného uhlíku v pyruvátu po přeměně značené glukosy v procesu anaerobní glykolýzy.
a) v případě značení na C1
b) v případě značení na C6
(izomerace glyceraldehydfosfátu na dihydroxyacetonfosfát je velmi rychlá vzhledem k následujícícmu kroku).
26
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
10. Jaká bude rovnovážná koncentrace fruktosa-1,6-bisfosfátu, glyceraldehyd-3-fosfátu a dihydroxyacetonfosfátu, jestliže fruktosa-1,6-bisfosfát 1 mmol.ľ1 byl inkubován s aldolasou (AG°'= + 24 kJ.moľ1).
11. Zdůvodněte, proč při anaerobní glykolyse musí být glukosa-6-fosfát izomerován na fruktosa-6-fosfát. Vezměte v úvahu reakční mechanismus aldolasové reakce. Proč tato reakce probíhá s fruktosa-1,6-bisfosfátem a nikoliv s glukosa-1,6-bis fosfátem?
12. Glukosa značená 14C na C1 byla přidána do směsi obsahující enzymy pentosového cyklu. Jaký je osud radioaktivně značeního uhlíku při přeměně na dvě molekuly triosy ?
13. K enzymům anaerobní glykolysy byla přidána kys. 3-fosfoglycerová značená na uhlíku karboxylové skupiny. Zvratem anaerobní glykolysy byl z této kyseliny synthezován fruktosa-1,6-bisfosfát. Jaká bude distribuce radioaktivity v tomto fruktosa-1,6-bisfosfátu.
14. Na základě velikosti AG0' odhadněte, které reakce nemohou při glukoneogenesi probíhat zvratem anaerobní glykolysy. Jakým způsobem jsou tyto reakce obcházeny? (Jedna z reakcí probíhá přes nepříznivé AG0'. Odhadněte proč.)
15. Určité bakteriální mutanty mají nefunkční triosafosfát izomerázu. Vysvětlete, proč je tato mutace letální pro organismus fermentující glukosu výlučně cestou anaerobní glykolýzy.
16. Vysoké koncetrace pyruvátu inhibují izoenzym laktátdehydrogenasy srdečního svalu, nikoli však izoenzym ze svalu kosterního. Jaké by byly důsledky tohoto efektu, kdyby srdeční sval obsahoval pouze izoenzym totožný s izoenzymem kosterního svalu.
Jaké by byly obrácené důsledky, kdyby kosterní sval obsahoval izoenzym totožný s izoenzymem srdečním?
17. Při glukoneogenezi je termodynamická bariéra tvorby fosfoenolpyruvátu obcházena tvorbou oxalacetátu (koenzym biotin). Napište obě dvě rovnice použité k obchvatu pyruvát kinázové reakce a vypočítejte AG0' souhrnné reakce. (Předpokládejte, že GTP je termodynamicky ekvivalentní ATP).
27
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
G. CITRÁTOVÝ CYKLUS
S    1     1 ů
NAD
Čísla uvedená u reakcí jsou hodnoty ůGo (kJ/mof)
CH I
HSC— C--CH,
I t S00C    CO O6 CODe
00C \ íiímjrát
HO-CH— CH--CHj
NAD® • Co A
HjC-CHj
*c cooe
supiny I-Cca
cooe COQ9
28
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
1. Srovnejte AG0' reakcí citrátového cyklu. Které reakce mají tendenci probíhat obráceným směrem a jakým způsobem dochází k posunu reakcí žádoucím směrem?
2. V kterém místě citrátového cyklu dochází k dekarboxylaci:
Přeměna: a) citrátu na akonitát, b) isocitrátu na oxoglutarát, c) malátu na oxalacetát, d) oxalsukcinátu na 2-oxoglutarát ,e) 2-oxoglutarátu na sukcinyl-CoA
3. V kterém místě citrátového cyklu dochází k oxidaci substrátu Přeměna
a) sukcinátu na fumarát b) 2-oxoglutarátu na sukcinyl-CoA
c) fumarátu na malát   d) oxalacetátu na citrát e) acetylkoenzym A na citrát
4. Napište bilanční rovnici přeměny oxoglutarátu na sukcinát v citrátové, cyklu.
5. Jaké jsou rovnovážné relativní koncentrace isocitrátu, citrátu a cis-akonitátu, je-li AG0' reakcí následující:
1/ citrát o cis-akonitát + H20     AG0' =+8.4 kJ.moľ1 21 cis-akonitát + H2O o isocitrát   AG0' =-2.11 kJ.moľ1
6. Napište bilanční rovnice přeměny těchto látek v Krebsově cyklu do stadia oxalacetátu:
a) citrát
b) jantaran
c) malát
Napište vzorce uvedených karboxylových kyselin.
7. Jaká je distribuce uhlíku 14C na oxalacetátu po přidání pyruvátu značeného na a) C1, b) na C2, c) na C3
k enzymům Krebsova cyklu a k pyruvát dekarboxylase?
8. K enzymům Krebsova cyklu byla přidán acetylCoA značený 13C na methylové skupině. Dokažte, jaká bude distribuce radioaktivity ve vzniklém citrátu a jaká ve vzniklém isocitrátu
9. Na základě hodnoty AG0' vypočtené ze standardních redoxpotenciálů zdůvodněte, proč oxidace jantaranu na fumaran v Krebsově cyklu probíhá za účasti FAD jako koenzymu a nikoliv NAD+.
jantaran + FAD <=> fumaran + FADH2 jantaran + NAD+ o fumaran + NADH + H+ E0' (FAD/FADH2) = 0,000 V
10. Navrhněte hypotetický cyklus analogický Krebsově cyklu, kde by jako počáteční krok byla reakce acetylCoA s oxoglutarátem namísto s oxalacetátem.
29
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
H. respirační řetězec
-0.4
-0.2
o
LU
c +0.2
TJ O
I *0.4
■O CL
+0.6
+0.8
NADH , Fe-S
^FMN Amytal or rotenone Fe-S
Fe-S Succinate
Cyt bL
UQ->Cyt c,
FeS Cyt c
Cyt a
Cyta3
co\
\
02-|
50
4 0
30
20
10
Poloha v dýchacím řetfeci
1. Rozdělte jednotlivé složky respiračního řetězce na jednoelektronové a dvouelektronové přenašeče. Napište redoxní rovnice mezi uvedenými partnery a všimněte si, kde vystupuje jako reakční partner H+.
NADH - UQ   UQH2-Cyt c   cyt b-cyt c cyt a-1/2 02 cyt c-cyt a
2. Vypočítejte AG0' reakce mezi:
a) NADH + UQ
b) jantaran + UQ
c) cyt b(red) + cyt c(ox)
d) cyt c(red) + V2 O2
Na základě velikosti AG0' odhadněte, při které reakci je kryta energetická spotřeba vzniku jedné molekuly ATP (AG°'=-30 kJ.moľ1).
3. Vypočítejte AG0' oxidace NADH kyslíkem v respiračním řetězci. Kolik molů ATP by teoreticky vzniklo za standartních podmínek (AG0' = -30 kJ.moľ1). Jestliže namísto kyslíku
30
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
použijeme umělého akceptoru hexakyanoželezitanu (E°'= +0,360 V), jaká bude změna standardní volné energie reakce a kolik molů ATP vznikne?
4. Doplňte bilanční rovnici přeměny následujících látek v Krebsově cyklu a v respiračním řetězci:
jantaran + ADP + V2 O2 <=> fumaran + ATP isocitrát + ADP + V2 O2 <=> jantaran + ATP jantaran + ADP + V2 O2 <=> oxalacetát + ATP
5. Po přídavku inhibitoru respirace antimycinu k systému repiračního řetězce mitochondrií byla zjištěno úplné zredukování ubichinonu, cytochromu b a úplné zoxidovaní cytochromů c, aa3. Zakreslete místo zásahu tohoto inhibitoru.
6. Doplňte bilanční rovnici přeměny fumaranu na oxalacetát za spolupráce enzymů Krebsova cyklu a respiračního řetězce:
fumaran + ADP + .... <=> oxalacetát + ATP + .... 2-oxoglutarát + ADP +.....<=>  fumaran + ATP +.....
7. Vypočítejte AG0' reakce při 25°C
fumaran + NADH + H+<=> jantaran + NAD víte-li, že: E0' (NAD/NADH) - -0,320 V, E0' (fum/jan)= +0,030 V
Bylo by možné, aby za standardních podmínek byla tato reakce využita k syntéze ATP? (hydrolýza ATP: AG°'=-30 kJ/mol)
Zakreslete úseky respiračního řetězce, které se podílejí na této oxidaci NADH.
31
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
I. FOTOSYNTÉZA
Světelná fáze
NAD P H
fc-;V^<£Tŕiylal«5ld -' .i. ^ '■ 'mé mbrů ne
Stroma
silné
reduktans
\   NADF+ + H+
redoxni slabé
potenciál    reduktans oq^u
\
na dph
cytochrom f
H,0
Oa + 4H
Ľxidans psi
silné oxřdans
Pii li
32
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
Souhrnná rovnice:
2 ferred.(red) + NADP+ + H+o2 ferred (ox) + NADPH H2O + ADP + Pí + Aox o 1/2 O2 + 2H++ ATP + Ared
Temnostní fáze (Calvinův cyklus)
fixace:
CO2 + ribulosa-1,5-bisfosfát + H2O <=> 2 kys. 3-fosfoglycerová redukce:
kys.3-fosfoglycerová + NADPH + ATP o glycerald.-3-P + NADP + ADP + Pí + H2O syntéza hexózy:
2P-3 -» P-6 +Pi
regenerace:
P- 6 +
P- 3
P 5
/ ptŽl y p-tl
/ P-|~5
+ 3 ATP ^3 P-5-P + 3ADP
P{3] P-QT]
souhrnná rovnice:
5P-[Š]+3ATP^ 3 P{Š]-P + 3 ADP + 2PÍ
1. Napište souhrnnou rovnici světelné fáze fotosynthesy ve fotosystému I, fotosystému II a souhrnnou rovnici při propojení obou fotosystému. Pokuste se napsat souhrnnou rovnici temné fáze fotosynthesy s oxidem uhličitým na jedné straně a s triosofosfátem na straně druhé. Vodu nutnou pro hydrolýzu ATP zanedbejte.
2. Vypočítejte E0 a AG0' reakce mezi redukovaným ferredoxinem a NADP při fotosynthese (E0' ferredoxinu = -0,43 V).
33
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
3. K enzymům temné fáze fotosyntézy (fixace CO2) byl přidán ribulosa-1,5-bisfosfát a 14C02. Jaká bude distribuce radioaktivity v kyselině 3-fosfoglycerové? Jaká bude distribuce readioktivity v tomtéž případě, pokud byl přidán neznačený CO2 a ribulosa-1,5bisfosfát značený na C5?
4. Srovnejte proces redukce kys. 3-fosfoglycerové na glyceraldehyd-3-fosfát při fotosyntéze a vratný proces oxidace glyceraldehyd-3-fosfátu při anaerobní glykolyse. V čem se oba procesy liší?
5. Fotosystém I má v základním stavu štandartní redox potenciál E°'= +0,460 V. Po absorpci světelného kvanta se jeho potenciál změní na E°'= -0,600 V. Vypočítejte rovnovážný poměr koncentrací NADPH/NADP v reakci:
2 fotosys.l(red) + NADP + H+ o 2 fotosys.l (ox) + NADPH
s fotosystémem I v základním a excitovaném stavu. Poměr koncentrací oxidovaného a redukovaného fotosystému je roven 1, t = 25°C.
6. Dokažte výpočtem AG, zda redukovaný ferredoxin (E0' =-0,430 V) je při fotosyntéze schopen redukovat NADP (E0' = -0,324 V), pokud poměr koncentrací NADPH/NADP je při 25°C roven 100. Výchozí poměr redukovaného a oxidovaného ferredoxinu je roven 1. Napište rovnici této reakce.
7. Jeden z používaných herbicidů diuron je známým inhibitorem fotosyntézy. Tento inhibitor blokuje syntézu NADPH v chloroplastech, přičemž plastochinon se zcela zredukuje. Zakreslete pravděpodobné místo zásahu.
8. Určité primitivní fotosyntetizující bakterie žijící poblíž podmořských sopek obsahují bakteriochlorofyl a fotosystém II. Produktem této fotosyntézy je síra. Vysvětlete pomocí schématu rovnice.
34
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
J. NUKLEOVÉ KYSELINY
Nukleové baze
nh,
n
Adenin o
CH
nh
4
i       ^* ŕ
nh o
Thymin
o
n nh„
Guanin
o
"nh
nh o
Uracil
nh,
n
nh o
Cytosin
Nukleosidy
oh
O.
nh,
oh oh
oh
nh,
oh
Adenosin
oh
o
o
oh oh
Deoxyadenosin ch,
oh
o
oh
o
Uridin
Deoxythymidin
35
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
Primární struktura nukleových kyselin
-struktura vazby nukleotidů: viz prezentace
Metody studia sekvence nukleových kyselin:
Enzymy používané k hydrolýze nukleových kyselin (mohou být specifické na DNA, RNA, nebo bez specifity):
-Fosfomonoesterázy -
hydrolyzují terminálni fosfátovou skupinu
-Fosfodiesterázy:
hydrolyzují fosfodiesterovou vazbu:
exonukleázy (5'- exonukleázy uvolňují 3'P nukleosidy, 3'- exonukleázy uvolňují 5'P nukleosidy)
endonukleázy uvolňují oligonukleotidy, jsou obvykle substrátově specifické (deoxyribonukleáza, ribonukleáza)
-Polynukleotidkináza: Fosforyluje volnou 5'OH skupinu pentózy pomocí ATP
fosfomonoesteráza
U
5'exonukleáza
5
P.
endonukeáza (ribonukleáza)
3'exonukleáza
OH
36
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
Maxam-Gilbertova metoda sekvenace nukleových kyselin:
1. Označení konce nukleové kyseliny pomocí ATP (32P)
2. Specifická chemická hydrolýza v místě:
G: působením DMS za tepla
G + A: působením kyseliny a DMS
C: působením hydrazinu v prostředí 5 M NaCI
C + T: působením hydrazinu
3. Elektroforéza získaných fragmentů za denaturačních podmínek (rychlost migrace je nepřímo úměrná počtu nukleotidů)
4. Skenování gelů na fosfoimageru (detekce radioaktivity)
Dnes již automatické sekvenátory v servisních laboratořích (kapilární elektroforéza s laserem indukovanou fluorescencí)
Sekundární struktura DNA
Základní strukturou DNA je dvojitá šroubovice stabilizovaná vodíkovými vazbami mezi A-T a G-C.
Základní dvojitá šroubovice (B-DNA) obsahuje 10 pb na jednu otáčku a vzdálenost mezi dvěma následujícími pb je 0,34 nm. Méně běžné typy:
A-DNA šroubovice obsahuje 11 pb/otáčka a vzdálenost mezi sousední bázemi je 0,23 nm.
Z-DNA šroubovice obsahuje 12 pb/otáčka a vzdálenost mezi sousedními pb je 0,38 nm.
37
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
Geneticky kód m RNA prokaryot:
uuu	P he	UCU	Ser	U AU	Tyr	UGU	Cys
uuc		UCC		U AC		UGC	
UUA	Leu	UCA	Ser	UAA	STOP	UGA	STOP
UUG		UCG		U AG		UGG	Trp
CUU	Leu	ecu	Pro	C AU	His	CGU	Ang
cue		CCC		C AC		CGC	
CUA	Leu	CCA	Pro	CAA	Gin	CGA	Ang
CUG		CCG		C AG		CGG	
AU U	lie	AC U	Thr	AAU	Asn	AGU	Ser
AU C		AC C		AAC		AG C	
AU A	lie	AC A	Thr	AAA	Lys	AGA	Ang
AUG	Met	AC G		AAG		AG G	
GUU	Val	GCU	Ala	GAU	Asp	GGU	Gly
GUC		GCC		G AC		GGC	
GUA	Val	GCA	Ala	GAA	Glu	GGA	Gly
GUG		GCG		GAG		GGG	
1. Napište vzorce adeninu, nukleosidu a nukleotidu od něho odvozeného.
2. Roztok obsahující AMP a GMP měl absorbanci A260 = 0.652 a A280 = 0.284, vypočítejte koncentraci AMP a GMP v roztoku, jestliže pro AMP je s při 260 = 15.4 x 103 M1.cm1, s při 280 = 2.5 x 103 M1.cm1. Pro GMP s při 260= 11.7 x 103 M1.cm1, s při 280 = 7.7 x 103 M"1.cnr1.
3. Napište úplnou strukturu ribodinukleotidu a deoxyribodinukleotidu složeného z A a C.
4. Vypočítejte průměrnou molekulovou hmotnost jednoho nukleotidového zbytku DNA a RNA, za předpokladu, že baze jsou přítomny v ekvimolárních koncentracích. Nezapomeňte na kondenzaci vody při vytvoření esterové vazby!
(Molekulové hmotnosti složek: A = 135, G = 151, C = 111, U = 112, T = 126, ribóza 150, kys. fosforečná = 98).
5. Schematické znázornění sekvence RNA (zapsáno od volného 3' konce k 5' konci) je následující:
UpCpUpApGpAp
Napište produkty hydrolýzy této RNA pomocí následujících enzymů:
a) fosfomonoesteráza
b) fosfodiesteráza hadího jedu (3'- exonukleáza)
c) fosfodiesteráza ze sleziny (5'- exonukleáza)
d) ribonukleáza T1 (hydrolýza v místě G, vznik 3'P oligonukleotidu)
e) ribonukleáza U2 (hydrolýza v místě A nebo G, vznik 3'P oligonukleotidu)
6. Oligonukleotid pocházející z DNA má následující sekvenci (zapsáno od volného 5' konce k 3' konci):
38
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
pApCpTpTpApG
5' terminálni nukleotid byl označen 32P. Jaké oligonukleotidy získáme po působení fosfodiesterázy hadího jedu (viz výše). Které z nich budou značeny 32P? Které oligonukleotidy získáme hydrolýzou pomocí deoxyribonukleázy II a které z nich budou  značeny  32P  (deoxyribonukleáza   II je  endonukleáza  uvolňující 3'P oligonukleotidy).
7. Oligoribonukleotid X je složen z následujících bazí: 2A, 2C, U, G.
a) po působení fosfodiesterázy z hadího jedu se po krátké době uvolní pC.
b) hydrolýzou pomocí pankreatické ribonukleázy získánme C, dinukleotid obsahující A a C a dále trinukleotid obsahující A, G a U.
(penkreatická ribonukleáza je endonukleáza a působí v místě C a U za vzniku 3'P oligonukleotidů).
c) hydrolýzou pomocí ribonukleázy T2 (hydrolýza v místě A za vzniku 3'P oligonukleotidů) získáme pAp, dinukleotid obsahující U a C a trinukleotid obsahující A, G a C.
Určete sekvenci oligoribonukleotidu
8. Udejte sekvenci oligodesoxyribonukleotidu stanovovanou Maxam-Gilbertovou metodou. Na fosforimageru byl získán následující obraz:
G+A G C+T C
start
9. Při replikaci řetězce DNA -AGCGTAG- byl vytvořen komplementární řetězec. Napište jeho sekvenci. Jaká bude sekvence mRNA vytvořená při transkripci?
10. Napište sekvenci komplementární k uvedenému řetězci DNA, vyhledejte úseky obsahující palindrom.
39
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
a/GATCAA, b/TGGAAC, c/GAATTC, d/ACGCGT, e/ CGGCCG, f/ TACCAT
11. Vypočítejte molekulovou hmotnost jednoho průměrného páru bazí (molekulová hmotnost A = 135, T = 126, G = 151, C = 111, deoxyribóza 134, kys. fosforečná 98. Nezapomeňte na odštěpení vody při tvorbě esterové vazby). Jaká je molekulová hmotnost molekuly DNA o délce 1 |j,m v Da a hmotnost v gramech? (vzdálenost mezi dvěma následujícími pb je 0,34 nm, relativní molekulová hmotnost jednoho páru bazí je v průměru 617,5)
12. Jaterní buňka krysy obsahuje 1011 g DNA. Tato DNA je rovnoměrně rozdělena do 42 chromosomů buňky.
a) Jaká je molekulová hmotnost DNA (1 chromosom obsahuje jednu molekulu DNA).
b) Vypočítejte počet párů bazí DNA obsažené v jednom chromosomů a jeho délku (vzdálenost mezi dvěma následujícími pb je 0,34 nm, molekulová hmotnost jednoho páru bazí je v průměru 617,5).
13. Molární složení guaninu + cytosinu v DNA určité bakterie je 67,2%. Jaký je poměr mezi purinovými a pyrimidinovými bázemi? Jaké je molární složení v procentech jednotlivých bazí této DNA.
14. Při analýze byla zjištěna změna v aminokyselinovém složení bílkoviny, jejíž gen byl mutován. Vyberte z následujících změn ty případy, které jsou výsledkem mutace provedené změnou jedné baze.
Phe -» Leu   Lys -» Ala    Ala -» Thr    Phe -» Lys   Ne -» Leu His -» Glu    Pro -» Ser
15. DNA fága lambda vzniklá deleční mutací má délku 13, 6 um namísto 16, 49 um.
a) Vypočítejte, kolik pb tomuto mutantovi chybí
b) Jaký je rozdíl v molekulové hmostnosti a hmotnosti v gramech obou DNA
c) Část, u které byla provedena delece odpovídá sekvenci kódující protein P. Jaká je molekulová hmotnost tohoto proteinu. Průměrná molekulová hmotnost aminokyseliny je 140.
16. Směs nukleosidtrifosfátů značených 32P na y-fosfátu byla inkubována s RNApolymerázou: Po určité době byla zjištěna inkorporace 100 molekul značeného fosfátu do výsledného produktu. Tentýž pokus byl proveden se směsí nukleosidtrifosfátů značených na fosfátu a. Byla zjištěna inkorporace 3.104 molekul fosfátu do značeného produktu.
Jaký počet řetězců RNA byl syntezován a jaká je jejich průměrná délka?
17. Aminokyselinová sekvence C-terminální oblasti bílkoviny a odpovídající kódující sekvence DNA jsou následující:
Phe -Glu -Ne -Leu -Glu -Arg -Arg
40
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018 TTT GAG ATT CTG GAG CGG CGG
Popište mutace, které by mohly vnést do této sekvence reštrikční místo TT/CGAA
a jiné reštrikční místo A/GATCT a to za podmínky, že nedojde ke změně sekvence
aminokyselin ve vzniklém peptidu.
18. DNA bakteriofága má následující složení bazí: C 19%, A 25%, T 33% a G 23%.
a) Co je na této DNA neobvyklé a čím se dá její struktura charakterizovat
b) Tato DNA byla použita jako matrice in vitro při reakci katalyzované DNA polymerázou. Jaké bude složení bazí této nově syntezované DNA?
c) pokud by množství nasyntezované DNA bylo stejné jako je množství matrice, jaké je celkové složení bazí (to je DNA matrice + DNA syntezované in vitro)
d) mRNA syntezované jakožto odpověď na infekci fágem má následující složení: C 18%, A 25% U 34% G 23%. Který řetězec DNA byl použit pro syntézu RNA?
19. Byla provedena syntéza polynukleotidu mRNA in vitro za použití 90% UTP a 10% CTP. Tyto polymerní molekuly byly poté použity pro syntézu polypeptidu za přítomnosti všech 20 t-RNA. Syntezované polypeptidy byly hydrolyzovány a jejich celkové aminokyselinové složení bylo následující: 81% Phe, 1% Pro, 9% Ser, 9% Leu. Vypočítejte frekvenci všech kodonů a zdůvodněte odpovídající aminokyselinové složení polypeptidu.
20. Při pokusu byla enzymově připravena glutaminyl-tRNA značená na glutaminu. Poté byla tato látka chemicky desaminována za vzniku glutamyl-tRNA. Tato tRNA byla přidána do bezbuněčné směsi připravené z E. coli a zbavené mRNA. Ke směsi byl přidán uměle připravený polymer obsahující ekvimolární koncentraci G a A. Kolik procent glutamátu bude obsahovat syntezovaný polypeptid?
21. Při stanovení primární struktury enzymu bylo zjištěno, že se skládá z 250 aminokyselin. Jaký je minimální počet nukleotidů strukturálního genu tohoto enzymu? Při bodové mutaci tohoto strukturálního genu došlo k náhradě jednoho serinu glutamátem. Tento fakt se projevil ztrátou enzymové aktivity. Co z tohoto faktu lze vyvodit?
41
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
K. REDOXNI REAKCE
Pro redukci látky obecně platí [ox] + e- <=> [red]
tento děj charakterizuje redoxní potenciál E' (v biochemii definován při pH 7)
RT	[OX]
E' = E°' +------	In---------
nF	[red]
standardní	aktuální
redox pot.    koncentrace složek
Pravidlo: Tabulková hodnota redoxního potenciálu vždy odpovídá směru redukce dané složky. Hodnota redoxního potenciálu pro směr oxidace má opačné znaménko.
F = 96500 C.mor1 R; R = 8,314 J.K1.mol1
Reakce mezi dvěma redoxními systémy:
(ox)i + (red)2 <=> (red)i + (ox)2
Pokud je systém v rovnováze, platí AG' = 0 a Ei= E2
RT     [0x1] RT [0x2]
E°'i + -— In-------- = E° 2 + -— In--------
nF     [redi] nF [red2]
RT [ox2][redi]
E°'i - E° 2 = -— In---------------
n F [red2][oxi]
[0x2] [red 1] RT
Keq =---------------- => E°'l - E°2=------- In Keq
[oxi][red2] n F
AG°'= - RT In K,
AG0'
E°'i - E°2=-------
nF
AG0' =-nFAE0'
42
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
Tabulka. Hodnoty standardních redoxpotenciálů některých důležitých redoxních párů při pH7:_
oxidovaná/redukovaná forma	E0' [V]
acetát/acetaldehyd	-0,580
NADVNADH	-0,320
NADPVNADPH	-0,324
acetaldehyd/ethanol	-0,197
pyruvát/laktát	-0,185
oxalacetát/malát	-0,166
ubichinon/ubihydrochinon	+0,100
2cyt b(ox)/2cyt b(red)	+0,030
fumaran/jantaran	+0,031
2cyt c(ox)/2cyt c(red)	+0,235
2cyt a(ox)/2cyt a(red)	+0,385
1/2 O2 /H2O	+0,816
1. Vypočítejte redoxní potenciál E' směsi NAD/NADH, je-li koncentrace NAD 1 mmol.ľ1, NADH 10 mmol.ľ1.
2. Srovnáním standardních redox potenciálů určete, zda reakce bude mít tendenci probíhat doleva nebo doprava:
malát + NAD+ o oxalacetát + NADH + H+
pyruvát + NADH + H+o laktát + NAD+ malát + pyruvát <=> oxalacetát + laktát acetaldehyd + fumarát <=> acetát + jantaran
3. Vypočítejte rovnovážnou konstantu reakce ze standardního redox potenciálu E0' (t=25°C)
malát + NAD+ o oxalacetát + NADH + H+
4. Vypočítejte, jaký musí být poměr koncentrací NAD/NADH, aby reakce:
pyruvát + NADH + H+ o laktát + NAD+ byla při 25°C v rovnováze, je-li poměr koncentrací pyruvát/laktát = 1.
5. Vypočítejte AG reakce:
jantaran + NAD+ o fumaran + NADH + H+ je-li koncentrace NAD 10 mmol.ľ1, NADH 1 mmol.ľ1, jantaranu 10 mmol.ľ1, fumaranu 5 mmol.ľ1, t=25°C.
6. Vypočítejte AG reakce při 25°C
NADH + H+ + UQ <=> UQH2 + NAD+
43
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
je-li koncentrace NAD 10Okrát vyšší než koncentrace NADH a koncentrace UQH2 2krát vyšší než koncentrace UQ.
E0'(UQ/UQH2)= +0.104 V, E°'(NAD+/NADH) - -0,320 V
7. Určete AG0' reakce:
acetaldehyd + fumaran <=> acetát + jantaran E0' (acetát/acetaldehyd) = -0,580 V, E'0 (jantaran/fumaran) = 0,030 V. V jakém směru bude reakce probíhat?
8. Určete AG0'reakce:
cyt c2+ + cyt a3+ <=> cyt c3+ + cyt a2+
E0' (cyt c3+ / cyt c2+)= +0,235 V, E0' (cyt a3+ / cyt a2+) =+0,385 V. V jakém směru bude reakce probíhat?
9. Vypočítejte AG°'reakce:
cyt a(red) + 1/2 O2 + 2H+ o cyt a(ox) + H2O
E°'(cyt a(ox)/cyt a (red)) - 0,385 V , E0(1/2 O2 /H20)= 0,816 V. Je-li AG0' syntézy ATP z ADP a Pí +30 kJ.moľ1, kolik molekul ATP může vzniknout při této reakci za standardních podmínek?
10. Vypočítejte, jaký je poměr koncentrací NAD/NADH u ethanolického kvašení v rovnováze, pokud by koncentrace ethanolu byla 5% a koncentrace acetaldehydu 0,5 mmol.ľ1. Hustota roztoku alkoholu = 1 g.mľ1.
NADH + H+ + aldehyd -» NAD + alkohol
Eo (acetaldehyd/ethanol) - -0,197 V; E0 (NADVNADH) - -0,320 V.
11. Dokažte pomocí výpočtu AG0', zda při oxidaci acetaldehydu na acetát je vhodnějším koenzymem NAD nebo FAD.
Acetaldehyd + oxid. koenzym -» acetát + red. koenzym
Při výpočtu berte v úvahu situaci, kdy poměr reduk. koenzym/oxid. koenzym = 1/100 a koncentrace acetaldehydu a acetátu je ekvimolární.
E0' (acetát/acetaldehyd) - -0,580 V, E0' (NADVNADH) - -0,320 V, E0' (FAD/FADH2) -0,000 V.
44
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
VÝSLEDKY ULOH
A. AMINOKYSELINY, PEPTIDY A BÍLKOVINY
1. a) Pne, Tyr, Try, His
b) Cys, Met
c) His, Lys, Arg
d) Ala, Gly, Phe, Ser, Val, Asp, Glu, Cys, Tyr, Asn, Gin, Try, Leu, Ne, Met, Thr, Pro
e) Gly, Ala, Leu, Ne, Val
f) žádný asymetrický uhlíkový atom: Gly dva asymetrické uhlíkové atomy: Ne, Thr
2.
3. postupná disociace glycinu: A+^- A -» A Ki=[A].[H*]/[A*]
K2=[A-].[H+]/[A]
Vztahy pro disociační konstanty se pak využijí k výpočtu procenta disociované formy (po dosazení za jednotlivé formy glycinu se [A] nakonec vykrátí): [A].1007([A+]+[A]+[A-])=79.9% disociované formy karboxylové skupiny při pH=3 [A].100/([A+]+[A]+[A-])=0.99% NH3+ při pH 11
4. NH2-Thr-Gly-COOH; pl=6,385 (pro NH2-Gly-Thr-COOH by byl pl=6,115)
5. Přibližný náboj jednotlivých aminokyselin v peptidickém řetězci lze určit na základě disociačních konstant postranních skupin. Pokud je uvažované pH roztoku vyšší než hodnota pK3 postranní -COOH skupiny, pak proběhne její disociace na -COO. Pokud je pH roztoku nižší než pK3 postranní aminoskupiny, pak tato skupina přejde na formu -NH3+.
při pH=5:
Arg++-His+-Gly0-Phe0-Gly0-Glu1--Lys+-Tyr°-Cys0-Ala1-, celkem 2+ při pH=9:
Arg1'5+-His°-Gly0-Phe0-Gly0-Glu1--Lys+-Tyr0-Cys1-Ala1-, celkem 0-1-Z výše uvedeného vyplývá, že pl tohoto peptidu se nachází mírně pod pH=9. Hodnotu pl lze spočítat pouze přibližně, protože nemáme možnost brát v úvahu vliv sekundární struktury peptidu, vliv ostatních aminokyselinových zbytků na hodnoty disociačních konstant apod. Při porovnání disociačních konstant jednotlivých disociabilních skupin peptidu zjistíme, že nejvíce se pH9 přibližují: disociační konstanta argininu pK2=9,0 a disociační konstanta cysteinu pK3=8,3. Právě disociace -SH skupiny cysteinu bude hrát významnou úlohu ve změně náboje peptidu při hodnotách pH blízkých pl. Při poklesu pH pod 8,3 by se měl ztratit záporný náboj cysteinu a tím by měl peptid dosáhnout elektroneutrality. pl<8,3
Pokud je izoelektrický bod přibližným aritmetickým průměrem pKa neutrální formy, pak bude první uvažovanou disociací deprotonace cysteinu (pK3=8,3) při pH vyšším než pl a druhou reakcí bude protonace koncové skupiny o pKa2=7,9 při pH nižším než pl. Výsledný izoelektrický bod: pl=8,1.
6. disociabilní skupiny v peptidech A a B:
45
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
A) Ser-NH2(9!2)! Tyr-OH(10,9), Glu-COOH(4,3), His-NH(6,0), Arg=NH(12,5), Gly-COOH(2,4)
B) Val-NH2(9!6)! Cys-SH(8,3), Glu-COOH(4,3), Lys-NH2(10,8), Gly-COOH(2,4) náboje při pH 9: A) Ser1+-Tyr0-Ser0-Met0-Glu1-His0-Phe0-Arg1+-Gly1- 0
B) Val1+-Cys1-Phe0-Glu1--Ala0-Lys1+-Leu0-Gln°-Gly1- 1-náboje při pH 5: A) Ser1+-Tyr°-Ser0-Met0-Glu1--His1+-Phe0-Arg1+-Gly1- 1 +
B) Val1+-Cys0-Phe0-Glu1-Ala0-Lys1+-Leu0-Gln0-Gly1- 0 Elektroforézu lze provést např. při pH=5.
7. Izoelektrické body: Gly(6,1), Ala(6,1), Glu(3,25) , Lys(10,0), Arg(10,75), Ser(5,65), Asp(2,95), Asn(5,4).
Aminokyseliny mají v prostředí o vyšším pH než je jejich pl náboj záporný, při nižším pH náboj kladný. pH 3: anoda: Asp
katoda: Arg, Lys, Ala, Gly, Ser, Asn, Glu
(Glu a Asp mají izoelektrické body jen málo odlišné od 3, budou migrovat menší rychlostí než ostatní aminokyseliny) pH 7: anoda: Asp, Glu, Asn, Ser, Gly, Ala katoda: Arg, Lys
(Gly a Ala budou díky svým izoelektrickým bodům migrovat pomaleji než ostatní aminokyseliny)
8. Izoelektrické body: Gly(6,1), Ala(6,1), Glu(3,25), Lys(10,0), Arg(10,75), Ser(5,65).
Při pH=1 se díky svému kladnému náboji zachytí všechny. Při pH=6 se eluují Glu, Ser a také Gly, Ala, neboť jsou téměř v izoelektrickém bodě.
9. Izoelektrické body: Arg(10,75), Ala(6,1), Glu(3,25), Tyr(5,65), Ser(5,65)
a) pH=11: Arg0, Ala1-, Glu2-, Tyr2-, Ser1- (hodnota náboje určena na základě jednotlivých pKa). Vyteče Arg, ostatní aminokyseliny se zachytí na koloně.
b) pH=8: Ala1-, Glu1-, Tyr1-, Ser1-. Žádná aminokyselina nevyteče.
10. Izoelektrické body: Glu(3,25), Ala(6,1), His(7,6), Lys(10), Tyr(5,65) Pořadí eluce: Glu, Tyr, Ala, His, Lys.
11. Izoelektrické body: Cys(5,05), Glu(3,25), Ser(5,65), Ala(6,1), Lys(10,0), His(7,6). Nezachytí se Lys, ostatní se zachytí.
12. a) disociabilní skupiny peptidu (I): Ala-NH2(9,9), Glu-COOH(4,3), Tyr-OH(10,9), Lys-NH2(10,8), Lys-COOH(2,2)
disociabilní skupiny peptidu (II): Gly-NH2(9,8), Asp-COOH(3,9), His-NH(6), Tyr-OH(10,9), Lys-NH2(10,8), Lys-COOH(2,2)
Podstatný rozdíl je v přítomnosti histidinu v peptidu(ll) na rozdíl od peptidu(l).
Pro dosažení kladného náboje histidinu zvolíme např. pH=5:
Ala1+-Glu1--Gly°-Tyr°-Lys° 0
Gly1+-Asp1-His1+-Tyr°-Lys°     1 +
Peptid(ll) se na katexu zachytí, b) disociabilní skupiny peptidu (III): Ser-NH2(9,2), Tyr-OH(10,9), Glu-COOH(4,3), His-NH(6), Arg=NH(12,5), Gly-COOH(2,4)
disociabilní skupiny peptidu (IV): Val-NH2(9,6), Cys-SH(8,3), Glu-COOH(4,3), Lys-NH2(10,8), Gly-COOH(2,4)
46
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
Nemůžeme využít rozdílu v přítomnosti histidinu ke zvýšení náboje peptidu(lll) o +1, neboť potřebujeme dělit anionty. Využijeme rozdílu disociačních konstant OH skupiny tyrosinu a SH skupiny cysteinu. Zvolíme pH=9:
SerO^-TyrO-Met^Glu^-His^Phe^Arg1^^1- -1-0
Val1+-Cys1-Phe0-Glu1--Ala0-Lys1+-Leu0-Gln°-Gly1- -1 Pokud je pK blízké zvolenému pH, pak je přibližně polovina molekul v disociovaném stavu a druhá polovina v nedisociovaném stavu. Peptid s nábojem -1 až 0 nakonec vyteče, neboť se postupně naprotonují všechny aminoskupiny serinu. Peptid s nábojem -1 se na anexu zachytí.
13. Izoelektrické body: Gly(6,1), Asp(2,95), Tyr(5,65), Ala(6,1), His(7,6), Arg(10,75) Pořadí eluce: I.Asp, 2.Tyr, 3.Ala,Gly, 4.His, 5.Arg
14. NH2-Val-Lys-Pro-Gly-COOH, popř. NH2-Val-Lys-Gly-Pro-COOH
15. Po označení 2,4-dinitrofluorbenzenem a úplné hydrolýze získáme ve směsi (Ala+Lys+Glu+Gly) značený alanin a značený lysin, víme také o přítomnosti Glu a Gly. Alanin je tedy na N-konci. Trypsinovou hydrolýzou získáme dva dipeptidy, které rozdělíme iontoměničovou chromatografií při pH=5:
NH2-Ala1+-Lys°-COOH +1 zachytí se na katexu NH2-Glu°-Gly1-COOH -1 vyteče z kolony
Každý z těchto oddělených dipeptidů pak označíme 2,4-dinitrofluorbenzenem a hydrolyzujeme. První peptid poskytne značený alanin a lysin (NH2-Ala-I_ys-?-?). Druhý peptid poskytne značenou kyselinu glutamovou. Výsledná sekvence je tedy: Ala-Lys-Glu-Gly.
Určení sekvence peptidu lze rovněž provést v sekvenátoru za použití Edmanova odbourání (fenylisothiokyanátová metoda).
Pro určování primární struktury peptidů lze využít i reakce s LÍBH4 (redukce -COOH skupiny na -CH2OH), nebo hydrazinolýzy (všechny aminokyseliny se objeví ve výsledné směsi jako hydrazidy, kromě C-koncové aminokyseliny).
16. a) merkaptoethanol: B-S-S-C -> B-SH + C-SH
b) N-konce: Asp, Leu
c) peptid B: ?-?-?-?-Phe-Ala (chymotrypsin)
?-?-Lys-?-Phe-Ala (trypsin)
NH2-Leu-?-Lys-Cys-Phe-Ala-COOH (Sangerova metoda) d) peptid C: aminokyseliny připadající v úvahu: Asp, Lys(?), Cys (určitě, S-S můstek), Gly(?), Glu(?), Met(?)...jedna z aminokyseliny) bude součástí peptidu B NH2-Asp-?-?-?-?
bromkyan: NH2-Asp-?-?-Met-Glu-COOH trypsin: NH2-Asp-Cys-Lys-Met-Glu-COOH peptid B je tedy:
NH2-Leu-Gly-Lys-Cys-Phe-Ala-COOH struktura peptidu P:
(NH2-Asp-Cys-Lys-Met-Glu-COOH SS
NH2-Leu-Gly-Lys-Cys-Phe-Ala-COOH)
17. a) cyklický peptid
47
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
b) NH2-Cys-?-?-?-?-?-Tyr-C00H
c) tripeptid: NH2-Glu-?-Lys-C00H tetrapeptid: NH2-Met-Tyr-?-Arg-C00H sekvence -Glu-Ala-Lys-Met-Tyr-Cys-Arg-
18. thermolysin hydrolyzuje před Leu, Phe, Trp, Tyr, Val
označení aminokyselin ve štěpech po p-merkaptoethanolu: Asn1-Cys2-Phe3-Thr4-Lys5-Lys6-Trp7-Cys8-Arg9-Ala10-Val11-Cys12 Cys13-Thr14-Pro15-Tyr16-Cys17-Phe18-Pro19-Cys20
A) NH2-Val11-Cys12-Cys2- Asn1-COOH
B) NH2-Phe3-Thr4-Lys5-Lys6-COOH
C) NH2-Trp7-Cys8-Arg9-Ala10-COOH
SS
NH2-Tyr16-Cys17-COOH
D) NH2-Phe18-Pro19-Cys20-S-S-Cys13-Thr14-Pro15-COOH disulfidické můstky mezi: Cys2-Cys12
Cys8-Cys17 Cys13-Cys20
N H2-As n-Cys-P he-Th r-Ly^LysjJjp^ys-Arg-Ala-Val-Cys-COOH NH2-Cys-Thr-Pro-Tyr-Cys-Phe-Pro-Cys-COOH
19. N-konec: Thr
C-konec: Val-lle-Leu-Lys-COOH
hydrolýza chymotrypsinem: NH2-Phe-Asp-Val-lle-Leu-Lys-COOH sekvence P: NH2-Thr-Glu-Phe-Asp-Val-lle-Leu-Lys-COOH náboj při pH=6,5: Thr1+-Glu1--Phe0-Asp1-Val0-lle0-Leu0-Lys0, celkově 1-Pokud by byla Glu nahrazena Gin a Asp nahrazena Asn, tak by měl peptid při pH=6,5 náboj 1+, což by nebylo v souladu s podmínkami v zadání úlohy.
20. možné úseky a-šroubovice označeny silně:
- Leu-Ala-His-Thr-Tyr-Gly-Pro-Phe-Glu-Ala-Ala-Met-Cys-His--Glu-Glu-Asp-Pro-Asp-Gly-Met-Gly-Cys-Ala-Phe-His-
při poklesu pH pod disociační konstanty karboxylových kyselin:
- Leu-Ala-His-Thr-Tyr-Gly-Pro-Phe-Glu-Ala-Ala-Met-Cys-His--Glu-Glu-Asp-Pro-Asp-Gly-Met-Gly-Cys-Ala-Phe-His-
Přesné určení sekundární struktury bílkoviny je úkolem pro počítačové modelování.
21. NH2-Ala-Ala-Lys-Ala-Ala-Ala-Phe-COOH
22. Protein má poměrně hodně hydrofobních skupin, díky kterým může dobře kotvit v cytoplasmatické membráně. K určení sekundární struktury by mohla být využita statistická metoda P.Choua a G.Fasmana (1974). Prvním krokem je simultánní hledání "zárodků" tvorby a- a p-struktur. Tvoří je úseky (penta- až hexapeptidy) obsahující minimálně čtyři (u p-struktur tři) zbytky s velkou tendencí tvořit příslušný typ pravidelné sekundární struktury. Největší snahu tvořit a-helix mají methionin, glutamát, leucin a alanin, v p-strukturách se
48
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
vyskytují hlavně valin, isoleucin, fenylalanin a tyrosin. V dalším kroku se "zárodky"
rozšiřují na obě strany, dokud průměrný sklon tetrapeptidu k vytváření a-, resp. p-
struktury neklesne pod kritickou hodnotu. Posléze se vyhledají oblasti protisměrných
ohybů, obsahující především glycin a prolin.
Silně vyznačený úsek bude mít tendenci tvořit a-helix:
Met-Ala-(Leu-Phe-Ala)3-(Leu-Met-Phe)3-Pro-Ans-Gly-Met-Leu-Phe
Při nahrazení Leu zbytkem Asp se sníží hydrofobnost proteinu, zřejmě se také sníží
schopnost tvořit a-helix.
23. b,c,d
24. a) a-šroubovice: 153.0,15 = 22,95nm = 23nm
p-skládaný list: 153.0,36= 55,08nm = 55,1 nm b) a+b=153 a.0,15+b.0,36=42nm a=62 zbytků tvoří a-šroubovici b=91 zbytků tvoří p-skládaný list
25. počet aminokyselin=(0,2.109nm)/0,15nm= 1,3333.109 rychlost syntézy=1,3333.109/(365.24.3600)=42,3 zbytků/sec
26. hmotnost ribozomálních proteinů=25000.(4/3).7i.(9.10-7cm)3.1g/cm3.0,4 = 3,0536.10ug
délka p-šroubovice=(3,0536.10u/120).6,023.1023.0,36=5,5176.107nm=01055m délka jednoho ovinutím. 1 =3,1416|j,m=3141,6nm počet ovinutí=5,5176.107/3141,6=1,76.104 krát
27. V=7i.0,72.280=431,027nm3=4,3103.10"19cm3 m=3.1000.120/(6,023.1023)=5,9771.1019g p=m/V=5,9771.1019g/4,3103.1 Q-19cm3=1,39 q/cm3
28. a)7, b)1, c)3, d)2
B. SACHARIDY
1d 2b 3d
5. 1 -0-methylglukosa;1,2,3,4,6-penta-O-methylgalaktosa; 2,3,4,6-tetra-O-methylgalaktosa
6. glucitol, kys. mannonová, kys. mannarová
7. 2,3,4,6-tetra-O-methylgalaktopyranosa, 2,3,6-tri-O-methylglukopyranosa
9. 2,4,6-tri-O-methyl -D-glukopyranosa, 2,3,4,6-tetra-O-methyl-D-mannopyranosa
10. 2,3,4-tri-O-methyl-D-glukopyranosa, 2,3,4,6-tetra-O-methyl-D-galaktopyranosa
11. 5-O-galaktosyl-D-ribofuranosa
12. 4-O-galaktosyl-D-fruktofuranosa D-glukopyranosyl-D-mannopyranosid uronát
13. 1,4,6-tri-O-methyl-D-fruktosa, 2,3,4,6-tetra-O-methylmannopyranosa
49
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
C. LIPIDY
1 .b) estery 2.d)
4. Pro disociaci první volné -OH skupiny fosfolipidu platí pKa=6,8, pokud je přítomna i poslední -OH skupina v disociovatelné formě, odpovídá její disociační konstanta pK3=12,3.
a) 1-, b)0, c) 0, d)1-, e) 2-, f) 2-, g) 1-
6. pH 5: a)0, b)1+, c)1+, d)0, e)0, f)0, g)0. pH 8: a)1-, b)0, c)0, d)1-, e)2-,f)2-,g)1-.
7. a)1-palmitoyl-2-oleylfosfatidylcholin+tetrabutylamonium hydroxid= glycerolfosfocholin
glycerolfosfocholin+2 palmitoylchlorid= dipalmitoylfosfatidylcholin
b) 1 -palmitoyl-2-oleylfosfatidylcholin+fosfolipáza A2= 1-palmitoylfosfatidylcholin
1 -palmitoylfosfatidylcholin+ stearoylchlorid=1 -palmitoyl-2-stearoylfosfatidylcholin
c) 1-palmitoyl-2-oleylfosfatidylcholin+ tetrabutylamonium hydroxid= glycerolfosfocholin glycerolfosfocholin+ stearoylchlorid=distearoylfosfatidylcholin distearoylfosfatidylcholin+ fosfolipáza D=distearoylfosfatidová kyselina distearoylfosfatidová kyselina+ethanolamin=distearoylfosfatidylethanolamin
D. TERMODYNAMIKA ENZYMOVÝCH REAKCÍ
1. +7,55 kJ.moľ1, -2,85 kJ.moľ1
2. a) -30,5 kJ.moľ1, b) -47,6 kJ.moľ1, c) -53,3 kJ.moľ1
3. -25,7 kJ.moľ1, 7,2.105 mol.ľ1
4. 3,5 mmol.ľ1
5. +31,3 kJ.moľ1, 3,08.104
6. +0,8 kJ.moľ1, -32,6 kJ.moľ1
Hydrolýza difosfátu usnadňuje průběh reakce zleva doprava, posunuje rovnováhu směrem k produktům.
7. +8,4 kJ.moľ1, 0,034, +4,41 kJ.moľ1
8. AG°=12,5 kJ.moľ1, 6,42.103
9. AG°= -9,6 kJ.moľ1, 1,04.103
10. AG°'(1)=-29,25 J.moľ1, AG°=-8,35 J.moľ1, AG=241 J.moľ1
Glykosidovou vazbu sacharosy lze dle štandartní volné energie hydrolýzy považovat za makroergickou vazbu, ale sacharosa se nepovažuje za makroergickou sloučeninu.
11. AG°'(1)= -16,3 kJ.moľ1
AG°= -AG°(1)+ +AG0(2)+AG°(3)-AG°(4) AG°= -1,7 kJ.moľ1
Za podmínek zadaných koncentrací je AG - -27,1 kJ.moľ1
12. AG°'(1)= -1,7 kJ.moľ1 AG°'(spřažená reakce)= -16,3 kJ.moľ1
E. ÚVOD DO ENZYMOLOGIE
1b
2. a-oxidoredutasa
triviálně malátdehydrogenasa
50
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
systematicky malát :NAD+-oxidoreduktasa (u reakcí s NADH jako donorem, či NAD+jako akceptorem se upřednostňuje systematický název donor:NAD+-oxidoreduktasa, a ne NADH:akceptor-oxidoreduktasa) b-transferasa
triviálně alaninaminotransferasa
systematicky L-alanin:2-oxoglutarát-aminotransferasa
jiný název glutamát-pyruvát transaminasa c-hydrolasa
triviálně exoamylasa nebo p-amylasa
systematicky 1,4-a-D-glukan-maltohydrolasa
jiné názvy glykogenasa nebo sacharogenamylasa d- oxidoreduktasa
triviálně methanoldehydrogenasa
systematicky methanol:NAD+-oxidoreduktasa
jiný název formaldehydreduktasa e-transferasa
triviálně hexokinasa
systematicky ATP:fruktosa-fosfotransferasa f-hydrolasa triviálně ureasa
systematicky močovina-amidohydrolasa g-izomerasa
triviálně fosfoglukomutasa
systematicky a-D-glukosa-1,6-fosfomutasa
jiný název glukosafosfomutasa h-ligasa (syntetasa)
triviálně D-alanin-D-alanin ligasa
systematicky D-alanin:D-alanin-ligasa (tvořící ADP)
jiný název D-alanylalanin syntetasa
3. glukokinasa: v=1,5-10-6-[S]/([S]+10-10"3) hexokinasa: v=0,1 -10-6-[S]/([S]+0,1 -103)
nmol.min-1: a) 0,015, 0,05; b) 0,136, 0,0909; c) 0,50, 0,098; d) 1,125, 0,0997 Hexokinasa je při nízkých koncentracích glukosy mnohem výkonnější než glukokinasa, což jí umožňuje zásobovat mozek glukosa-6-fosfátem pro anaerobní glykolýzu i při poklesu hladiny glukosy v krvi. Tím je mozek chráněn proti náhlému nedostatku energie. Glukokinasa v játrech se podílí na regulaci glukosy v krvi tím, že ji při vysokých koncentracích intenzivně převádí na glukosa-6-fosfát jako výchozí sloučeninu pro syntézu glykogenu.
4. 0,00488 umoLmirv1
5. Km=9,009-10"6 mol ľ1, viim=45,045 umol.mirv1
6. kompetitivní inhibici lze zrušit přebytkem substrátu
7. Km=1,17 mmol.ľ1, viim =0,586 mmol.min1
8. Km = 0,85 mmol.ľ1, viim = 0,100 umol.min1
51
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
9. Km = 1,76mmol.ľ1, viim = 9,52 nmol.s1
10. látkové množství enzymu: 6,25-1013 mol aktivita=6,25-1013-2500=1,56nkat=0,0936 uJTiol.mirr1
11. látkové množství enzymu: 2,0833-1012 mol
číslo preměny=20-10-6/(60-2,0833-10-12)=160 000 s1
F. GLYKOLÝZA, METABILOSMUS SACHARIDŮ
1. C2 obou trios
2. 2,5
3. ne
4. 2 glyceraldehyd-3-P + H2O -»fruktosa-6-P + P
5. fruktosa-6-P + 2 P + ADP+ 2 NAD+ -» 2 kys.3-P-glycerová + ATP + 2 NADH + 2 H+ 1 NADH je ekvivalentní 3ATP
fruktosa-6-P + 8 P + 7 ADP -» 2 kys.3-P-glycerová + 7 ATP
6. pyruvát, laktát, alanin
7. a) hexokinasa
fruktosa + 2 ATP + 2 NAD+ + 2 P + 4 ADP^ 2 pyruvát + 2 ADP + 2 NADH + 2 H+
+ 4 ATP
fruktosa + 8ADP + 8P^2 pyruvát + 8 ATP b) fruktokinasa
fruktosa + 2 ATP + 2 NAD+ + 2 P + 4 ADP^ 2 pyruvát + 2 ADP + 2 NADH + 2 H+
+ 4 ATP
fruktosa + 8ADP + 8P^2 pyruvát + 8 ATP
8. a) fruktosa-1,6-bisP + 2 NAD+ + 2 P + 2 ADP -» 2 fosfoenolpyruvát + 2 NADH + 2H+
+ 2 ATP + 2 H2O
b) neproběhne, nevzniká ATP (arseničnan nahrazuje v reakcích fosfát, ale estery s arseničnanem okamžitě hydrolyzují) fruktosa-1,6-bisP + 2 NAD+ + 2 HAsCU2" + 2 H20^ 2 fosfoenolpyruvát + 2 NADH
+ 2H+ + 2 HAsC-42- + 2 H2O
9. methylová skupina v obou případech
10. 0,22 GAP a DHAP, 0,78 mM FBF
11. mechanismus aldolové kondenzace
12. odštěpí se jako 14C02
13. C3, C4
14. i) fruktosa-1,6-bisP + ADP-» fruktosa-6-P + ATP NEPROBÍHÁ(AG°=+14,2kJ/mol)
ve skutečnosti:
fruktosa-1,6-bisP + H2O -»fruktosa-6-P + P FRUKTOSABISFOSFATASA
ii) glukosa-6-P + ADP -» glukosa + ATP NEPROBÍHÁ(AG°=16,7kJ/mol) ve skutečnosti:
glukosa-6-P + H2O -» glukosa + P GLUKOSA-6-FOSFATASA
iii) pyruvát + ATP -» fosfoenolpyruvát + ADP      NEPROBÍHÁ (AG°= +31 kJ/mol) ve skutečnosti:
a) fosfoenolpyruvátsynthetasa (bakterie)
52
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
b) pyruvát + ATP + CO2 -» oxalacetát + ADP + P oxalacetát + GTP -»fosfoenolpyruvát + GDP + CO2 Přes nepříznivé AG° probíhá reakce:
fruktosa-1,6-bisP -» glyceraldehydfosfát + dihydroxyacetonfosfát
15. hromadí se dihydroxyacetonfosfát dle výsledné bilanční rovnice:
glukosa + P -» dihydroxyacetonfosfát + laktát   NEPRODUKUJE SE ENERGIE!
16. LDH srdečního svalu (izoenzym H4) je vhodnější pro oxidaci laktátu na pyruvát. Pokud by se zde uplatnila LDH kosterního svalu, mohl by se v srdečním svalu hromadit laktát.
LDH kosterního svalu (izoenzym IVU) je lépe uzpůsobena pro oxidaci pyruvátu na laktát, což umožňuje kosternímu svalu pracovat na "kyslíkový dluh". Při nedostatku kyslíku se hromadí NADH vznikající při anaerobní glykolýze a likviduje se redukcí pyruvátu na laktát (únava). Svalové buňky předávají laktát do krve, následně může být v játrech přeměněn na glukosu.
17. I) pyruvát + ATP + CO2 -» oxalacetát + ADP + P
II) oxalacetát + GTP -»fosfoenolpyruvát + CO2 + GDP Souhrnná reakce:
pyruvát + 2 ATP -»fosfoenolpyruvát + 2 ADP + P
[součet: a) pyruvát + ATP -»fosfoenolpyruvát + ADP (AG°= +31 kJ/mol)
b) ATP - ADP + P (AG°= -30,5kJ/mol)]
AG°(celk) = +0,5 kJ/mol
G. CITRÁTOVÝ CYKLUS
1. malát + NAD+ -» oxalacetát + NADH + H+ citrát -»isocitrát
2. b,e
3. a,b
4. oxoglutarát + NAD+ + GDP + P -»jantaran + CO2 + NADH + H+ + GTP
5. Ki=0,0336397 K2=2,3444484
citrát -» isocitrát, AG°= 6,29 kJ/mol, K=0,0788666
cis-akonitát/citrát=0,0336, isocitrát/cis-akonitát=2,3444, isocitrát/citrát=0,07887 [citrát]=1, [isocitrát]=0,07887, [cis-akonitát]=0,03364, tedy 0,079:1:0,034
6. postupným sčítáním reaktantů a produktů dostaneme bilanční rovnice:
a) citrát + 3 NAD+ + GDP + P + FAD + H2O -» oxalacetát + 2CO2 + 3 NADH + 3H+ +
+ GTP + FADH2
b) jantaran + FAD + H2O + NAD+ -» oxalacetát + FADH2 + NADH + H+
c) malát + NAD+ -» oxalacetát + NADH + H+
7. U tohoto typu úloh se uvažuje pouze první průchod cyklem trikarbonových kyselin, v dalších krocích by se značený 14C objevoval i v jiných pozicích.
a) uvolní se jako 14C02
b) C1 oxalacetátu
c) C2 a C4 oxalacetátu 10. v citrátu na C2
53
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
v isocitrátu na C2 a C4 8. reakce s FAD: AG°=5,98 kJ/mol reakce s NAD+: AG°=67,7 kJ/mol
H. RESPIRAČNÍ ŘETĚZEC
I. jednoelektronové: cyt c, cyt b, cyt a, UQ dvouelektronové: NADH
NADH + H+ + UQ -» NAD+ + UQH2 UQH2 + cyt c (ox) -» UQH- + H+ + cyt c (red) UQH2 + 2 cyt c (ox) -» UQ + 2H+ + 2 cyt c (red) cyt c (red) + cyt b (ox) -» cyt c (ox) + cyt b (red) 2 cyt a (red) + 1/2 02 + 2H+^ 2 cyt a (ox) + H2O cyt c (red) + cyt a (ox) -» cyt c (ox) + cyt a (red)
2. Ve vzorci AG°= -n • F • AE° se při výpočtu AE° odečítá od redoxního potenciálu složky, která vystupuje na levé straně rovnice v oxidované podobě, redoxní potenciál složky, která je zde v podobě redukované.
a) NADH + H+ + UQ -» NAD+ + UQH2 E0/nad+= -0,32V
E0/uq= +0,1 OV
AG°= -n • F • AE°= -2 • 96500 • (0,10-(-0,32))= -81,06 kJ/mol Kryta energetická spotřeba vzniku dvou ATP.
b) jantaran + UQ -»fumarát + UQH2 E0/fum= 0,031 V
E0/uq=0,10V
AG°= -n • F • AE°= -2 • 96500 • (0,1-0,031)- -13,317 kJ/mol
c) 2 cyt b (red) + 2 cyt c (ox) -» 2 cyt b (ox) + 2 cyt c (red) AG°= -n • F • AE°= -2 • 96500 • (0,235-0,03)- -39,57 kJ/mol Kryta energická spotřeba vzniku jednoho ATP.
d) 2 cyt c (red) + 1/2 O2 + 2H+ -» 2 cyt c (ox) + H2O
AG°= -n • F • AE°= -2 • 96500 • (0,816-0,235)- -112,13 kJ/mol Kryta energetická spotřeba vzniku tří ATP.
3. a) NADH + 1/2 O2 + H+ -» NAD+ + H2O
AG°= -n • F • AE°= -2 • 96500 • (0,816-(-0,32))= -219,25 kJ/mol Teoreticky by vzniklo 7,3 molů ATP. b) NADH + 2 [Fe(CN)6]3- -» NAD+ + H+ + 2 [Fe(CN)6]4" AG°= -n • F • AE°= -2 • 96500 • (0,36-(-0,32)= -131,24 kJ/mol Teoreticky by vzniklo 4,4 molů ATP.
4. jantaran + 2 ADP + 112 O2 -»fumaran + 2 ATP + H2O + 2P isocitrát + 7 ADP + 7P + O2 -» jantaran + 2 CO2 + 7 ATP + 2 H2O jantaran + 5 ADP + 5P + O2 + H2O -» oxalacetát + 5 ATP + 2 H2O
5. Antimycin je inhibitorem komplexu III, zasahuje v místě cytochromu bci.
6. fumaran + 3 ADP + 3P + I/2O2 -» oxalacetát + 3 ATP + H2O
54
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
2-oxoglutarát + 6 ADP + 6P + O2 -»fumaran + 6 ATP + CO2 + H2O 7. AG°= -n • F • AE°= -2 • 96500 • (0,03-(-0,32))= -67,55 kJ/mol Tato reakce by mohla být využita k syntéze 2,2 molů ATP.
I. FOTOSYNTÉZA
1. souhrnná rovnice pro fotosystém I:
2 PSI* (red) + NADP+ + H+ -» 2 PSI (ox) + NADPH
souhrnná rovnice pro fotosystém II:
4 PSU (ox) + 2 H2O -» 4 PSU (red) + O2 + 4 H+
souhrnná rovnice pro oba fotosystémy:
2 H2O + 2 NADP+ -» O2 + 2H+ + 2 NADPH
temná fáze fotosyntézy:
3C02 + 6NADPH + 6H+ + 9 AT P -» glyceradehydfosfát + 6NADP + 9ADP + 8P +
3H20
2. 2 ferredoxin (red) + NADP + H+ -» 2 ferredoxin (ox) + NADPH AG°= -21 kJ/mol
AE°= 0,106 V
3. na C1 v prvním případě, na C3 ve druhém případě
4. lokalizace: chloroplasty (NADPH) X cytoplazma (NADH)
5. 2 fotosystém I (red) + NADP + H+ -» 2 fotosystém I (ox) + NADPH AE°nadp= -0,324 V
základní stav:
AG°= -n • F • AE°= -2 • 96500 • (-0,324-0,46)
AG°= 151,312 kJ/mol= -R • T • ln([fot I (ox)]2 • [NADPH]/ [fot I (red)]2 • [NADP]) [NADPH] / [NADP] - 2.995 • 10"27 excitovaný stav:
AG°= -n • F • AE°= -2 • 96500 • (-0,324-(-0,60)) AG°= -53,268 kJ/mol= -R • T • InK [fot I (ox)]2 • [NADPH]/ [fot I (red)]2 • [NADP]- 2,175 • 109 [NADPH] / [NADP] = 2,175 • 109
6. 2 ferredoxin (red) + NADP + H+ -» 2 ferredoxin (ox) + NADPH AG°= -n • F • AE°= -2 • 96500 • (-0,324-(-0,43))= -20,46 kJ/mol AG - AG° + R • T • In ([ferr(ox)]2 • [NADPH]/[ferr(red)]2- [NADP])
AG = -20460 + 8,31 • 298 • In (100)= -9056 J/mol...samovolný průběh poměr v rovnováze: ferr(ox)/ferr(red)= 6,2
Redukovaný ferredoxin je schopen redukovat NADP, dokud se poměr ferr(ox)/ferr(red) nezmění z 1 na 6,2.
7. diuron zasahuje v místě komplexu bef
8. Jedná se o zelené sirné bakterie (rod Chlorobium) patřící mezi obligátně fototrofní organismy. Jsou inhibovány vyšší tenzí O2.
rovnice fotosyntézy: 2H2S + CO2 -» {CH2O} + H2O + 2S, kde {CH2O} je např.cukr
55
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018 J. NUKLEOVÉ KYSELINY 2. A260=[AMP] • s26o(AMP) + [GMP] • s26o(GMP)
A280=[AMP] • s28o(AMP) + [GMP] • s28o(GMP)
[GMP]-3,07.10-5 mol/l, [AMP]=1,90.105 mol/l
4. RNA 321, DNA 309
5. a/ UpCpUpApGpA
b/ Up+ CpUpApGpAp, Up+Cp+UpApGpAp, Up+Cp+Up+ApGpAp atd. cl UpCpUpApG+pAp, UpCpUpA+pG+pAp, UpCpU+pA+pG+pAp atd. dl UpCpUpA+pGpAp e/ UpCpU+pA+pG+pAp
6. fosfodiesteráza hadího jedu: 32pApCpTpTpA+pG, 32pApCpTpT+pA+pG, 32pApCpT+pT+pA+pG, 32pApC+pT+pT+pA+pG (poslední dinukleotid nechá nerozštěpený)
deoxyribonukleáza II: 32pAp+CpTpTpApG, 32pApCp+TpTpApG, 32pApCpTp+TpApG, 32pApCpTpTp+ApG, 32pApCpTpTpAp+G a další 8. a) pC...je na volném 3' konci RNA
b) pankreatická ribonukleáza rozštěpí Polynukleotid (psáno od 5'konce k 3'konci) za U aC
možnosti: ACAGUC ACGAUC GAUACC AGUACC
c) A bude na začátku
možnosti: AGCAUC... vy řazeno z důvodů b) ACGAUC
AGCACU...nesplňuje podmínku a) ACGACU...nesplňuje podmínku a) řešení:(pApCpGpApL)pC)
8. (-ATAGGCTTAGTACCA-)
9. -TCGCATC-, -UCGCAUC-
10. a/ GATCAA palindrom:GATC
CTAGTT CTAG b/TGGAAC palindrom není
ACCTTG cl GAATTC   celé palindrom
CTTAAG dl ACGCGT   celé palindrom
TGCGCA e/CGGCCG celé palindrom
GCCGGC f/TACCAT   palindrom není
ATGGTA
11. 617,5; 1,82.106 Da, 3,02.10"18g
12. a) 1,43.1011 Da
b) 2,32.108 pb, 0,079 m
56
V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
13. 67,2% G+C, 32,8% A + T, molární poměr purinových a pyrimidinových bazí je 1:1, molární složení: 33,6 % G, 33,6% C, 16,4% A, 16,4% T
14. Phe^-Leu, Ala^Thr, Ile^-Leu, Pro^-Ser-
15. a) 8500 pb
b) rozdíl v molekulové hmotnosti je 5,25.106 Da, což je 8,72.1018 g
c) 2833 kodonů a tedy aminokyselin, což je 3,97.105 Da
16. 100 řetězců, průměrná délka 300 bazí (za předpokladu, že polymerace proběhne v obou pokusech stejně)
17. TTC GAApro Phe a Glu,
TTT GAG ATC TTG GAG CGG CGG nebo TTT GAG ATC TTA GAG CGG CGG
18. a)jednoduchá šroubovice
b) G 19%, T 25%, A 33%, C 23%
c) G 21%, T 29%, A 29%, C 21%
d) nový řetězec DNA
19. frekvence kodonů:
UUU    0,9.0,9.0,9-72,9% Phe
UUC   0,9.0,9.0,1-8,1% Phe
UCU 8,1% Ser
CUU 8,1% Leu
UCC 0,9% Ser
CUC 0,9% Leu
CCU 0,9% Pro
CCC 0,1% Pro
Po součtu dostáváváme teoretické aminokyselinové složení shodné s experimentálním.
20. frekvence kodonů:
GGG 12,5% Gly
GAA 12,5% Glu
AGA 12,5% Arg
AAG 12,5% Lys
GGA 12,5% Gly
GAG 12,5% Glu
AGG 12,5% Arg
AAA 12,5% Lys
Syntezovaný polypeptid bude obsahovat 25% glutamátu.
21. strukturní gen: 750 nukleotidů (+ iniciační a terminační kodony) serin je v aktivním centru
K. REDOXNÍ REAKCE
1. E=-0,35 V
2. doleva, doprava, doleva, doprava
3. Při výpočtu AE° odečítá od redoxního potenciálu složky, která vystupuje na levé straně rovnice v oxidované podobě, redoxní potenciál složky, která je zde v podobě redukované.
+29,7kJ/mol, 6,13.10 6
57
_V.Mikeš: Úlohy z biochemie. Masarykova univerzita, Brno, 1993, revize P. Bouchal, 2018
4. [Iaktát]/[pyruvát]=1
AE°= E0/lak- E0/nad=-0,185-(-0,32)=0,135V
AE°= (RT/n-F) • ln([laktát]-[NAD+]/[pyruvát]-[NADH])
[NAD+]/[NADH]=3,71- 104
5. AE°= -0,32-(-0,031 )= -0,351 V AG°= 67,7 kJ/mol
AG= AG° + RT- In ([fumaran]-[NADH]/Oantaran]-[NAD+])-+60,3 kJ/mol
6. AE°=0,104-(-0,32)=0,424V AG°= -81,8kJ/mol
AG= AG° + RT- In ([UQH2]-[NAD+]/[UQ]-[NADH])- -68,7 kJ/mol
7. AE°= 0,03-(-0,58)=0,61V AG°=-117,7kJ/mol Reakce probíhá doprava.
8. AG°= -14,5 kJ.moľ1 Reakce probíhá doprava.
9. AG°= -83 kJ.mol-1, 2-3 molekuly ATP
10. [alkohol]=(5/46,0829)/0,1= 1,0854mol/l AE°=0,123V
AG°= -23,74 kJ/mol [NAD+]/[NADH+]=6,71
11. NAD+:
AE°=0,26 V, AG°= -50,2 kJ/mol, AG= -61,6 kJ/mol FAD:
AE°=0,58 V, AG°= 111,9 kJ/mol, AG= 100,5 kJ/mol
58