jména: obor: OKRUHY K PŘÍPRAVĚ Oxidačně-redukční reakce. Donory a akceptory elektronů. Respirační řetězce mitochondrií a bakterií. PRINCIP ÚLOHY Mezi procesy v živých systémech zaujímají významné místo oxidačně-redukční (redoxní) reakce, při kterých se mezi reaktanty přenášejí elektrony (obecněji tzv. „redukční ekvivalenty“). Donor je ztrácí, tj. oxiduje se, zatímco akceptor je přijímá, tj. je redukován. Některé redoxní reakce probíhají značnou rychlostí spontánně (např. přeměny volných radikálů), většina ovšem vyžaduje katalýzu specifickými enzymy z třídy oxidoreduktas. Tak například cytoplazmatický enzym laktátdehydrogenasa (laktát:NAD^+-oxidoreduktasa, EC 1.1.1.27) při nedostatku kyslíku v pracujícím svalu redukuje pyruvát (akceptor) na L-laktát (redukovaný akceptor); NADH (donor) přitom přechází na NAD^+ (oxidovaný donor) . V játrech probíhá obrácená reakce mezi L-laktátem (zde donor) a NAD^+ (zde akceptor). Oxidoreduktasy známe jak rozpustné, tak i vázané na biologické membrány. Některé membránové oxidoreduktasy mohou vzájemně spolupracovat tím, že produkt předchozího enzymu (redukovaný akceptor) zastává funkci donoru pro enzym následující. Funkční seskupení enzymů a elektronových přenašečů, které uskutečňuje sérii následných redoxních reakcí vázaných na biologickou membránu, nazýváme řetězec přenosu elektronu (angl. electron transfer chain). Krátké řetězce přenosu elektronu typicky nacházíme v endoplasmatickém retikulu, kde se uplatňují při syntéze nenasycených mastných kyselin, steroidních hormonů a transformacích cizorodých látek. Z hlediska energetiky buňky mají zásadní význam dlouhé řetězce obsažené v membránách přeměňujících energii (vnitřní mitochondriální membrána, cytoplazmatická membrána bakterií, membrána tylakoidu chloroplastu). Přenos redukčních ekvivalentů se v nich uskutečňuje napříč lipidovou dvojvrstvou a je spojen se vznikem transmembránových rozdílů elektrického potenciálu a pH. Ty spolu tvoří tzv. „protonový gradient“, formu energie využitelnou k tvorbě adenosintrifosfátu (ATP) z adenosindifosfátu (ADP) a fosfátu (Pi). Vstupním donorem mitochondriálního řetězce přenosu elektronu bývá NADH (oxiduje se na NAD^+) nebo sukcinát (oxiduje se na fumarát) a konečným (terminálním) akceptorem je kyslík (redukuje se na vodu). Protože se zde spotřebovává vdechovaný kyslík, hovoříme o mitochondriálním respiračním řetězci (respirace = dýchání). U bakterií může být kyslík nahrazen jiným terminálním akceptorem, např. dusičnanem nebo síranem (anaerobní respirace). V chloroplastu se při tzv. světelné fázi fotosyntézy oxiduje voda na kyslík a NADP^+ se redukuje na NADPH. Elektrony zde tedy tečou „obráceně“ než při respiraci. Aby to bylo energeticky možné, obsahuje zde přítomný řetězec dva fotosystémy (fotosystém I a II), schopné využívat k pohonu redoxních reakcí energie slunečního záření (fotosyntetický přenos elektronu). Oproti rozpustným enzymům mají membránové respirační a fotosyntetické řetězce značně složitější stavbu. Pro jejich snazší studium se proto někdy nejdříve rozdělují na menší součásti například pomocí solubilizace neiontovými detergenty a následné chromatografie. Separace funkční využívá umělých donorů a akceptorů, kombinovaných případně se specifickými inhibitory. Umělý donor je nefyziologická redoxaktivní látka, která dodává elektrony definované složce elektrontransportního řetězce; umělý akceptor naproti tomu z určitého místa řetězce elektrony odebírá. Protože oxidovaná a redukovaná forma těchto látek se liší svými absorpčními spektry, lze jejich vzájemné přeměny sledovat jako změny absorbance. Inhibitor se váže na některou oxidoreduktasu řetězce a brání průběhu jí katalyzované reakce. Metodu funkční separace u respiračního řetězce si budeme ilustrovat pomocí následujícího schématu: NADH kyslík A A[red] D D[ox] I[1] I[2] NAD^+ voda Respirační inhibitory I[1] i I[2] blokují přenos elektronů ze sukcinátu na kyslík, nebrání však redukci umělého akceptoru A sukcinátem. Enzymová oxidace umělého donoru D kyslíkem je inhibována I[2], ale nikoli I[1]. Měřením vlivu inhibitorů na jednotlivé reakce tedy můžeme získat relativní pořadí míst interakce donorů, akceptorů (A) a inhibitorů (I) s řetězcem (v uvedeném schématu A, I[1], D, I[2]). CÍL PRÁCE Inhibitory respiračního řetězce bakterie Paracoccus denitrificans Cytoplazmatická membrána aerobně rostlé půdní bakterie P. denitrificans obsahuje respirační řetězec, který se podobá respiračnímu řetězci mitochondrií. Přenos elektronů z NADH na kyslík může být inhibován kyanidem, malonátem a antimycinem. Místa zásahu uvedených inhibitorů a zda skutečně inhibují budete v úloze analyzovat s využitím redoxaktivních látek 2,6-dichlorfenolindofenolu (DCIP) a N,N,N´,N´-tetramethyl-p-fenylendiaminu (TMPD). Před vlastními experimenty s biologickým materiálem si u DCIP a TMPD jednoduchými chemickými zkouškami ukážete existenci redoxních přechodů, jež jsou provázeny barevnými změnami. Obrázek 1: Respirační řetězec na membráně mitochondrií Sukcinát Cytoplasma Periplasmatický prostor Obrázek 2: Respirační řetězec na membráně bakterie Paracoccus denitrificans Srovnání – komplex I = NDH (NADH dehydrogenáza), komplex II = SDH (sukcinát dehydrogenáza), komplex III = bc1 komplex s FeS klastrem, cyt c = cyt c550 nebo cyt c552, komplex IV = aa3 komplex (cyt c oxidáza), bakterie má navíc cbb3 komplex a ba3 komplex jako alternativní terminální elektronové akceptory, jantaran = sukcinát PRAKTICKÁ ČÁST. Inhibitory respiračního řetězce bakterie Paracoccus denitrificans Materiál a vybavení: membrány z buněk Paracoccus denitrificans (cca 1-5 mg proteinu/ml) 10 mmol.l^-1 DCIP 0,1 mol.l^-1 TMPD kyselina askorbová - krystalky peroxodisíran amonný - krystalky 50 mmol.l^-1 Tris-Cl (pH = 7,3) 50 mmol.l^-1 sukcinát sodný 0,1 mol.l^-1 kyselina malonová 1,0 mg.ml^-1 roztok antimycinu (v ethanolu!) 0,1 mol.l^-1 kyanid sodný mikrotitrační destička, mikropipety, špachtlička, stopky, jehla na míchání Upozornění: umělohmotné špičky k mikropipetám vyměňujte za nové tak, aby nedocházelo ke kontaminaci vzorku – např. jinými inhibitory. Pokud máte směs v jamce mikrotitrační destičky zamíchat, proveďte míchání buď špičkou z mikropipety, kterou jste použili jako poslední nebo jehlou. Míchejte jen jednou, a to bezprostředně po napipetování posledního z roztoků! Později nemíchat! Dodržujte bezpečnostní zásady při práci s chemikáliemi, jsou toxické! Postup: EXPERIMENT 1 0,1M roztok TMPD připravte přídavkem 1 ml vody do mikrozkumavky s navážkou pevného TMPD (Mr = 164,25). TMPD se oxiduje vzdušným kyslíkem na Wursterovu modř. Jestliže je roztok TMPD, který jste připravili, zbarven modře, přidejte k němu malý krystalek kyseliny askorbové a promíchejte – dojde k odbarvení roztoku. V experimentech (1 a 2) používejte bezbarvý 0,1 mol.l-1 roztok TMPD. V jamkách mikrotitrační destičky proveďte následující reakce – dávkujte podle tabulky: oxidační činidlo – peroxodisíran amonný, krystalky redukční činidlo – kyselina askorbová, krystalky jamka č. 20 mmol.l^-1 DCIP H[2]O pozorování 1 20 μl 180 μl 2-3 krystalky oxidačního činidla modrá → 2 20 μl 180 μl 2-3 krystalky redukčního činidla modrá → jamka č. 0,1 mol.l^-1 TMPD H[2]O pozorování 3 20 μl 180 μl 2-3 krystalky oxidačního činidla bezbarvá → 4 20 μl 180 μl 2-3 krystalky redukčního činidla bezbarvá → Vyhodnocení: Na základě svých pozorování (alespoň 5 minut) vyberte správné varianty: DCIP oxidovaná forma: BEZBARVÁ/BAREVNÁ, elektronový DONOR/AKCEPTOR redukovaná forma: BEZBARVÁ/BAREVNÁ, elektronový DONOR/AKCEPTOR TMPD oxidovaná forma: BEZBARVÁ/BAREVNÁ, elektronový DONOR/AKCEPTOR redukovaná forma: BEZBARVÁ/BAREVNÁ, elektronový DONOR/AKCEPTOR Výsledky pokusu znázorněte pomocí šipek: EXPERIMENT 2 Dávkujte do mikrotitrační destičky jak je uvedeno v jednotlivých řádcích tabulky - rychle, bez časových prodlev. TMPD přidejte do jamek č. 1-4 jamek až budete mít napipetovány roztoky ve všech řádcích, jak je uvedeno v tabulce. Ihned po přidání TMPD směs zamíchejte (jehlou). Po přidání TMPD do poslední jamky zapněte stopky. jamka č. membrány Inhibitor 50 mmol.l^-1 Tris-Cl 0,1 mol.l^-1 TMPD Voda 1 10 μl - bez inhibitoru 190 μl 5 μl 50 μl 2 10 μl 10 ul NaCN (0,1 mol.l^-1) 190 μl 5 μl 40 μl 3 10 μl 5 ul kys. malonová (0,1 mol.l^-1) 190 μl 5 μl 45 μl 4 10 μl 5 ul antimycin (1,0 mg.ml^-1) 190 μl 5 μl 45 μl Sledujte časový průběh barevných změn v jednotlivých jamkách a svoje pozorování zapište: jamka č. 1: bezbarvá → jamka č. 2: bezbarvá → jamka č. 3: bezbarvá → jamka č. 4: bezbarvá → Vyhodnocení: TMPD působí jako elektronový DONOR/AKCEPTOR Před místem napojení TMPD inhibuje KYANID – MALONÁT – ANTIMYCIN Za místem napojení TMPD inhibuje KYANID – MALONÁT – ANTIMYCIN Místo napojení TMPD na respirační řetězec a místa zásahu inhibitorů schematicky zaznamenejte: Sukcinát Fumarát EXPERIMENT 3 Dávkujte do mikrotitrační destičky, jak je uvedeno v jednotlivých řádcích tabulky - rychle, bez časových prodlev. DCIP přidejte do jamek č. 1-3 jamek až budete mít napipetovány roztoky ve všech řádcích, jak je uvedeno v tabulce. Ihned po přidání DCIP směs zamíchejte (jehlou). Po přidání DCIP do poslední jamky zapněte stopky. jamka č. membrány 50 mmol.l^-1 sukcinát sodný Inhibitor 50 mmol.l^-1 Tris-Cl 10 mmol.l^-1 DCIP Voda 1 10 μl 5 μl - bez inhibitoru 190 μl 5 μl 45 μl 2 10 μl 5 μl 10 ul NaCN (0,1 mol.l^-1) 190 μl 5 μl 35 μl 3 10 μl 5 μl 5 ul kys. malonová (0,1 mol.l^-1) 190 μl 5 μl 40 μl Sledujte časový průběh (cca 10 minut) barevných změn v jednotlivých jamkách a svoje pozorování zapište: jamka č. 1: modrá → jamka č. 2: modrá → jamka č. 3: modrá → Vyhodnocení: DCIP působí jako elektronový DONOR/AKCEPTOR Před místem napojení DCIP inhibuje KYANID – MALONÁT Za místem napojení DCIP inhibuje KYANID – MALONÁT Místo napojení DCIP na respirační řetězec a místa zásahu inhibitorů schematicky zaznamenejte: Sukcinát Fumarát EXPERIMENT 4 Jestliže je roztok 0,1 mol.l^-1 TMPD, který máte k dispozici, bezbarvý, připravte si z něj Wursterovu modř tak, že 200 μl 0,1 mol.l^-1 TMPD zředíte ve zkumavce 200 μl destilované vody a přidáte několik krystalků peroxodisíranu sodného (viz experiment 1). Jestliže má tmavé zbarvení, není potřeba jej upravovat (Wursterova modř vznikla oxidací TMPD vzdušným kyslíkem). Pak dávkujte do mikrotitrační destičky, jak je uvedeno v jednotlivých řádcích tabulky – rychle, bez časových prodlev. Wurstrovu modř přidejte do jamek č. 1-3 až budete mít napipetovány roztoky ve všech řádcích, jak je uvedeno v tabulce. Ihned po přidání Wurstrovy modři směs zamíchejte (jehlou). Po přidání Wurstrovy modři do poslední jamky zapněte stopky. jamka č. membrány 50 mmol.l^-1 sukcinát sodný Inhibitor 50 mmol.l^-1 Tris-Cl Wursterova modř Voda 1 10 μl 5 μl - bez inhibitoru 190 μl 5 μl 45 μl 2 10 μl 5 μl 10 ul NaCN (0,1 mol.l^-1) 190 μl 5 μl 35 μl 3 10 μl 5 μl 5 ul kys. malonová (0,1 mol.l^-1) 190 μl 5 μl 40 μl Sledujte časový průběh (přibližně 10 minut) barevných změn v jednotlivých jamkách a svá pozorování zapište: jamka č. 1: modrá → jamka č. 2: modrá → jamka č. 3: modrá → Vyhodnocení: Wursterova modř působí jako elektronový DONOR/AKCEPTOR Před místem napojení Wursterova modř inhibuje KYANID – MALONÁT Za místem napojení Wursterova modř inhibuje KYANID – MALONÁT Místo napojení Wursterovy modři na respirační řetězec a místa zásahu inhibitorů schematicky zaznamenejte: Sukcinát Fumarát EXPERIMENT 5 Jestliže je roztok 0,02 mol.l^-1 DCIP, který máte k dispozici, modrý, připravte si z něj redukovaný DCIP tak, že 150 μl 0,02 mol.l^-1 DCIP zředíte ve zkumavce 100 μl 0,02 mol.l^-1 kyseliny askorbové. Jestliže je roztok po smíchání oranžový nebo se úplně odbarví, není potřeba jej upravovat. Potom dávkujte do mikrotitrační destičky jak je uvedeno v jednotlivých řádcích tabulky - rychle, bez časových prodlev. Redukovaný DCIP přidejte do jamek č. 1-3 jamek až budete mít napipetovány roztoky ve všech řádcích, jak je uvedeno v tabulce. Ihned po přidání redukovaného DCIP směs zamíchejte (jehlou). Po přidání redukovaného DCIP do poslední jamky zapněte stopky. jamka č. membrány Inhibitor 50 mmol.l^-1 Tris-Cl 10 mmol.l^-1 red. DCIP Voda 1 10 μl - bez inhibitoru 190 μl 5 μl 50 μl 2 10 μl 10 ul NaCN (0,1 mol.l^-1) 190 μl 5 μl 40 μl 3 10 μl 5 ul kys. malonová (0,1 mol.l^-1) 190 μl 5 μl 45 μl Sledujte časový průběh (max. 10 minut) barevných změn v jednotlivých jamkách a svoje pozorování zapište: jamka č. 1: bezbarvá → jamka č. 2: bezbarvá → jamka č. 3: bezbarvá → Vyhodnocení: Redukovaný DCIP působí jako elektronový DONOR/AKCEPTOR Před místem napojení redukovaného DCIP inhibuje KYANID – MALONÁT Za místem napojení redukovaného DCIP inhibuje KYANID – MALONÁT Místo napojení redukovaného DCIP na respirační řetězec a místa zásahu inhibitorů schematicky zaznamenejte: Sukcinát Fumarát Do následujícího závěrečného schématu respiračního řetězce zakreslete ve správném pořadí místa napojení DCIP, TMPD, Wursterovy modři a redukovaného DCIP a místa inhibice kyanidem, malonátem a antimycinem. kyslík Sukcinát Fumarát voda > V dalším obrázku se pokuste zakreslit konkrétní místa napojení DCIP a TMPD a místa zásahu inhibitorů (malonát, antimycin, kyanid).