Chromatografické metody I. Literatura Historie chromatografie u1906 Tswett (Cvět) uPoprvé použit pojem chromatografie, chromatogram z řeckých slov chroma (barva) a grafein (psáti). u u1931 Kuhn a Lederer uznovu objevení chromatografie u u1940-49 Martin Synge uPapírová a tenkovrstvá chromatografie u Historie chromatografie u1950 Aminokyselinový analyzátor u u1950-1960 uSober, Peterson a Gutter zavedli používání médií na bázi celulosy (iontoměniče). u uPorath a Flodin poprvé použili média na bázi dextranu pro gelovou filtraci. u uHjerten popsal použití separačních médií na bázi agarosy. u u Historie chromatografie u1970-79 Halasz, Horvath, Kirkland uHPLC (“High Performance Liquid Chromatography”) u u1980-1989 Pharmacia uNová média s vyšší mechanickou odolností ( CL-agarosa, “cross-linked”) umožňují použití vyšších tlaků pro separaci; nový střednětlaký systém “Fast Protein Liquid Chromatography” (FPLC) u u2004 Waters uUPLC (“Ultra Performance Liquid Chromatography”) u u Mikhail Semyonovich Tsvet Chromatographia 1906 Podstata u u„Při chromatografii dochází uk neustálému vytváření u rovnovážných stavů separované látky mezi dvě fáze – stacionární a umobilní.“ Chromatografie obr22 Chromatografie uMobilní fáze - kapalina – LC u plyn – GC u uEluce - Izokratická – stejná eluční síla u Gradientová – rostoucí eluční síla u uPoužití - analytická u preparativní Kapalinová chromatografie LC u u uMobilní fáze - kapalina u uStacionární fáze - pevná fáze, u kapalina Provedení LC u uPapírová PC u uTenkovrstvá TLC u uKolonová CC Teoretické aspekty chromatografie Teorie „Ideální lineární chromatografie“ Martin, Synge Martin Synge Nobelova cena za chemii 1952 Teorie „Ideální lineární chromatografie“ GC 1.Nekonečně rychlé ustavení rovnovah 2.Pístový tok mobilní fáze 3.Nulová difuse 4.Lineární sorpční isoterma Chromatografie obr22 DAV DET Chromatogram Vm Vr’ Vr Retenční – eluční čas tr uDoba od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křivky Retenční – eluční objem Vr •Objem mobilní fáze proteklý od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křuvky Fm – objemová rychlost mobilní fáze Mrtvý objem Vr – zdánlivý retenční objem Vr’- redukovaný (skutečný) retenční objem Vm- mrtvý objem – mimokolonové příspěvky + mimočásticový objem kolony • • • • • • • • • • • • • • DAV DET Kapacitní faktor k’ Vs – objem stacionární fáze VM – objem mobilní fáze cs – rovnovážná koncentrace látky ve stacionární fázi cM – rovnovážná koncentrace látky ve mobilní fázi Distribuční koeficient k’= 1 – 10 Selektivita Retenční faktor a Účinnost kolony (izokratická eluce) počet teoretických pater N Yr ½Yr Účinnost kolony (izokratická eluce) výškový ekvivalent teoretického patra H l – délka kolony Účinnost kolony Účinnost kolony (gradientová eluce) kapacita píku P tg – celková doba gradientu Účinnost kolony (gradientová eluce) kapacita píku P Rozlišení Yr1 Yr2 R12=1.5 – nulové překrytí R12=1.0 – překrytí 2 % tr1 tr1 Yr1 Yr2 Rozlišení Vliv jednotlivých faktorů na rozlišení Selektivita Kapacita Účinnost Vliv jednotlivých faktorů na rozlišení •faktor selektivity lze ovlivnit: • -změnou stacionární fáze -změnou mobilní fáze -současnou změnou obou fází -změnou rychlosti toku mobilní fáze Vliv jednotlivých faktorů na rozlišení • •faktor kapacity lze ovlivnit: • -množstvím stacionární fáze v koloně -změnou stacionární nebo mobilní fáze -změnou teploty kolony Vliv jednotlivých faktorů na rozlišení • •faktor účinnosti lze ovlivnit: • -délkou kolony -rychlostí průtoku mobilní fáze -velikostí částic sorbentu -teplotou, viskozitou mobilní i stacionární fáze Vznik eluční křivky – peaku (píku) > „Dynamická difuzní teorie“ Van Deemter vliv rychlosti mobilní fáze na rozšiřování zón Van Deemterova difuzní teorie uDifuse turbulentní u uDifuse molekulová u uOdpor proti převodu hmoty Difuse turbulentní A • • • • • • • • • • • • • • Difuse molekulová B • • • • • • • • • • • • • • Odpor proti převodu hmoty C • • • • • • • • • • • • • • Van Deemterova rovnice u optimum •minimum křivky ≈ optimální průtoková rychlost •daná kolona vykazuje největší účinnost, nejméně rozšiřuje zóny analytů Síly a efekty využívané při separaci uIontové síly uSilné elektrostatické interakce mezi stacionární a analyzovanou látkou– ionexová chromatografie u uPolární síly uinterakce dipólů a protondonorní, resp. protonakceptorní vlastnosti (tvorba vodíkových můstků) separovaných látek, mobilní a stacionární fáze – adsorpční chromatografie u u u Síly a efekty využívané při separaci uNepolární síly (disperzní, van der Waalsovy) uNejslabší, tyto interakce se vyskytují u látek, které nejsou permanentní dipóly – adsorpční, reverzně fázová a hydrofobní chromatografie u uEfekt velikosti molekul uRozdíly ve velikosti a tvaru molekul – gelová permeační chromatografie u u Síly a efekty využívané při separaci uSterické interakce uKomplexní specifická interakce ligand biomakromolekula kombinující všechny výše uvedené interakce a efekty – afinitní chromatografie u u Rozdělovací chromatografie Rozdělovací chromatografie Rozdělovací chromatografie Rozdělovací chromatografie cS cM Použití – analytická PC, TLC Papírová chromatografie AMK nstacionární fáze: voda nmobilní fáze: butanol-kyselina octová-voda (12:3:5) Adsorpční chromatografie chromatografie s normálními fázemi Adsorpční chromatografie uStacionární fáze – polární u unese aktivní centra, jejich počet, rozložení a schopnost poutat molekuly rozdělované směsi závisí na charakteru adsorbentu, velikosti povrchu a na vlastnostech separovaných látek u Adsorpční chromatografie cS cM Adsorpční chromatografie uStacionární fáze uSilikagel SiO2 . n H2O uVysoký specifický povrch a relativně velký objem pórů. Hlavní součástí aktivních center jsou hydroxylové (silanolové) skupiny, na něž je vodíkovou vazbou adsorbována voda. Zahřátím na 150oC dojde k odstranění vody ® “aktivace silikagelu”. Labilní nad pH 8. > 200oC rozklad. uAdsorpce: interakce se silanolovými skupinami; povrch silikagelu je slabě kyselý (má protondonorní vlastnosti). Lépe jsou zadržovány bazické látky. Adsorpční chromatografie uStacionární fáze uOxid hlinitý Al2O3, uObdobné vlastnosti jako u silikagelu (povrch, póry). Vyskytuje se v řadě modifikací, dle množství vázané vody, krystalické struktury. “Aktivace” vysušením [Al(OH)3 ® AlO(OH) ® Al2O3]. uPři vysokém obsahu vody (15%) se projevují rozdělovací efekty. Vedle protondonorních hydroxylů se na povrchu vyskytují i centra s protonakceptorními vlastnostmi. u Adsorpční chromatografie uMobilní fáze – nepolární u uEluce - zvyšováním polarity mobilní fáze u uEluotropická řada: uuhlovodíky 80%) s malým množstvím vody nebo jiného polárního rozpouštědla u HILIC chromatografie HILIC chromatografie HILIC chromatografie HILIC chromatografie HILIC chromatografie uNanášení vzorku – vzorek rozpuštěn v u mobilní fázi u uEluce – zvyšováním polarity mobilní u fáze Dioxan>Aceton>ACN>THF>IPOH>EtOH>MetOH>H2O u uPoužití : analýza polárních látek HILIC chromatografie HILIC chromatografie Reverzně fázová chromatografie uStacionární fáze – nepolární u C8, C18 u uMobilní fáze – polární – vodné roztoky u pH ® potlačit disociaci u uEluce – snižováním polarity mobilní fáze u ACN, MetOH, u c18_surf Reverzně fázová chromatografie Reverzně fázová chromatografie H2O Použití : analytické – až 90 % analýz Kartáčový typ stacionární fáze Reverzně fázová chromatografie Reverzně fázová chromatografie Reverzně fázová chromatografie Reverzně fázová chromatografie Iontově párová chromatografie analyt iontově párující činidlo • + - SDS, HClO4 - - tetrabutylamonium Iontově párová chromatografie • sorbent C18 iontový pár Stacionární, mobilní faze, eluce – RPC pH ® plná ionizace analytu Iontově párová chromatografie Hydrofobní chromatografie uStacionární fáze – -C4, -C8, -fenyl u uMobilní fáze – vodné roztoky (pufry) u 1.7 M (NH4)2SO4 u uEluce – snižováním iontové síly u uPoužití : purifikace bílkovin u Hydrofobní chromatografie uStacionární fáze – u Hydrofobní chromatografie Hydrofobní chromatografie Ionexová chromatografie Ionexová chromatografie + elektrostatická interakce + + Vazba Eluce Ionexy uKatexy - - vazba kationtů usilné - sulfo(S), sulfopropyl(SP) OSO3- uslabé - karboxy(C), karboxymetyl(CM) u COO- u uAnexy - + vazba aniontů uslabé - dietylaminoetyl(DEAE) usilné - trietylaminoetyl(TEAE) u Slabý ionex uVykazuje změny vazebné kapacity v závislosti na pH uMá pufrační kapacitu pH % COO- COOH Slabý versus silný ionex Ionexová chromatografie cS cM kapacita ionexu Volba podmínek – pH + typ ionexu pI Bílkovina - Katex Ionex Anex + - + OH- H3O+ 0 -1 +1 pI bílkoviny je znám Donanův efekt OH- H3O+ H3O+ OH- zvyšování pH snižování pH Volba podmínek – pH + typ ionexu pI bílkoviny není znám •Metoda pokusů a omylů • • • • • • • •Metoda titračních křivek Ionexová chromatografie uNanášení vzorku – nízká iontová síla u uEluce – gradientová uZvyšováním iontové síly uZměnou pH uAfinitní eluce uPoužití – purifikace, zakoncentrování, u výměna pufru pI Bílkovina - Katex Ionex Anex + - + OH- H3O+ 0 -1 +1 Ionexová chromatografie Ionexová chromatografie Chromatofokusace Chromatofokusace Chromatofokusace děj na koloně R R pH = 9 pH = 4 Chromatofokusace chování vzorku • • - • + Chromatofokusace chování vzorku pH 9 4 pI Použití : analytické – stanovení pI preparativní – purifikace bílkovin Chromatofokusace Chromatofokusace Gelová permeační chromatografie Gelová permeační chromatografie Gelová permeační chromatografie • • • • Princip - stérická exkluse - omezená difuse Pořadí eluce : MrA>MrB>MrC Gelová permeační chromatografie Totální exkluse Totální permeace Selektivní permeace Gelová permeační chromatografie Pharmacia LPC •Sephadex dextran •Sepharose agarosa •Sephacryl glukosa + akryamid •Sephacel cellulosa • Pharmacia FPLC •Superose agarosa •Superdex síťovaná agarosa a dextran Sephadex Sephadex Sepharosa Sepharosa Gelová permeační chromatografie Bio-Rad •BioGel P akrylamid •BioGel A agarosa • Tosoh Bioscience •Toyopearl a TSKgel hydroxylovaný methacrylát BioGel P Gelová permeační chromatografie Gelová permeační chromatografie uNanášení vzorku – objem vzorku < u 2% objemu kolony uEluce – izokratická u uPoužití : stanovení Mr, odsolování, u¨ purifikace Gelová permeační chromatografie Gelová permeační chromatografie Gelová permeační chromatografie Gelová permeační chromatografie Afinitní chromatografie Afinitní interakce Afinitní chromatografie Afinant Afinitní chromatografie nanesení vzorku Afinitní chromatografie vznik interakce SPECIFICITA Afinitní chromatografie vymytí balastů STABILITA Afinitní chromatografie eluce REVERZIBILITA Afinitní páry Afinitní interakce Interakce mezi DNA a endonukleasou Předpoklady pro vznik komplexu uSterické – použití raménka (spacer) u u u u • • Afinitní chromatografie Předpoklady pro vznik komplexu uSterické – použití raménka (spacer) u u u u • • Předpoklady pro vznik komplexu uKonformační u u u u uVazebné u uOptimální pH, iontová síla u u Stacionární fáze • •velké póry umožňující průnik velkých molekul •co nejnižší nespecifické adsorpce • •nejčastěji agarosa (Sepharosa) •ligand kovalentně navázaný přes –OH skupinu cukerné jednotky nosiče Provedení uNanesení vzorku – nízká iontová síla u u Eluce uEluce – selektivní - volným ligandem u nebo kompetičním činidlem Eluce uEluce – neselektivní - změna pH, u iontové síly, u polarity Eluce uEluce – pulsní x gradientová Ligandy • Monospecifické •váží pouze jedinou biomakromolekulu •nutné si připravovat individuálně Skupinově specifické •váží biomakromolekuly s podobnými vlastnostmi •komerčně dostupné Imobilizace ligandů Imobilizace ligandů • N-hydroxysukcinimid (NHS) -NH2 CNBr -NH2 • Karbodiimid -NH2, -COOH Epoxid -SH, -NH2, -OH N-hydroxysukcinimid (NHS-Sepharosa) CNBr (CNBr aktivovaná Sepharosa) N, N'-disubstituovaný karbodiimid Epoxid (Epoxy-aktivovaná Sepharosa 6B) Skupinově specifické ligandy Skupinově specifické ligandy Protein A a Protein G Skupinově specifické ligandy Protein A a Protein G Skupinově specifické ligandy „dye ligand“ NAD+ NADP+ Dependentní dehydrogenasy Skupinově specifické ligandy Cibacron Blue F4G-A Skupinově specifické ligandy lektiny Skupinově specifické ligandy Con A Skupinově specifické ligandy Con A Skupinově specifické ligandy lektiny Genetické inženýrství figure 13-08 Expresní systému uProkaryota (E.coli) u u+ snadná kultivace u+ vysoký výtěžek u+ levný u u- neumí pracovat s introny u- neumí postranslační modifikace Expresní systému uEukaryota (kvasinky, savčí a rostlinné tkáňové kultury) u u+ umí pracovat s introny u+ umí postranslační modifikace u u- malý výtěžek u u u figure 13-03 figure 13-01 figure 13-06 part 3 Rezistence k ampicilinu Rezistence k tetracyklinu Inklusní tělíska F05-55.jpg 0005D4FFMacintosh HD B74677AA: Využití AC pro purifikaci rekombinantních proteinů Green Fluorescent Protein F05-58.jpg 0005D4FFMacintosh HD B74677AA: Green Fluorescent Protein Aequorea victoria Green Fluorescent Protein NC 2008 Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Tsien izoloval GFP z medúzy jak GFP navázat na jiné proteiny vysvětlil fluorescenci Green Fluorescent Protein GFP AMK sekvence – 238 AMK MSKGEELFTGVVPVLVELDGDVNGQKFSVSGEGEGDATYGKLTLNFICT TGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTI FYKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKMEYNYNS HNVYIMGDKPKNGIKVNFKIRHNIKDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLP DNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMILLEFVTAARITHGMDELYK Green Fluorescent Protein Reportérový gen Green Fluorescent Protein Green Fluorescent Protein Ch. na imobilizovaných kovových iontech iminodiacetic acid (IDA) nitrilotriacetic acid (NTA) N, N, N-tris-carboxymethyl ethylene diamine (TED) Ch. na imobilizovaných kovových iontech uEkvilibrace – imobilizace kovového iontu (50 mM) u uPoužívané ionty - používají se především u ionty Cu2+, Zn2+, Ni2+, u Fe3+, Co2+, Mn2+ a Mg2+, u preferující dusík jako u koordinační ligand u Ch. na imobilizovaných kovových iontech Ch. na imobilizovaných kovových iontech Ch. na imobilizovaných kovových iontech uNanášení vzorku – pufr s vyšší iontovou u silou (0.5 M NaCl) u uEluce – snížení pH (3-4), kompetitující u látka (histidin, imidazol, glycin, u fosfát), EDTA u uPoužití : purifikace normálních a u rekombinantních bílkovin Ch. na imobilizovaných kovových iontech Ch. na imobilizovaných kovových iontech Gelová permeační chromatografie Analytická afinitní chromatografie Analýza vazby ligandu na biopolymer Určení disociační konstanty komplexu biopolymer - zakotvený ligand (K´) má význam zejména pro posouzení vhodnosti nosiče se zakotveným afinantem z hlediska praktické použitelnosti. Hodnota K´ se musí nacházet v intervalu (10-6 - 5.10-3) v jednotkách mol.l-1. Vazba na imobilizovaný ligand bývá zpravidla slabší než na ligand volný. 1 / (VR - V0) = K´ / (V0 - VM)* cL VM - mrtvý objem kolony VO - el. objem nezadržovaného analog. biopolymeru (Mr) VR - eluční objem studovaného biopolymeru cL - koncentrace vázaného ligandu Analytická afinitní chromatografie Analytická afinitní chromatografie Analýza vazby ligandu na biopolymer Určení disociační konstanty komplexu biopolymer - volný ligand (K) vychází z předpokladu, že oba ligandy (volný i zakotvený) se vážou na biopolymer kompetitivně (metoda kompetitivní eluce). Na kolonu obsahující nosič s vhodným afinantem naneseme biopolymer, k eluci použijeme určitou koncentraci kompetitivního ligandu (cL´) a změříme eluční objem biopolymeru VR. Provedeme sérii pokusů s různými koncentracemi ligandu, získáme různé eluční objemy. 1 / (VR - V0) = K´/ (V0 - VM)* cL´ + [K´* cL] / [(V0 - VM)*cL´* K] Analytická afinitní chromatografie > Analytická afinitní chromatografie Kovalentní chromatografie thiol-disulfidická výměna kyselina 5,5´-dithiobis-2-nitrobenzoová Kovalentní chromatografie Kovalentní chromatografie uNanášení vzorku – monitorování při u 343 nm uEluce – redukční eluce u10-25 mM DTT u25-50 mM β-merkaptoethanol uReaktivace – reakce s reaktivním disulfidem u20 mM 2,2’-dipyridyldisulfid uPoužití : isolace bílkovin a peptidů u obsahujících SH skupin Kovalentní chromatografie GST Kovalentní chromatografie GST Boronátová chromatografie Boronátová chromatografie Boronátová chromatografie uNanášení vzorku – vyšší iontová síla u (0,2 M pufr) uEluce – polyoly (200 mM sorbitol) u uPoužití : purifikace glyko- proteinů a peptidů, stanovení GlyHb Boronátová chromatografie Thiofilní chromatografie Thiofilní chromatografie uNanášení vzorku – pufr s vyšší iontovou u silou (0,5 M Na2SO4 u nebo NaCl) u uEluce – snižováním iontové síly, snižováním pH u uPoužití : isolace poly- a monoklonálních u protilátek a jejich fragmentů Thiofilní chromatografie Dvoufázové separace Afinitní dvoufázové separace Afinitní dvoufázové separace Afinitní ultrafiltrace Afinitní ultrafiltrace http://journals.plos.org/plosone/article/figure/image?size=large&id=info:doi/10.1371/journal.pone.0 017593.g003 Afinitní precipitace Afinitní precipitace Afinitní precipitace Afinitní precipitace Afinitní precipitace Afinitní precipitace 60% recovery 20 x enrichment