Elektromigrační metody Literatura Historie elektromigračních metod u1906 Reuss uElektroforéza – pohyb koloidní částic v elektrickém poli u u1897 Kohlrausch uregulační funkce u u1930 Arne Tiselius uVolná a zónová elektroforéza (1948 Nobelova cena) u Historie elektromigračních metod u1962 Vesterberg, (Svensson) Rilbe uizoelektrická fokusace u u1967 Hjerten ukapilární elektroforéza v rotující 1 - 3 mm křemenné kapiláře u u1970 Laemmli uSDS PAGE Historie elektromigračních metod u1975 O´Farrell u2D-elektroforéza u u1976 Everaerts, Mikkers uisotachoforéza u u2003 Karger uMultikapilární CE – lidský genom Frederic Reuss (1807) Katoforéza Elektroforéza (1909) Leonor Michaelis http://www.bioinfo.org.cn/book/biochemistry/chapt08/212-2.jpg http://plantphys.info/plant_physiology/images/enzmichaelis.gif Friedrich Kohlrausch (1874) Regulační funkce Podstata u u u„Pohyb elektricky nabitých částic uv elektrickém poli“ Teoretické aspekty elektromigračních metod Mobilita E = intenzita elektrického pole [V/m] Q = náboj částice = zi ´ e [] Elektrická síla Fe Frikční síla Ff v = rychlost částice f(frikční koeficient) = 6p.h.r [m-2 V-1 s-1] Ustálený stav mobilita Podle druhé Iontová mobilita (limitní zředění, teplota 298 K) KATIONTY |m0|.109 ANIONTY |m0|.109 H3O+ Li+ Na+ K+ Tris+ b-alanin ethanolamin imidazol 362.5 40.1 51.9 76.2 29.5 36.7 44.3 52.0 OH- F- Cl- NO3- SO4- k.mléčná k.octová MES 205.5 57.4 79.1 74.1 82.9 36.5 42.4 28.0 Efektivní mobilita A0,A1,A2,........Ak m0,m1,m2,...........mk cA = celková analytická koncentrace látky A xi = molární zlomek iontu i Závislost efektivní mobility na pH v pro slabou monovalentní kyselinu v pro slabou monovalentní zásadu Závislost efektivní mobility na pH pro slabou monovalentní zásadu Závislost efektivní mobility na pH pro slabou monovalentní kyselinu Závislost efektivní mobility na pH pro bílkovinu Vliv velikosti molekuly na mobilitu h - viskozita prostředí r – poloměr částice Vliv iontové síly na mobilitu z = náboj iontu zc = náboj protiiontu I – iontová síla Vliv teploty na mobilitu To = standardní teplota T = pracovní teplota Vzrůst T o 1oC růst mobility o 2-3oC Sekundární jevy uJouleovo teplo uElektroosmóza uDifuze Jouleovo teplo P = výkon [W.m-3] S = průřez [m2] k = vodivost [W-1.m-1] i = elektrický proud [A] Jouleovo teplo uLimituje použití vyšších napětí u uOvlivňuje iontovou mobilitu u uOvlivňuje disociaci slabých kyselin a zásad u uZpůsobuje heterogentiku pH, I u uDenaturace !!!!! CHLAZENÍ Elektroosmotický tok Elektroosmotický tok x = potenciál Helmholtzovy dvojvrstvy h = viskozita e = dielektrická konstanta meo = elektroosmotická mobilita Původ elektroosmotického toku Elektroosmotický tok Laminární tok Elektroosmotický tok v různých kapilárách Difuze s2 = rozptyl D = difuzní koeficient Difuze Elektroforéza u u„Dělení nabitých částic na základě rozdílných elektroforetických mobilit“ Elektroforéza uVolná u uZónová Volná elektroforéza + + - - A+B C B+C A+B+C A+B+C A mA > mB >mC Volná elektroforéza Arne Tiselius (1902 –1971) Volná elektroforéza Arne Tiselius Volná elektroforéza Arne Tiselius (1902 –1971) Nobelova cena1948 Zónová elektroforéza + + A+B+C A B C - - mA > mB >mC Skylab Skylab Stabilizace uRotací u uGradienty hustoty u uPorézními medii u uKapilárou u Stabilizace uRotací u Stabilizace uGradienty hustoty u Stabilizace uGradienty hustoty u Požadavky na porézní media uHomogenita u uInertnost - nespecifické interakce u - nulový EOF uReprodukovatelná a snadná příprava u uMechanická pevnost u uTransparentnost u Porézní media u1939 Papír u1950 Agarový gel u1955 Škrobový gel u1957 Acetát celulosy u1959 Polyacrylamidový gel u1979 Agarosový gel Chromatografický papír uSložení – celulosa u -Nehomogenní -Přítomnost ionogenních skupin -Špatně se chladí – pálí se - uPoužití : téměř už se nepoužívá Chromatografický papír Chromatografický papír Acetát celulosy uSložení – acetát celulosy u u+ Komerčně dostupný u+ Dobré mechanické vlastnosti - uPoužití : imunoelektroforetické u metody, klinické aplikace Acetát celulosy Acetát celulosy Acetát celulosy analýza sérových bílkovin Electrophoresis SPE_16A Acetát celulosy hemoglobinu s26 HPFH – dědičné přetrvávání hemoglobinu F (“hereditary persistence”) pH 8.4 1. Normální dospělý 2. HPFH (heterozygot) 3. Hb S--HPFH 4. Hb C--HPFH 5. Normální novorozenec Hemoglobin S a C – mutace v primárni struktuře, náhrada jedné z aminokyselin za druhou. Agar a agarosa uSložení – kopolymer galaktosy a u anhydrogalaktosy u -Přítomnost ionogenních skupin – silný EOF u+ Velké pory u+ Snadná příprava - uPoužití : imunoelektroforetické metody u elektroforéza NK Agar a agarosa Agar a agarosa Agar a agarosa Agar a agarosa DNA agarosová elektroforéza Ethidiumbromid - červeň, která v roztoku fluoreskuje pouze slabě, intenzita fluorescence se výrazně zvyšuje vazbou na DNA interkalací mezi páry bazí. Excitace při 302 nm, červeno-oranžová emise při 510 nm. Velmi toxická látka! Pulsní DNA elektroforéza 20 000 – 12 000 000 pb Pulsní DNA elektroforéza 20 000 – 12 000 000 pb Pulsní DNA elektroforéza 20 000 – 12 000 000 pb Imunoelektroforéza zónová elektroforéza + difuze Imunoelektroforéza raketová Škrob uSložení – hydrolyzovaný škrob u u+ poprvé se uplatňuje efekt molekulového u síta u - Špatné mechanické vlastnosti u - Komplikovaná a nereprodukovatelná u příprava u - Není transparetní - uPoužití : izoenzymová analýza Sypané vrstvy uSložení – Sephadex – zesíťovaný dextran u u+ uplatňuje efekt molekulového síta - uPoužití : preparativní Polyakrylamid uSložení – kopolymer akrylamidu a u N,N,- methylenbisakrylamidu u u+ plně splňuje požadavky -Monomery jsou neurotoxiny !!!!!! - uPoužití : analýza bílkovin a NK Polyakrylamid Polyakrylamid - příprava uRadikálová polymerace u uKatalyzátor – tetramethylethylendiamin u TEMED u uIniciátor - chemicky – (NH4)2S2O8 (- O2) u - fotochemicky – ribloflavin+UV (+O2) u Polyakrylamid - složení a – akrylamid (g) b – methylenbisakrylamid (g) m – objem (ml) Fergussonova rovnice PAGE není pouze pasivním nosičem, ale podílí se na separaci efektem molekulového síta. m - mobilita m0- mobilita při limitním zředění Kr – retardační koeficient T m T m T m A B MrA= MrB pIA¹ pIB Uplatnění Fergussonovy rovnice A B MrA ¹ MrB pIA¹ pIB MrA ¹ MrB pIA= pIB A B Provedení PAGE uvertikální x horizontální udeskové x trubičkové uhomogenní x gradientové ukontinuální x diskontinuální unativní x SDS PAGE Upořádání Horizontální + - + - Upořádání Vertikální Provedení PAGE udeskové x trubičkové Provedení PAGE udeskové x trubičkové Provedení PAGE deskové x trubičkové Provedení PAGE protean_IIxiw_combs deskové x trubičkové Provedení PAGE 1011631 udeskové x trubičkové Provedení PAGE uhomogenní x gradientové Provedení PAGE uhomogenní x gradientové Provedení PAGE uhomogenní x gradientové Provedení PAGE ukontinuální x diskontinuální Izotachoforéza T A+B L T A+B L Světlý svislý B Světlý vodorovný A Světlý svislý B T AB L A Světlý svislý B T L A Světlý svislý B T AB L A t0 t1 t2 t3 + + + - - - Diskontinuální PAGE Orstein, Davis Koncentrační gel T = 3 – 5 % Separační gel T = x % Elektrodový pufr Tris Glycin pH 8.3 Koncetrační pufr Tris HCl pH 6.8 Separační pufr Tris Glycin pH 8.3 Elektrodový pufr Tris Glycin pH 8.3 Cl- Gly- B- A- Cl- Gly- B- A- Separační gel Zónová elektroforéza Koncentrační gel Izotachoforéza + - Diskontinuální PAGE Orstein, Davis SDS PAGE + 1 g bílkoviny váže 1.4 g SDS Þ uniformní náboj na jednotku MW SDS PAGE Stanovení Mr pomocí SDS PAGE Log Mr Rm Stanovení Mr pomocí SDS PAGE - standardy 1046053 67771 Použití SDS PAGE uStanovení Mr uAnalýza komplexních směsí uSledování purifikace bílkovin uStanovení podjednotkového složení + - + - + - Stanovení Mr pomocí SDS redukujicí x neredukující Stanovení Mr pomocí SDS redukující x neredukující PAGE - sekvenace DNA figure2 Chemická metoda BÁZE CHEMIKÁLIE G dimethylsufoxid+ piperidin G + A dimethylsufoxid+ piperidin + k.mravenčí C hydrazin/chlorid sodný+ piperidin C + T hydrazin + piperidin Enzymová metoda figure 11-30 figure 11-29 Preparativní PAGE Automatizace PAGE Fast-system Automatizace PAGE Fast-system Automatizace PAGE Fast-system Automatizace PAGE Fast-system Automatizace PAGE Fast-system Automatizace PAGE Fast-system Automatizace PAGE Fast-system Automatizace PAGE Fast-system Kapilární zónová elektroforéza CZE ce-animation Kapilární elektroforéza 1967 - Hjerten 3 mm kapilára Kapilární elektroforéza 1981 - Jorgenson DeArmann Lukacs 75 mm kapilára Beckman 1987 P/ACE™ MDQ DNA System 2003 - Projekt lidského genomu Proč CE a biochemie ? Výhody CE uAplikační diverzita •nabité i neutrální látky •nízkomolekulární i vysokomolekulární látky •chirální i achirální látky •bakterie i viry u u u Výhody CE uAplikační diverzita uJednoduchá instrumentace u ce-animation Výhody CE uAplikační diverzita uJednoduchá instrumentace u CZE, MEKC, CIEF, CITP NACE, MEEKC, CGE, ChCE CEC Výhody CE uAplikační diverzita uJednoduchá instrumentace uVysoké rozlišení a účinnost separací uMalá spotřeba vzorku uRychlost analýzy uMalá spotřeba chemikálií a malé množství odpadů u Módy CZE Kapilární zónová elektroforéza ve volné kapiláře Výsledná mobilita částic při CZE Separace aniontů pomocí CZE Stanovení aktivity HD pomocí CZE Princip MEKC Micela a – střed – rozpustná v obou b – silně hydrofilní – nerozpustná v micele c – silně hydrofóbní – nerozpustná ve vodné fázi Micelární elektrokinetická chromatografie Separace fenolů a alkoholů pomocí MEKC Stanovení aktivity CYP 2C9 pomocí MEKC Kapilární gelová elektroforéza CGE fragmentů dsDNA Instrumentace CZE Schéma zařízení pro CZE Napájecí zdroj ustabilizovaný ± 30 kV 300 μA ukonstantní napětí nebo proud uobojí polarita uochrana obsluhy Kapilára ukřemenná - 25 -100 μm i.d u - 350 μm o.d. udélka až 100 cm délka upolyimidové vnější pokrytí u uOdstranění •horká H2SO4 •opálení •oškrábání žiletkou • Dávkování - hydrodynamické Dávkování - elektrokinetické Detekce spektrofotometrická Detekce fluorescenční 1989- 2003 Projekt lidského genomu Paralelní sekvencováni Automatizace 1 DNA – 1 vzorek 300 sekvenátorů 3730xl DNA Analyzer Applied Biosystems 1997 µCE Klasická CZE > Microchip CZE Bioanalyser Agilent 2100 Bioanalyser Agilent 2100 2013 NASA - Mars Afinitní elektroforéza u„V inertní matrici je imobilizován ligand, se kterým specificky interaguje separovaný biopolymer“ CL= 0 CL= 2n CL= n CL= 4n Ligandy Imobilizace ligandu uChemická – kovalentní vazba u uFyzikální – ligand vázán na u makromolekulu u uPoužití : uStudium interakce mezi ligandem a biomakromolekulou Izoelektrická fokusace u u„Elektroforéza v gradientu pH, částice jsou separováný podle svých pI“ Izoelektrická fokusace 1961 Svensson – Rilbe (1968) Tvorba gradientu uAnoda (+) H3O+ 6H2O®O2 + 4H3O+ + 4e- u uKatoda(-) OH- 4H2O®2H2 + 4OH- - 4 e- u Ampholyty Izoelektrická fokusace pH + - H3O+ OH- A + - H3O+ OH- A pI t0 t1 Izoelektrická fokusace + - H3O+ OH- pH tx Kapilární izoelektrická fokusace Izoelektrická fokusace analytická uProvedení - v gelech – PAGE, agarosa u uPoužití - sledování komplexních směsí u u - izoenzymové složení u u - stanovení pI – rozřezání a eluce u – mpH elektrody u – pI standardy u Izoelektrická fokusace analytická 1026921 Izoelektrická fokusace analytická 1046056 Izoelektrická fokusace analytická - standardy 71383 Izoelektrická fokusace Imobiline prof. Righetti Izoelektrická fokusace preparativní uProvedení - rotací – Rotofor (BioRad) u u u u u u u 618354 Izoelektrická fokusace preparativní uProvedení - v sypaných vrstvách (Sephadex) u u - v gradientech hustoty (sacharoza) u uPoužití – izolace bílkovin u Dvourozměrné metody uMetoda titračních křivek u uDvourozměrná elektroforéza Metoda titračních křivek I.rozměr – IEF bez vzorku II.rozměr – elektroforéza se vzorkem pH 3.0 10.0 - - + + pH 3.0 10.0 Metoda titračních křivek Metoda titračních křivek Metoda titračních křivek Dvojrozměrná elektroforéza Dvojrozměrná elektroforéza 1975 O´Farrell 10% Dvojrozměrná elektroforéza 10% pI Mr I.rozměr IEF II.rozměr SDS-PAGE pH 3.0 10.0 Dvojrozměrná elektroforéza 71377 Dvojrozměrná elektroforéza pI Mr CelM Základní schéma analýzy užívané v proteomice Směs proteinů Jednotlivé proteiny Peptidy Hmotnostní spektra peptidů Identifikace proteinů 1. Separace 2D-PAGE 2. Izolace Štěpení trypsinem 3. Hmotnostní analýza Hmotnostní spekroskopie 5. Porovnání s databází 4. Sekvenční analýza Fragmentace peptidů Sekvence peptidů Dvojrozměrná elektroforéza pI Mr CelM Izotachoforéza u u„Vzorek je umístěn mezi dva elektrolyty : vedoucí L (leading) s nejvyšší mobilitou a - uzavírající T (terminating) s nejmenší mobilitou“ Izotachoforéza 1976 Everaerts Izotachoforéza T A+B L T A+B L Světlý svislý B Světlý vodorovný A Světlý svislý B T AB L A Světlý svislý B T L A Světlý svislý B T AB L A t0 t1 t2 t3 + + + - - - Izotachoforéza Izotachoforéza I v m E L B A T mL > mA > mB > mT Kohlrauschova regulační funkce Analytická ITP + - Dávkování Detekce Zapisovač Napájení Analytická ITP instrumentace uNapájení - stejnosměrné 3 kV 0,2 – 0,5 mA uKapilára 0,1 – 2 mm uDávkování - dávkovací ventil uDetekce - universální – konduktometrická u – potencialně u gradientová u - selektivní – UV-VIS Izotachoforetický záznam kvantita A T L B Izotachoforetický záznam kvalita A T L B Izotachoforetický záznam Izotachoforetický záznam Analytická ITP Villa Labeco Analytická ITP Metoda spojování kapilár Předseparační kapilára – 2 mm Analytická kapilára – 0.1 mm Preparativní ITP V gelech - Sephadex + - Preparativní ITP - L A+B T A B + Kontinuální plošná Detekce po elektroforéze a izoelektrické fokusaci Nespecifická detekce Nespecifická detekce Nespecifická detekce 71371 CBB R250 Ag CBB G250 SYPRO Fluorescenční detekce g000989 Specifická detekce Autoradiografie g000485 Specifická detekce Detekce glykoproteinů g001171 Detekce na základě biologické aktivity Detekce na základě biologické aktivity > Blotting uSouthern – DNA u uNothern – RNA u uWestern - bílkoviny Blotting Blotting Výhody blottingu uDostupnost biomakromolekul uZakoncentrování biomakromolekul uRedukce doby a množství potřebných chemikálií uImobilizace biomakromolekul – možnost uchovávání uMožnost vícenásobné detekce uMechanická stabilita DRŽÁK FILTRAČNÍ PAPÍR BLOTOVACÍ MEMBRÁNA GEL NÁDOBA S PŘENOSOVÝM PUFREM DRŽÁK HOUBA HOUBA FILTRAČNÍ PAPÍR BLOTOVACÍ MEMBRÁNA Difuzní blotting Vakuový blotting PORÉZNÍ PODLOŽKA VÝVĚVA ZÁKLADNA GEL FILTRAČNÍ PAPÍR BLOTOVACÍ MEMBRÁNA Kapilární blotting ZÁVAŽÍ BLOTOVACÍ MEMBRÁNA FILTRAČNÍ PAPÍR NÁDOBA S PŘENOSOVÝM PUFREM FILTRAČNÍ PAPÍR GEL FILTRAČNÍ PAPÍR KATODA DRŽÁK FILTRAČNÍ PAPÍR NÁDOBA S PŘENOSOVÝM PUFREM DRŽÁK HOUBA HOUBA + - ANODA BLOTOVACÍ MEMBRÁNA GEL Tankový elektroblotting Tankový elektroblotting 60763 Tankový elektroblotting Mini Protean Trans Blot Cell 60855 „Semi dry“ blotting FILTRAČNÍ PAPÍR + FILTRAČNÍ PAPÍR BLOTOVACÍ MEMBRÁNA KATODA ANODA - GEL „Semi dry“ blotting Blotting PORÉZNÍ PODLOŽKA VÝVĚVA NANÁŠECÍ ŠABLONA BLOTOVACÍ MEMBRÁNA TĚSNĚNÍ ZÁKLADNA JAMKY PRO NANÁŠENÍ VZORKŮ TĚSNĚNÍ Kapkovací dot blotting Kapkovací dot blotting Kapkovací dot blotting Membrány Detekce Detekce Detekce Speciální aplikace blottingu uZískání homogenních preparátu uStudium složení a struktury bílkovin uMS bílkovin – MALDI, DESI uPříprava protilátek uPurifikace protilátek Detekce Detekce