Hmotnostní spektrometrie Literatura Historie hmotnostní spektrometrie u1906 J.J. Thomson uElektron, u u u u u u u Historie hmotnostní spektrometrie u1922 F.W. Aston uIzotopy u u u u u u Historie hmotnostní spektrometrie u1930 W. Paul uIontová past u Historie hmotnostní spektrometrie u1930 J.B. Fenn uESI u Historie hmotnostní spektrometrie u1930 K. Tanaka uMALDI u Historie hmotnostní spektrometrie Historie hmotnostní spektrometrie První MS v ČR Hmotnostní spektrometrie uSpektrální metoda ??? •Ne uHmotnostní spektrum u u Separační metoda ??? •Ano u Separace na základě m/z m/z HMOTNOST/NÁBOJ Hmotnostní spektrometr u u uHmotnostní spektrometr je iontově-optické zařízení, které separuje ionty podle poměru jejich m/z. u Hmotnostní spektrometrie u uMS - mimořádně citlivá metoda u (ionizace 0,01 %) u - destruktivní metoda u - minimální spotřeba vzorku u - určení MW a dalších u strukturních informací Podstata uanalytická metoda sloužící k převedení molekul na ionty (může dojít k jejich fragmentaci) u urozlišení těchto iontů podle poměru hmotnosti a náboje (m/z) u uzáznam relativních intenzit jednotlivých iontů IONTOVÝ ZDROJ ANALYZÁTOR DETEKTOR Blokové schéma Součásti MS u1/ iontový zdroj - slouží k převedení neutrálních molekul analytu na nabité částice (tzv. ionizace), konstrukce se liší podle použité ionizační techniky u u2/ hmotnostní analyzátor - slouží k rozdělení iontů v plynné fázi za vysokého vakua podle poměru hmotnosti a náboje (m/z) u u3/ detektor - slouží k detekci iontů po jejich separaci podle m/z a k určení relativní intenzity jednotlivých iontů Součásti MS u• další části přístroje: u -vakuový systém - -zařízení pro zavádění vzorků (sonda) DI + LC, GC, CE - -iontová optika sloužící k urychlení a fokusaci iontů - u- počítač na ovládání a ladění přístroje, sběr a ukládání dat, porovnání spekter s knihovnou MALDI 100 - 1000 kDa ESI až 100 kDa APCI až 2 kDa EI+ 70 eV / CI až 1 - 2 kDa Jak velké molekuly lze analyzovat ? TOF ORBITRAP ION TRAP QUADRUPOLE m/z Ionizační techniky Volba ionizační techniky uTvrdé ionizační techniky •EI M + e- ® M+ + 2e- u uJemné ionizační techniky •ESI [M+H]- •MALDI [M+H]+ u u Volba ionizační techniky Ionizační techniky uTvrdé ionizační techniky +70 eV •EI M + e- ® M+. + 2e- u uJemné ionizační techniky 10 eV •CI [M-H]+ •ESI [M+H]+ •MALDI [M-H]- u u Electron impact (EI) M + e- → M+. + 2 e- Electron impact (EI) M + e- → M+. + 2 e- FRAGMENTACE Electron impact (EI) M + e- → M+. + 2 e- Chemická ionizace (CI) Reakční plyn 100 Pa Plyn : vzorek 104 : 1 methan,isobuthan, ammoniak Ionizace za atmosferického tlaku Electrospray (ESI) u Ionizace VAKUUM COULOMBICKÁ EXPLOZE Rayleighův limit RAYLEIGHŮV LIMIT u ESI - zmlžování Chemická ionizace za atmosferického tlaku (APCI) Fotoionizace za atmosferického tlaku (APPI) Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) Ambientní ionizační techniky Desorpční ionizace elektrosprayem (DESI) Desorpční ionizace elektrosprayem (DESI) Přímá ionizace v reálném čase (DART) He* + M = M+. + He + e- Přímá ionizace v reálném čase (DART) DART_ion_source_capsule DART tomatoe Zobrazovací MS (IMS) Desorpční ionizace elektrosprayem (DESI) 3D IMS Hmotnostní analyzátory Hmotnostní analyzátory Hmotnostní analyzátory Rozlišení – Resolving Power Rozlišení – Resolving Power Rozlišení – Resolving Power Přesnost určení m/z Mass Acurracy experimentálně naměřená hodnota m/z = 300.0463, teoreticky vypočtená hodnota m/z = 300.0473 Správnost určení m/z = -3.3 ppm (včetně znaménka! 300.0473 dle tabulek (nebo lépe s využitím softwaru) nejlépe odpovídá elementární složení C12H17N2O2Br, podle izotopů M:M+2 potvrzena přítomnost bromu Magnetický analyzátor uZakřivení dráhy letu iontů v magnetickém nebo elektrickém poli (magnetický nebo elektrický analyzátor). u uV poli dochází k zakřivení dráhy iontu závislé na hodnotě m/z (m/z je úměrné kvadrátu poloměru dráhy iontu r2). u uLorezova síla versus Odstředivá síla u Magnetický analyzátor Magnetický analyzátor Autospec Kvadrupol a iontová past u uRůzná stabilita oscilací iontů v dvoj- nebo trojrozměrné kombinaci stejnosměrného a vysokofrekvenčního střídavého napětí (kvadrupól nebo iontová past). Kvadrupol Kvadrupol Kvadrupol uV daný okamžik jsou oscilace stabilní pouze pro určitou hodnotu m/z a tento ion projde kvadrupólovým analyzátorem, ionty s jinými hodnotami m/z mají nestabilní oscilace a jsou zachyceny na tyčích kvadrupólu, změnou napětí postupně projdou na detektor ionty se všemi hodnotami m/z. Kvadrupol Kvadrupol Kvadrupol Iontová past u u uTrojrozměrná analogie kvadrupólu, opakované selektivní vypuzení iontů podle hodnoty m/z z iontové pasti na detektor, možnost MSn analýzy. Iontová past (Ion Trap) CelM Ion Trap Ion Trap Ion Trap Ion Trap Analyzátor doby letu (TOF) u uRůzná doba rychlosti letu iontů (analyzátor doby letu – TOF). u uUrychlené ionty se v oblasti bez pole pohybují různou rychlostí v závislosti na hodnotě m/z (“menší ionty se letí rychleji“). Analyzátor doby letu (TOF) Analyzátor doby letu (TOF) Analyzátor doby letu (TOF) Iontová cyklotronová resonance (ICR) u u uRůzné absorpce energie při cykloidálním pohybu iontů v kombinovaném magnetickém a elektrickém poli. Iontová cyklotronová resonance (ICR) •T ~ abs. nula •Vysoké vakuum •Silné magnetické pole Iontová cyklotronová resonance (ICR) Iontová cyklotronová resonance (ICR) 0,01-0,1 mm 1 cm Iontová cyklotronová resonance (ICR) Trapping plate (+ve) Trapping plate (+ve) X = H (into page) Iontová cyklotronová resonance (ICR) receiver plate FT Iontová cyklotronová resonance (ICR) Orbitrap Orbitrap Orbitrap Orbitrap Alexander Makarov Orbitrap Analyzátor iontové pohyblivosti uAnalyzátor iontové pohyblivosti separuje ionty na základě jejich pohyblivosti v prostředí neutrálního plynu (obdoba elektroforézy). Analyzátorem je driftová trubice obsahující plyn o daném tlaku, na kterou je vloženo napětí. Ionty se pohybují ve směru elektrického pole, odpor prostředí (plyn) působí v opačném směru. Ionty se dělí na základě svých kolizních průřezů (tj. tvaru a velikosti), náboje a hmotnosti (u molekul větších než 0,5 kDa na hmotnosti nezáleží). Hmotnostní analyzátory u Detektory Elektronový násobič ionty dopadající na povrch elektrody zní vyrazí e-, dále zesíleny systémem dynod až 108krát, životnost 1-2 roky Elektronový násobič ionty dopadající na povrch elektrody zní vyrazí e-, dále zesíleny systémem dynod až 108krát, životnost 1-2 roky CEM Fotonásobič ionty dopadají na fosforovou destičku, čímž uvolní energii ve formě fotonu, zesílen systémem konverzních dynod až 105krát, delší životnost Vakuový systém Vakuový systém u• hmotnostní analyzátor vždy pracuje za vysokého vakua, hodnota vakua se liší podle typu analyzátoru ca. 10-3 až 10-10 Pa u u• kromě ionizačních technik pracujících za atmosférického tlaku (ESI, APCI, APPI) musí ubýt za vakua i iontový zdroj u u• proč tak vysoké vakuum? ionty musí mít dostatečně dlouhou střední dráhu a nesmí docházet ke kolizním srážkám s neutrálními atomy uK získání tak vysokých hodnot vakua je obvykle potřeba dvou nebo i více (FT-ICR) ustupňové čerpání velmi výkonnými vakuovými pumpami u u- 1. stupeň čerpání - rotační pumpy (výkon 80 l/s) u u- 2. stupeň čerpání - turbomolekulární nebo difúzní pumpy (výkon 250 l/s) Edwards Rotary 300px-Rotary_vane_pump_svg Rotační olejové vývěvy Difuzní a turbopumpy Turbo_pump_schematic Diffusion_pump_schematic MSn MSn TripleQ Q1 Q3 Collision (Q2) Quadrupole (MS1) Collision cell (MS2) Argon detector Drift free region (MS3) QTOF IT MS spektrum MS spektrum MS spektrum MS kalibrace • externí kalibrace – kalibrace a vlastní měření není ve stejný okamžik, nejdříve kalibrace a pak měření (nebo naopak), což někdy může způsobit určitý posun m/z - obecně poskytuje mírně horší výsledky oproti interní kalibraci, ale je menší riziko hmotnostních interferencí analytu s kalibrantem • interní kalibrace – kalibrant i analyt jsou do iontového zdroje přivedeny ve stejný okamžik a ve spektru pozorujeme jak analyt tak i kalibrant - poskytuje nejpřesnější výsledky, ale hrozí riziko hmotnostních interferencí (tzn. analyt a kalibrant nesmí mít příliš blízké hmotnosti, aby je daný typ analyzátor dokázal spolehlivě rozlišit, pokud by se píky analytu a kalibrantu ovlivnily, pak vzniká chyba) - "lock mass" kalibrace - založena na kontinuální kalibraci na vybraný ion pozadí o známém složení nebo sprejování standardu druhým sprejem MALDI destička Direct Insertion (Infussion) Probe GC HPLC CE Iontový zdroj Iontový separátor Detektor Analyzátor Inlet vakuum Ionizační techniky: EI+, CI, APCI, ESI, MALDI Direct infusion Direct probe GC/MS HPLC/MS CE/MS https://www.researchgate.net/profile/Emilio_Gelpi/publication/11444537/figure/fig12/AS:281179413598 244@1444049804913/Figure-7-Plate7-Schematics-of-the-possible-arrangements-for-an-ESI-liquid-junctio n.png MS detekce Aplikace MS Kvantitativní MS • výhodou je vysoká selektivita (pro MS/MS experimenty) a citlivost • je třeba vyvarovat se potlačení odezvy konkurenční ionizací (další látky, matrice) • důležitá je volba standardu, nezbytné je použití vnitřního (interního) standardu pro potlačení vlivu matrice či kontaminace na účinnost ionizace analytu, použití vnějšího standardu není vhodné a většinou je nepřijatelné Kvantitativní MS • nejpřesnější postup je pomocí izotopicky značeného standardu analytu • izotopicky značený standard obsahuje atomy s těžšími izotopy, které způsobují posun m/z ve spektru a tím odlišení signálu od neznačené látky -látky mají stejné chemicko-fyzikální vlastnosti - -nejčastěji deuterace (2D), 13C, 15N - -doporučený posun alespoň +3 jednotky m/z - - vysoká cena izotopicky značených standardů