Srážecí metody Srážení uNezaměňovat s denaturací – bílkoviny zůstávají v nativním stavu u uPrvní metody používané pro separaci bílkovin – EtOH, (NH4)2SO4 u uFiltrace nahrazena centrifugací u Rozpustnost bílkoviny uVlastnostmi bílkoviny – distribuce hydrofobních a hydrofilních skupin na povrchu bílkoviny + + + - - Rozpustnost bílkoviny uVlastnostmi roztoku – pH, iontová síla, org. rozpouštědla, org. polymery, teplota u Izoelektrická precipitace pI + - + - - - - - + + + + Srážení neutrálními solemi vsolování vysolování Vsolování - - - - - + + + + + H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O Vsolování Vysolování Vysolování Praktické aspekty uHofmeistrova řada u Anionty u SCN-, J-, ClO4-, NO3-, Br-, Cl-, Ac-, SO42-, PO43- u u Kationty u Na+, K+, NH4+ (NH4)2SO4 uRozpustnost se málo mění s teplotou uSaturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm3) uLevný uStabilizuje bílkoviny uRelativně čistý Srážecí křivka (NH4)2SO4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % Srážecí křivka (NH4)2SO4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % Aktivita bílkoviny Koncentrace bílkoviny Srážení - dvojstupňově I.Stupeň 35 % II.Stupeň 80 % Srážení - dvojstupňově I.Stupeň II.Stupeň Přidané množství uTabulky u uVzorce Přidané množství uTabulky u uVzorce Provedení El. míchačka Chlazení Míchání 10-30’ Centrifugace pevný (NH4)2SO4 nebo saturovaný roztok (NH4)2SO4 úprava pH NH4OH Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou uRozpouštědla ruší solvatační obal bílkoviny - - - - - + + + + + H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou Výběr rozpouštědla uKompletně mísitelné s vodou u uNereaguje s bílkovinou u uMusí mít dobrý precipitační efekt u uEtOH, aceton, MetOH, propanol, dioxan Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou uNutno provádět při T < 0 oC, při větší teplotě dochází k denaturaci u uDvojstupňově u uPřídavky z tabulky nebo podle vzorce u Srážení org.polymery uPrincip identický s rozpouštědly u uDEAE dextran (DNA) uPEG - Ig G uPolyakrylová kyselina uRivanol (6, 9-diamino-2-ethoxyakridinelaktát) -Ig G, DAO uKaprylová kyselina - Ig G u u u Srážení selektivní denaturací uPři této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina musí zůstat z 85 - 90 % v nativním stavu. u uDenaturační vlivy – T, pH, org. rozpouštědla u uBílkovina musí nejen denaturovat i precipitovat u Tepelná denaturace Tepelná denaturace uDoba inkubace je důležitá pouze pro reprodukovatelnost – denaturační křivka se tím posouvá po teplotní ose, má význam pro vyhřívání větších objemů u uPřídavky některých látek (substráty, koenzymy, inhibitory) zvyšují stabilitu cílových bílkovin u upH při tepelné denaturaci musí být přesně definováno u uPři vyšší teplotě běží více proteolýza u pH denaturace uProvádět za definované teploty u uZměny pH dělat co nejrychleji u uPro změny pokud možno nepoužívat silné kyseliny a zásady u upH 5 HAc pH 8 Tris upH 4 k.mléčná pH 9 DEA upH 2 H3PO4, H2SO4 pH 11 NaOH u uExtrémy pH – bílkovina silně ionizovaná a zůstává v rozpuštěném stavu ® nutná zpětná úprava pH Denaturace org.rozpouštědly uPří srážení organickými rozpouštědly – u T < 0 oC uPří denaturaci organickými rozpouštědly – u T = 20 – 30 oC uAlkoholy s delšími alifatickými řetězci mají větší denaturační vliv uT a pH musí být přesně definovány uEtOH, MetOH, aceton u u