Glucose oxidase (Aspergillus niger) NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4977376 Gene: XM_001389825 >XM_001389825.2:487-1737 Aspergillus niger CBS 513.88 glucose oxidase, mRNA ATGCAGACCCTCCTTGTGAGCTCGCTTGTGGTCTCCCTCGCTGCGGCCCTGCCACACTACATCAGGAGCA ATGGCATTGAAGCCAGCCTCCTGACTGATCCCAAGGATGTCTCCGGCCGCACAGTCGACTACATCATCGC TGGTGGAGGTCTGACTGGACTCACCACCGCTGCCCGTCTGACGGAGAATCCCAACATCAGCGTGCTCGTC ATCGAAAGTGGCTCCTACGAGTCGGACAGAGGTCCTATCATTGAGGACCTGAACGCCTACGGCGACATCT TTGGCAGCAGTGTAGACCACGCCTACGAGACCGTGGAGCTCGCTACCAACAATCAAACCGCGCTGATCCG CTCCGGAAATGGTCTCGGTGGCTCTACTCTAGTGAATGGTGGCACCTGGACTCGCCCCCACAAGGCACAG GTTGACTCTTGGGAGACCGTCTTTGGAAATGAGGGCTGGAACTGGGACAATGTGGCCGCCTACTCCCTCC AGGCTGAGCGTGCTCGCGCACCAAATGCCAAACAGATCGCTGCTGGCCATTACTTCAACGCATCCTGTCA TGGTACCAATGGTACTGTCCATGCCGGACCCCGTGACACCGGCGATGACTATTCCCCCATCGTCAAGGCT CTCATGAGCGCTGTCGAAGACCGAGGCGTTCCCACCAAGAAGGACTTCGGATGCGGTGACCCTCATGGTG TGTCCATGTTCCCCAACACCTTGCACGAAGACCAAGTTCGCTCCGATGCCGCTCGCGAATGGCTCCTTCC CAACTACCAACGTCCCAACCTGCAAGTCCTGACCGGACAATATGTTGGTAAGGTGCTCCTTAGCCAGAAC GGCACCACCCCTCGTGCCGTCGGCGTGGAATTCGGCACCCACAAGGGCAACACCCACAACGTTTACGCTG AGCACGAGGTCCTCCTGGCCGCGGGCTCCGCTGTCTCTCCCACAATCCTGGAATATTCCGGTATCGGAAT GAAGTCCATCCTGGAGCCCCTTGGTATCGACACCGTCGTTGACCTGCCCGTCGGCCTGAACCTGCAGGAC CAGACCACCGCTACCGTCCGCAGCCGCATCACCTCTGCTGGTGCCGGACAGGGTCAGGCCGCTTGGTTCG CCACCTTCAACGAGACCTTTGGTGACTATTCCGAAAAGGCACACGAGCTGCTCAACACCAAGCTGGAGCA GTGGGCCGAAGAGGCCGTCGCCCGTGGCGGATTCCACAACACTACCGCCTTGCTCATCTAG Predikce signálního peptidu: https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-6.0 # SignalP-6.0 Organism: Eukarya Timestamp: 20220302111854 # ID Prediction OTHER SP(Sec/SPI) CS Position XP_001389862.2_glucose_oxidase__Aspergillus_niger_CBS_513.88_ SP 0.000453 0.999507 CS pos: 16-17. Pr: 0.9474 Návrh Primerů: https://eu.idtdna.com/calc/analyzer FW: 5'- ATG CAG ACC CTC CTT GTG AGC -3' (5´CAG ACC CTC CTT GTG AGC TCG 3´) REV: 5'- GAT GAG CAA GGC GGT AGT GTT -3' Analýza restrikčních míst: http://heimanlab.com/cut2.html NcoI (CCATGG) a XhoI (CTCGAG) neštěpí a BamHI (GGATCC) neštěpí pET28a - bez N-tag a na C-konci HIStag FW: 5´ATATACCATGGGCCAGACCCTCCTTGTGAGCTCG 3´ REV: 5´ ATATACTCGAGGATGAGCAAGGCGGTAGTGTT 3´ pET28a - bez C-tag a na N-konci HIStag + T7Tag + trombin FW: 5´ATATAGGATCCCAGACCCTCCTTGTGAGCTCG 3´ REV: 5´ ATATACTCGAGCTAGATGAGCAAGGCGGTAGT 3´ Podmínky PCR: 95°C 2:30 1 x 95°C 10s 60°C 30s 40 x 72°C 60s 72°C 5 min 1 x pET28a https://www.helmholtz-muenchen.de/fileadmin/PEPF/pET_vectors/pET-28a-c_map.pdf Amplifikace Glukóza oxidázy z gDNA Aspergillus niger Materiál: Elizyme HS ROBUST MIX RED (Elisabeth Pharmacon) Primery - GOx_cHIS_FW, GOx_cHIS_Rev, GOx_NHIS_FW, GOx_NHIS_Rev PCR voda Složení PCR reakční směsi (50 ul) HS ROBUST MIX RED 25.0 ul FW primer (10 uM) 2.0 ul Rev primer (10 uM) 2.0 ul PCR voda 16.0 ul gDNA 5.0 ul Teplotní protokol: 95°C 2:30 1 x 95°C 10s 60°C 20s 40 x 72°C 50s 72°C 5 min 1 x Přečištění PCR produktu Materiál: Monarch® PCR & DNA Cleanup Kit (5 μg) (https://international.neb.com/-/media/nebus/files/protocols/t1030_quick_protocol_card_monarch_pcrd na_cleanup.pdf?rev=a562d8f1f21741b0ac6d59ea9020cef3&hash=E4845F80E8B2BE925A09DAD6562A41EC Izolace plasmidu pET28a ze 3 ml kultury E. coli Materiál: PureYield™ Plasmid Miniprep System (https://worldwide.promega.com/-/media/files/resources/protcards/pureyield-plasmid-miniprep-system- quick-protocol.pdf?rev=592591947f9c47efb5a576173f4f77f6&sc_lang=en) Restrikční analýza Materiál: Restriktázy NcoI-HF (https://international.neb.com/products/r3193-ncoi-hf#Product%20Information) XhoI (https://international.neb.com/products/r0146-xhoi#Product%20Information) BamHI-HF (https://international.neb.com/products/r3136-bamhi-hf#Product%20Information) Vektor pET28a Složení směsi RA (50 ul) CutSmart buffer (10x) 5.0 ul PCR produkt/vektor 15 ul PCR voda 28 ul NcoI-HF/ BamHI-HF 1.0 ul (10U) XhoI 1.0 ul (10U) Teplotní protokol: Inkubace při 37°C po dobu 1 hodiny Izolace naštěpeného PCR produktu a plasmidu z agarózového gelu Materiál: Monarch® DNA Gel Extraction Kit (https://international.neb.com/-/media/nebus/files/protocols/t1020_quick_protocol_card_monarch_dna_ gel_extraction.pdf?rev=09308c01500f43c6a8589b01845765d9&hash=0FD4350A9DE2AEAC84913DB2A00140AF) Ligace PCR produktu do vektoru pET28a Materiál: Instant Sticky-end Ligase Master Mix (https://international.neb.com/protocols/2012/08/27/protocol-transfer-master-mix-to-ice-prior-to-re action-set-up-mix-tube-by-finger-flicking-before-u) Protokol: 1. Transfer master mix to ice prior to reaction set up. Mix tube by finger flicking before use. 2. Combine 100 ng of vector pET28a with a 3-fold molar excess of insert and adjust volume to 5 μl with dH2O. 3. Add 5 μl of Instant Sticky-end Ligase Master Mix, mix thoroughly by pipetting up and down 7-10 times, and place on ice. The sample is now ready to be used for transformation. Transformace vektoru po ligaci do NEB 5-alpha E. coli Materiál: NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) (https://international.neb.com/products/c2987-neb-5-alpha-competent-e-coli-high-efficiency#Product% 20Information) Protokol: 1. Thaw a tube of NEB 5-alpha Competent E. coli cells on ice for 10 minutes. 2. Add 2 µl of plasmid DNA to the cell mixture. Carefully flick the tube 4-5 times to mix cells and DNA. Do not vortex. 3. Place the mixture on ice for 30 minutes. Do not mix. 4. Heat shock at exactly 42°C for exactly 30 seconds. Do not mix. 5. Place on ice for 5 minutes. Do not mix. 6. Pipette 950 µl of room temperature SOC into the mixture. 7. Place at 37°C for 60 minutes. Shake vigorously (250 rpm) or rotate. 8. Warm selection plates to 37°C. 9. Spread 50-100 µl of each dilution onto a selection plate and incubate overnight at 37°C. Výsledek sekvenace klonu EF20028811 ATTCCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCG GCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCCAGACCCTCCTTGTGAGCTCGCTTGTGGTCTCCCTCGCTGCGGCCCTGC CACACTACATCAGGAGCAATGGCATTGAAGCCAGCCTCCTGACTGATCCCAAGGATGTCTCCGGCCGCACGGTCGACTACATCATCGCTGGTGGAGGTC TGACTGGACTCACCACCGCTGCTCGTCTGACGGAGAACCCCAACATCAGTGTGCTCGTCATCGAAAGTGGCTCCTACGAGTCGGACAGAGGTCCTATCA TTGAGGACCTGAACGCCTACGGCGACATCTTTGGCAGCAGTGTAGACCACGCCTACGAGACCGTGGAGCTCGCTACCAACAATCAAACCGCGCTGATCC GCTCCGGAAATGGTCTCGGTGGCTCTACTCTAGTGAATGGTGGCACCTGGACTCGCCCCCACAAGGCACAGGTTGACTCTTGGGAGACTGTCTTTGGAA ATGAGGGCTGGAACTGGGACAATGTGGCCGCCTACTCCCTCCAGGCTGAGCGTGCTCGCGCACCAAATGCCAAACAGATCGCTGCTGGCCACTACTTCA ACGCATCCTGCCATGGTGTTAATGGTACTGTCCATGCCGGACCCCGCGACACCGGCGATGACTATTCTCCCATCGTCAAGGCTCTCATGAGCGCTGTCG AAGACCGGGGTGTTCCCACCAAGAAAGACTTCGGATGCGGTGACCCCCATGGTGTGTCCATGTTCCCCAACACCTTGCACGAAGACCAAGTGCGCTCCG ATGCCGCTCGCGAATGGCTACTTCCCAACTACCAACGTCCCAACCTGCAAGTCCTGACCGGACAGTATGTTGGTAAGGTGCTCCTTAGCCAGAACGGCA CCACCCCTCGTGCCGTTGGCGTGGAATTCGGCACCCACAAGGGCAACACCCACAACGTTTACGCTAAGCACGAGGTCCT Výsledek sekvenace klonu EF20028823 ATTCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGTGTGTCCATGTTCCCCAACACCTTGCACGAAGACCAAGTGCACTCCGAT GCCGCTCGCGAATGGCTACTTCCCAACTACCAACGTCCCAACCTGCAAGTCCTGACCGGACAGTATGTTGGTAAGGTGCTCCTTAGCCAGAACGGCACC ACCCCTCGTGCCGTTGGCGTGGAATTCGGCACCCACAAGGGCAACACCCACAACGTTTACGCTAAGCACGAGGTCCTCCTGGCCGCGGGCTCCGCTGTC TCTCCCACAATCCTCGAATATTCCGGTATCGGAATGAAGTCCATCCTGGAGCCCCTTGGTATCGACACCGTCGTTGACCTGCCCGTCGGCTTGAACCTG CAGGACCAGACCACCGCTACCGTCCGCTCCCGCATCACCTCTGCTGGTGCAGGACAGGGACAGGCCGCTTGGTTCGCCACCTTCAACGAGACCTTTGGT GACTATTCCGAAAAGGCACACGAGCTGCTCAACACCAAGCTGGAGCAGTGGGCCGAAGAGGCCGTCGCCCGTGGCGGATTCCACAACACTACCGCCTTG CTCATCCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTA GCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATTGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCG CATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCG CCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAACTTGATTA GGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAG Schéma obranné reakce rostlin po rozpoznání elicitorů reprezentovaných elicitiny (b-cryptogein) a flagelinem Struktura b-cryptogeinu Fluorescenční měření přenosu DHE V prvním měření bude analyzován transport sterolů mezi micelami. Principem je připravit dva druhy micel, mezi kterými by mohla probíhat výměna sterolů, a pomocí fluorescenčního měření kvantifikovat míru vlivu b-cryptogeinu na tento transport. Budou použity fluorescenční, samozhášivé micely tvořené dehydroergosterolem a nefluorescenční micely, obsahující dva různé sterolů. Měření je založeno na faktu, že dehydroergosterol podléhá jevu samozhášení, při výměně sterolů mezi dvěma druhy micel se od sebe molekuly dehydroergosterolu vzdálí, a fluorescence se tedy zvyšuje. Jako negativní kontrola bude použit aprotinin, což je podobně jako b-cryptogein malý bazický protein, který nevykazuje podobnou sterol transportní aktivitu. Měření bude prováděno na fluorimetru Fluoromax-4 od firmy Horiba (Horiba, Japonsko) při excitační vlnové délce 325 nm a emisní 370 nm. Budou prováděny tři sady měření, ve všech budou fluorescenční micely tvořeny dehydroergosterolem. Nefluorescenční micely budou tvořeny pro první sadu měření cholesterolem, pro druhou beta-sitosterolem. Tyto steroly budou rozpuštěny v methanolu. Měření bude probíhat v kyvetě s 1,2ml 10mM MES pufru o pH 7,0. Výsledná koncentrace DHE v měřené směsi bude 0,63 μmol/l a výsledná koncentrace sterolů bude 3 μmol/l. Nejdříve bude měřen pouhý pufr, následně bude přidán DHE spolu s dalším sterolem v odpovídající koncentraci a bude změřena basální hodnota fluorescence, která odpovídá spontánnímu transportu, následně bude přidán b-cryptogein a bude měřena změna fluorescence. Rozdíl naměřené hodnoty od bazální bude odpovídat míře schopnosti b-cryptogeinu transportovat steroly mezi micelami. Diagram fluorescenčního měření přenosu sterolů A B C Strukura dehydroergosterolu (A), beta-sitosterolu (B) a cholesterolu (C) Fluorescenční měření přenosu NBD-PC V dalším experimentu bude měřena schopnost b-cryptogeinu katalyzovat transport lipidů mezi akceptorovými a donorovými unilamelárními váčky. Váčky budou připraveny následujícím způsobem: pro donorové váčky bude 0,32 mg fluorescenčně značeného fosfatidylcholinu (NBD-PC), 0,08 mg fosfatidylserinu a 0,16 mg cholesterolu rozpuštěno v chloroformu. U akceptorových váčků bude použit neznačený fosfatidylcholin (PC) místo značeného. Chloroform bude odpařen pod proudem dusíku. Po odpaření budou přidány 2 ml 10mM MES pufru a směs bude sonikována. Měření bude prováděno v 1,2ml MES pufru o pH 7,0 v míchané kyvetě. Excitační vlnová délka bude nastavena na 460 nm a emisní bude nastavena na 534 nm. Do každé kyvety bude přidáno 10 µl směsi obsahující NBD-PC a 17 µl směsi obsahujíxí PC. Pro každé jednotlivé měření budou naměřeny hodnoty fluorescence před a po přidání b-cryptogeinu a z nich bude následně spočten rozdíl. Diagram fluorescenčního měření přenosu NBD-PC. 16:0-06:0 NBD PC (1-palmitoyl-2-{6-[(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine)