Proteínové komplexy v DNA replikácii Barbora Štefanovie, Ph.D. 31.3.2022 CG030 Struktura a funkce proteinových komplexů • Mechanizmy DNA replikácie sú vysoko konzervované • Replikácia DNA je semikonzervatívna (Watson and Crick, 1953, Nature) (Meselson and Stahl, 1958, Nature) DNA replikácia 5' → 3' • kontinuálna vs. diskontinuálna replikácia (leading vs lagging strand) • Okazakiho fragmenty (Okazaki et al, 1968, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.) © 2014 Nature Education Adapted from Pierce, Benjamin. Genetics: A Conceptual Approach, 2nd ed. All rights reserved. DNA replikácia v číslach Prokaryota (E.coli) • Genóm 4.5x106 bp • Presnosť 10-9-10-11 errors/bp • Rýchlosť ~ 60 kb/min • Počiatok replikácie: 1 • 30 min/celý genóm Eukaryota (človek) • Genóm 3x109 bp (700 x väčší) • Presnosť 10-6 errors/bp • Rýchlosť ~ 1-2 kb/min • Počiatok replikácie: 30000-50000/b.cyklus • 8h/celý genóm Figures from: Daniel Yuen at David Tribe Derivatives and Catherinea228 Dr. B. Fristensky and N. Brien, https://home.cc.umanitoba.ca/~frist/PLNT3140/l12/l12.html Fáze DNA replikácie 1. iniciácia - začiatok už v M/G1 (licensing), rozpletenie dvojšroubovice DNA, vznik replikačnej vidlice a naviazanie enzymatického komplexu 2. elongácia -pridávanie nukleotidov a postup replikačnej vidlice (topologický stres, ťažko replikovatelné lokusy, proteíny na DNA, transkripcia, poškodená DNA) 3. terminácia - ukončenie replikácie Proteínové komplexy v DNA replikácii • ORC1-6 • MCM2-7 helikáza • pre-RC –ORC1-6, CDC6, CDT1, MCM2-7 • pre-IC –MCM2-7, DDK, CDKs, TOPBP1, GINS, CDC45, Treslin • Replizóm –primáza, polymerázy, RPA, PCNA, RFC • Histon remodelačné komplexy • Chromatin remodelačné komplexy Fragkos et al, 2015_MolCellBiol Origin licencing /Origin firing • koniec M fáze a G1 fáza • kvasinky –ARS, niekoľko stoviek počiatkov • vyššie eukaryota –DNA topológia, štruktúra a prostredie chromatinu, desiatky tisíc počiatkov • ORC –konzervovaný, zabezpečuje väzbu MCM2-7 helikázy do počiatkov replikácie • MCM2-7 helikáza v neaktívnej forme (dvojitý hexamér) = origin licensing • aktivovaných len 10-20% (cicavce) MCM2-7 = origin firing • Origin licencing = označenie všetkých potenciálních počiatkov • Origin firing = výber aktívnych počiatkov, na ktorých dôjde k vytvoreniu replikačnej vidlice a následnej syntéze DNA • ostatné počiatky –backup pre prípad spomalenia alebo zastavenia susedných replikačních vidlíc (replikačný stres, poškodenie, transkripcia, ťažko replikovateľné lókusy,…) • mechanizmy, ktoré zabraňujú nedostatočnej alebo naopak nadmernej DNA replikácii Técher and Pasero_2021_Cell Počiatky replikácie • ARS Autonomously Replicating Sequences • v kvasinkách S.cerevisiae a príbuzných druhoch Saccharomycotina • miesta, do ktorých sa viaže ORC (pomocou WH domén a AT hookov) • 100-200 bp • A element (11 bp) vysoko konzervovaný 5' T/A T T T A Y R T T T T/A 3‘ (Y –pyrimidín, R-purín) Vyššie eukaryota –konzervovanosť sa vytratila • bohaté na A/T –ľahká väzba proteínov (narušenie vodíkových väzieb), rozhoduje epigenetika • G-kvadruplexy, počiatky transkripcie, DNáza-hypersenzitívne oblasti • Early replicating regions: H3K4me1/2/3, H3K9ac, H3K18ac, H3K36me3,a H3K27ac euchromatin • Late replicating regions: H3 a H4 hypoacetylácia, H3K9 a H3K27 metylácia často tkanivovo-špecifické Méchali, 2001_NatRev_Genetics Iniciácia 1. naviazanie MCM2-7 helikázy vo forme dvojitého hexaméru na DNA označenú pomocou ORC (origin recognition complex) 2. naviazanie ďalších pomocných faktorov a vytvorenie preiniciačného komplexu (pre-IC) 3. preskupenie MCM komplexu (inaktívna/aktívna helikáza) 4. „priming“ DNA replikácie upravené z Fragkos et al, 2015_MolCellBiol ORC Origin Recognition Complex - viaže sa na DNA v počiatkoch replikácie, remodeluje DNA, rekrutuje Cdc6 a MCM2-7 helikázu na DNA - ATPáza (AAA+ rodina) ORC1-5 - pentamérny kruh - evolučne príbuzné - AAA+ modul, C-term. HTH doména (WH, prvý kontakt s DNA) - otvorená (aktívna) vs.uzavretá (auto-inhibovaná) konfigurácia - ORC1 BAH doména (viaže sa na H4K20me2 = esenciálna interakcia pre asociáciu s chromatinom) ORC6 - odlišný pôvod, viaže sa na okrej pentaméru -interakcia s ORC3 -DNA sa viaže do centra pentaméru a dochádza k jej ohybu →rekrutovanie MCM2-7 Domain architecture of DmORC subunits and Cdc6 upravené zo Schmidt and Bleichert_ 2020_NatComm BAH = bromo-adjacent homology domain IDR = intrinsically disordered region BP = basic patch TFIIB = transcription factor IIB-like domain AAA+ modul • ATPases Associated with diverse cellular Activities • proteinová rodina, spoločný konzervovaný modul cca 230 aa • využívajú chemickú energiu z hydrolýzy ATP ku konformačným zmenám, ktoré následne pôsobia jako mechanická sila na iné makromolekulárne substráty • translokázy, helikázy,… • Walker A -GXXXXGK[T/S] • Walker B -hhhhD[D/E], h = hydrofóbna aa • SRH = second region of homology • Sensor 1, AF (Arginine Finger) –hydrolýza ATP • Sensor 2 a 3 Miller et al_ 2016_Archea (Vancouver B.C.) Pyrobaculum aerophilum ORC D. melanogaster upravené zo Schmidt and Bleichert_ 2020_NatComm cryo EM  ORC1  ORC2  ORC3  ORC4  ORC5  ORC6  CDC6 ORC D. melanogaster upravené zo Schmidt and Bleichert_ 2020_NatComm ISM = initiator-specific motif RF = arginine finger BP = basic patch –binds DNA backbone B loops –Orc1, Cdc6 -extended DNA binding site, off-center position of the DNA in the ORC-Cdc6 channel ORC S.cerevisiae upravené z Feng et al_ 2021_NatComm Comparison of DNA binding by ORC complex D.melanogaster vs S.cerevisiae Feng et al_ 2021_NatComm MCM2-7 • MiniChromosome Maintenance • Archaea: 6 identických podjednotiek, hneď aktívna SS, Sulfolobus solfataricus • Eukaryota: podjednotky: 5-3-7-4-6-2 ring • sama o sebe nemá helikázovú aktivitu • potrebuje cdc45 a GINS • rodina AAA+ ATPáz • 3' → 5' helikáza • iniciácia (preRC ) + elongácia (CMG) • postupuje s replikačnou vidlicou Loading: • pomocou ORC-Cdc6 komplexu a Cdt1 (Chromatin licensing and DNA replication factor 1) v G1 • po väzbe je MCM2-7 komplex SUMOylovaný –zabránenie predčasnej aktivácie Aktivácia počas S fáze • fosforylácia pomocou CDK a DDK protein kináz • MCM2-7 už nie je sumoylovaný, ale fosforylovaný • aktivácia postupne, len v niektorých počiatkoch • záloha v prípade pozastavených replikačných vidlíc Zhai and Tye_ 2017_DNARep MCM2-7 –štruktúra podjednotiek N-koncová doména NTD - interakcia medzi MCM podjednotkami • A -α-helixy, regulácia helikázovej aktvity • OB fold –väzba na ssDNA • Zinc-binding motif -stabilizácia N-koncov a komplexu • N-koncový β-hairpin -interakcia s DNA C-koncová doména CTD • AAA+ ATPázová doména - evolučne konzervovaná Walker A (väzba ATP), H2i -helix 2 insertion β hairpin (väzba DNA), Walker B (hydrolýza ATP), PS1 -presensor 1 (väzba DNA), RF -arginine finger • Degenerovaná Winged Helix - proteín-interakčné motívy Riera et al_ 2017_GenesDev Aktivácia MCM helikázy S.cerevisiae: • Cdt1 –väzba na N-koncové regióny Mcm2, Mcm6 a Mcm4 = stabilizácia, single hexamer (SH) je naviazaný na ORC-Cdc6 v replikačných počiatkoch = ORC–Cdc6–Cdt1–MCM2–7 (OCCM) komplex • uvoľnenie Cdc6 a Cdt1 • naviazanie druhého MCM2/7 komplexu (za pomoci Cdc6, Cdt1 a ORC) a tvorba „head-to-head“ dvojitého hexaméru (DH) = pre-replikačný komplex (pre-RC) • pre-RC nemá helikázovú aktivitu až do S-fáze • na rozhraní G1 a S-fáze –aktivácia pomocou DDK (Dbf4-dependent kinase), S-CDK (S-phase-specific cyclin-dependent kinase) a ďalších faktorov = tvorba dvoch aktívnych Cdc45–Mcm2–7–GINS (CMG) helikáz (pre-iniciačný komplex) • aktivácia pre-iniciačního komplexu –oddelenie DH do dvoch aktívnych helikáz, naviazanie polymeráz do replikačnej vidlice = vznik aktívneho replizómu Kang et al_ 2014_MolCell Riera et al_ 2017_GenesDev interactions via NTD ZFs hinder ring opening MCM2-7 –cryo-EM štruktúra, S.cerevisiae Noguchi et al_ 2017_PNAS Kontakty s DNA: - ZF (zinc finger) - H2I (helix 2 insertion loop) - PS1 (presensor 1) MCM2-7 –cryo-EM štruktúra, S.cerevisiae Noguchi et al_ 2017_PNAS A lagging-strand DNA extrusion model Georgescu et al_ 2016_PNAS Noguchi et al_ 2017_PNAS I. – konformačné zmeny spôsobené naviazaním aktivačných faktorov – presunutie lagging-strandu II. - naklonenie a posunutie N-vrstiev MCM2-7 kruhov, vytlačenie lagging-strandu cez Mcm2-Mcm5 „brány“ III. - 2 aktívne helikázy putujú proti sebe v smere 3'-5‘ IV. - obojsmerný pohyb replikačnej vidlice CMG komplex • MCM hexamér • GINS komplex • Cdc45 • Cdc45 a GINS sa viaže na NTD MCM komplexu • helikázová aktivita na dsDNA • Cdc45 a GINS spôsobuje: -remodeláciu MCM dvojitého hexaméru (DH) -vyššiu affinitu MCM DH k DNA • CMG ostáva naviazaný na DNA až do terminácie replikácie –ubikvitinácia = degradácia Sun et al_ 2016_Nucleus Cdc45 Cell Division Cycle 45 - konzervovaný - dve RecJ-like α/β domény oddelené krátkou helikálnou inter-doménou (ID) - ID stabilizuje NTD domény Mcm2 a Mcm5 - protruding helical motif (PHM)stabilizácia Pol2 - viaže sa na M2 a M5 podjednotky MCM komplexu - Meier-Gorlin syndróm Bai et al_ 2017_Adv Exp Med Biol GINS • akronym z prvých písmen japonských čísel 5-1-2-3 (go-ichi-ni-san) = 4 proteínové podjednotky komplexu: Sld5, Psf1, Psf2, and Psf3 • vyskytuje sa aj u Archaea • aktivácia MCM komplexu pomocou zmeny štruktúry • má centrálný pór, ale príliš malý pre ssDNA • interaguje s Mcm3/5 na N koncoch a s Cdc45 • slúži ako „scaffold“ pre replizóm • rekrutuje ďalšie proteiny replizómu (napr. DNA Polα, DNA Polε...) • GINS ani Cdc45 nemajú ATPázovú aktivitu Carroni et al_ 2017_SciRep upraveno z Bai et al_ 2017_Adv Exp Med Biol Elongácia • na vedúcom a opožďujúcom sa vlákne • 3 DNA polymerázy z 13 sa u eukaryot zúčastňujú replikácie • DNA Polα, Polδ a Polε • CMG helikáza rozplieta dsDNA na dve ssDNA vlákna • na ssDNA nasadá RPA , ktorá ju chráni pred nukleázami a tvorbou sekundárnych štruktúr • tvorba RNA/DNA primerov na templátoch na oboch ssDNA vláknach pomocou komplexu Primáza-Pol α • DNA polymerázy predlžujú primery • Primery sa vyštiepia, medzery sa dosyntetizujú • Ligáza spojí ešte nespojené konce novo syntetizovaného reťazca • Topoizomerázy I a II relaxujú DNA RPA • Replication Protein A • zabraňuje tvorbe sekundárnych štuktúr ssDNA • chráni ssDNA pred endonukleázami • úloha v replikácii a v oprave DNA • heterotrimér 1:1:1 RPA70 (70kDa subunit) RPA32 (32kDa subunit) RPA14 (14kDa subunit) • väzba na DNA pomocou šiestich OB foldov A-E (oligonucleotide/oligosaccharide binding motívov) • viaže RFC (špecifita pre PCNA) Pokrhel et al_ 2019_NSMB Ustilago maydis DNA Polα • nízka procesivita • bez proofreadingovej aktivity = nemá 3'-5' exonukleázovú aktivitu • Polα asociovaná s primázou, s ktorou tvorí heterotetramér • inicializuje syntézu DNA na oboch reťazcoch • pre aktivitu potrebuje CMG helikázu a RPA • na CMG helikázu sa viaže pomocou Ctf4 homotrimeru (Chromosome Transmission Fidelity 4), ktorý je v kontakte s GINS Yuan et al_2019_eLife Primozóm = Polα-primáza • Primázový podkomplex: -kvasinky: Pri1 -katalytická a Pri2 -človek: p49 -katalytická a p58 -vytvorí 2-10 nukleotidov dlhý RNA primer na templátovej DNA • Polymerázový podkomplex: -kvasinky: Pol1 -katalytická a Pol12 človek: p180 -katalytická a p70 -predĺži RNA primer vytvorený primázovým komplexom RNA-DNA = hybridný primer -flexibilné linkery pre konformačné zmeny Baranovskiy et al_2016_J Biol Chem Syntéza primerov 1. p58C sa priblíži k p49 –iniciácia syntézy RNA primeru 2. pri elongácii RNA primeru p58C pohybujúca sa spolu s RNA primerom vytlačí p180 3. keď dĺžka primeru dosiahne 9 nts p58 inhibuje p49 4. takto vytlačená p180 je v pozícii, že sa môže naviazať na 9 nts dlhý RNA primer 5. Polα predĺži primer 6. Keď primer dosiahne dĺžku cca. 30 nts, Polα sa vymení za Polδ alebo Polε • Polα špecificky rozpoznáva RNA/DNA komplex vytvorený primázou a začne polymerizovať RNA primer pridávaním dNTP • po nasyntetizovaní určitej dĺžky DNA Polα stratí kontakt s RNA/DNA A-šroubovicou a uvoľní sa z DNA Baranovskiy et al_2016_J Biol Chem Syntéza primerov Baranovskiy et al_2016_J Biol Chem PCNA a RFC - objavené ako esenciálne proteiny pre replikáciu SV40 v ľudských buňkách • PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) - konzervovaný od Archaea až po eukaryota - kĺzavá svorka na DNA • RFC (Replication Factor C ) - potrebný k uchyteniu PCNA na DNA - ATPázová aktivita AAA+ ATPáza - 1 velká (RFC1) a 4 malé podjednotky (RFC2-5) - rozpoznáva 3' koniec primeru - spôsobuje konformačnú zmenu PCNA - otvára kruhovú formu za hydrolýzy ATP - úloha v replikácii, v oprave DNA, v kontrole bunkového cyklu, v epigenetike - v replikácii: • upevňuje polymerázu k DNA • zabraňuje predčasné uvolnenie polymerázy z DNA • esenciálne pre výmenu Pol α za Pol δ/ɛ • výmena DNA polymeráz pri pozastavených replikačných vidlíc • PCNA je z DNA odstránený na začiatku G2 fáze pomocou ELG1 RFC-like komplexu Miyata et al_2004_NSMB PCNA • homotrimér • každá podjednotka má IDCL (Inter-domain connecting loop) • potrebný pre väzbu interakčných partnerov (Polδ, p21, DNA ligáza...) • C-teminálna časť: interakcia s Polɛ, RFC, ... • vnútorná časť: pozitívne nabité šroubovice–kontakt s DNA PIP box (PCNA Interacting Peptide): • Q-X-X-L/M/I-X-X-F/Y-F/Y • motív interagujúci s PCNA IDCL • obsahujú ho proteíny interagujúce s PCNA • DNA polymerázy, Dnmt1, p21, Fen1, DNA ligáza... APIM (AlkB homologue 2 PCNA Interacting Motif) • proteiny zúčastňujúce sa opravy DNA PCNA kód • posttranslačné modifikácie PCNA určujúce väzbových partnerov a funkciu PCNA Dieckman et al_2012_The Eukaryotic Replisome: a Guide to Protein Structure and Function Ahmed et al_2017_NAR DNA polymerázy δ a ε • 5' - 3' DNA polymerázová aktivita • 3' - 5' exonukleázová aktivita • mutácie v exonukleázovej doméne polymeráz v nádorových bunkách • po DNA putujú pomocou PCNA • výmena polymerázy α za δ alebo ε po syntéze primeru • Polα má afinitu k A-helixu RNA/DNA a z B-helixu DNA/DNA disociuje • RFC loaduje PCNA na koniec primeru a na PCNA sa naviaže Pol δ alebo ε • Polδ syntetizuje opožďujúci sa reťazec • Polε syntetizuje vedúci reťazec • Polδ a Polε nemajú 5' – 3' exonukleázovú aktivitu, ktorou by vedeli vyštiepiť primery • túto úlohu vykonáva RNáza H1 a FEN1 • polymerázy zaplnia medzery, DNA ligáza zliguje nespojené konce O’Donnell and Kurth_2013_Encyclopedia of Biophysics Polymeráza δ • katalytická podjednotka polymeráz: tvar ľudskej ruky - „dlaň“ je vysoko konzervovaná –polymerázová aktivita - „palec“ drží DNA na mieste a zvyšuje procesivitu • 3' - 5' proofreading - oprava chýb pri replikácii, maturácia Okazakiho fragmentov • syntetizuje DNA na opožďujúcom sa reťazci až po ďalší primer (vytvorený DNA Polα) • po strete s ďalším primerom dosyntetizuje ešte pár nukleotidov a vytesní kus RNA primeru • vyčnievajúci 5' koniec RNA primeru je po tom rozpoznaný FEN1 nukleázou, ktorá ho vyštiepi • DNA ligáza spojí Okazakiho fragmenty Lancey et al_2020_NatComm Polymeráza δ –ľudská, cryoEM Lancey et al_2020_NatComm Polymeráza ε • objavená v 1990 ako tretia DNA polymeráza esenciálna pre replikáciu S. cerevisiae • dvojnásobná veľkosť oproti Polδ • najväčšsia podjednotka (p261/Pol2) obsahuje: - NTD = katalytickú časť (syntéza a proofreading) - CTD -protein-proteinové interakcie • pre svoju aktivitu nepotrebuje PCNA • mooring helix: - tvar L, koncová časť linkeru medzi NTD a CTD - rekrutuje Dpb3-Dpb4 podjednotky • Dpb3, Dpb4 –neesenciálne, ale udržujú rigidnú štruktúru Polε upraveno z Yuan et al_2020_NatComm • calcineurin-like PDE domain • HF – histone fold • C –C-term. region Leading ssDNA path from the CMG helicase to the Polε Yuan et al_2020_NatComm Podjednotky polymeráz H.s. vs S.c. Doublie and Zahn_2014_Front. Microbiol. Terminácia • keď sa 2 replikačné vidlice stretnú • na konci S-fáze, ale v skutočnosti sa replikony terminujú v priebehu S-fáze • veľkosť replikonu: 31 kbp, rychlosť replikačnej vidlice: 1,5 kb/min •  za 10 minút od začiatku replikácie sa dve replikačné vidlice stretnú a dojde k terminácii replikácie • RFB (Replication Fork Barrier): - špecifické miesta genómu, ktoré dokážu zastaviť replikačnú vidlicu - pri replikácii rDNA –RF v opačnom smere ako rDNA transkripcia • odstránenie CMG: - Mcm7 je polyubikvitylovaná na K48 - Cdc48 rozpozná polyubikvitinylovaný CMG komplex a oddelí ho od chromatinu - PCNA je z chromozómu odstránený na začiatku G2 fáze pomocou ELG1-RFC-like komplexu Ľudský replizóm • model vychádzal z kvasiniek • obsahuje proteíny, ktoré nemajú ortológov v kvasinkách (rozpadnutie replizómu, stabilita replizómu a prepojenie replikácie s DNA opravou) • CMG helikáza - MCM2-7+CDC45+GINS - N-vrstva = helikálne OB a ZnF domény - C-vrstva = ATPázové domény • model vychádzajúci z cryoEM D.m. CMG: - vedúci reťazec je tlačený cez centrálny kanál MCM2-7, zatiaľ čo opožďujúci reťazec sa viaže mimo póru (MCM3 a MCM5 ZnF domény) - NTH (N-terminal hairpin) MCM7 –otočený k poslednému páru báz dsDNA –funkcia v separácii dvojšroubovice? • Polε (POLE1 = Pol2 S.c. , POLE2 = Dpb2, POLE3 = Dpb3, POLE4 = Dpb4 ) • FCP (Fork Protection Complex) -rýchly a efektívny postup replizómu, prepojenie replikácie a ďalších procesov (SCE) a aktiváciu checkpointov - TIMELESS-TIPIN (S.c. Tof1-Csm3) - CLASPIN (S.c. Mrc1) • AND-1 (S.c. Ctf4) –trimér, „scaffold“ –základňa pre väzbu ďalších proteínov na replikačnú vidlicu Jones et al_2021_EMBOJ Cryo-EM štruktúra „jadra“ ľudského replizómu Jones et al_2021_EMBOJ Replikácia v baktériách Escherichia coli • počiatok oriC (245 bp, DnaA sa viaže na 4 špecifické 9méry → rozvoľnenie DNA v 13-mérových repelciách → naviazanie helikázy • koniec Ter región naproti oriC (cirkulárny chromozóm) • DnaB = helikáza • DnaG = primáza -syntéza RNA primerov (10 nts) • SSB –tetramer, ochrana ssDNA • DNA polymerase III –heterotrimér: α, ε a θ –syntéza oboch reťazcov - PolIIIα –syntéza DNA - PolIIIε –proofreading (3' – 5' exonukleáza) - PolIIIθ –neesenciálna, stabilizuje ε • (PolIIIβ)2 –kĺzavá svorka, procesivita polymerázy • CLC (Clamp Loader Complex) –loader svorky -podjednotky PolIIIδ(γ/τ)3δ’ψχ Oakley_2019_ProtSci Replikácia v baktériách Escherichia coli https://wou.edu/chemistry/courses/online-chemistry-textbooks/ch450-and-ch451-biochemistry-defining-life-at-the-molecular-level/chapter-9-dna-replication-and-repair-2/ Replikačný stres = spomalenie alebo zastavenie replikačných vidlíc • mutácie, neobvyklé DNA štruktúry, CFS (Common Fragile Sites), konflikty replikácia-transkripcia, pôsobenie chemikálií /liekov, aktivácia onkogénov ... • ak nie je pod kontrolou –kolaps replikačných vidlíc –tvorba DSB (Double Strand Breaks) –narušenie stability genómu (mutácie, Copy Number Alterations CNAs, chromozomálne preskupovanie,...) • mutácie v replikačnej mašinérii a kontrole –vývojové vady, stárnutie, anémia, rakovina,... Primo and Teixeira_ 2019_GenetMolBiol Replikačný stres Kegel and Sjӧgren_ 2010_Cold Spring Harb Symp Quant Biol Shilkin_ 2020_Biochemistry SMC5/6 v replikácii Kegel and Sjӧgren_ 2010_Cold Spring Harb Symp Quant Biol upravené z Paleček_ 2018_Genes Translokáza, ATPázová aktivita, väzba ssDNA, dsDNA Ďakujem za pozornosť 