Kvantitativní metody analýzy * ^ interakce protein-protein Ctirad Hofr LifeB - Laboratoř interakce a funkce esenciálních Biomolekul Funkční genomika a proteomika Národní centrum pro výzkum biomolekul II U l\l I lablifeb.org S C I IPřehled kvantitativních metod analýzy protein-protein interakcí Teorie = základ praxe Vazebná křivka, rovnovážná disociační konstanta, lineární rozsah detektoru. Fluorescence počtem vede, ale jde to i bez ní Stanovení vazebné afinity fluorescenčně značných proteinů - fluorescenční anisotropie, microscale thermophoresis, detekce vazby molekul imobilizovaných na povrchu - surface plasmon resonance; studium vazby nemodifikovaných proteinů přímo v roztoku - izotermální titrační kalorimetrie. Která je nejlepší - srovnání metod Shrnutí praktických výhod a nevýhod kvantitativních metod analýzy interakce protein-protein. lablifeb .org f I U III SCI Vazebná křivka 1 isoterma Pro vazbu dvou proteinů A,B a vznik komplexu A.B při konstantní teplotě A+B A.B zapíšeme rovnovážné konstanty asociační KA a disociační KD K A = [AB] = [A] [B] [A][B] ° [AB] Jestliže přidáváme postupně protein B k proteinu A, vazebnou křivku lze vyjádřit rovnicí % vazby [B] lablifeb [B] + KD 100% Závislost míry vazby na celkové koncentraci přidaného proteinu B 100 75 -Q CD 50 > 25 0 K 20 40 60 Koncentrace proteinu [B] .org KD disociační konstanta - koncentrace proteinu, při které je právě polovina molekul v komplexu 100 f I U III SCI Vazebná křivka 2 odvození rovnice funkce - hyperbola Míru vazby vyjádříme poměrem koncentrace komplexu A.B a celkové koncentrace proteinu A násobený 100%. [A-B] Y = %vazby = —-- £^ rn /~\ m 100% lTOT Po dosazení za A.B a AT0T získáme rovnici pro vazebnou křivku [A-B] =KA[A][B] AT0T = [A'B] + [A] K D Závislost míry vazby na celkové koncentraci přidaného proteinu B 100 o 20 40 60 80 Koncentrace proteinu B % vazby = [B] [B] + KD 100% 100 lablifeb .org Vazebná křivka je hyperbola s hodnotou disociační konstanty KD ve jmenovateli. fI U II I SCI i Vazebná křivka 3 | logaritmus koncentrace = sigmoida Jestliže přidáme k proteinu A protein B v dostatečně širokém rozsahu koncentrací, vazebnou křivkou závislosti míry vazby na logaritmu koncentrace B je sigmoida. % vazby = [B] [B] + KD 100% Závislost míry vazby na logaritmu celkové knnr*ontrarťi nřiHíinóhrí nrntoinii R 100 75 _Q N CD > 50 KDdisociační konstanta - inflexní bod sigmoidy Sklon sigmoidy - míra kooperativity vazby v případě, že se váže více molekul B na jednu molekulu A. 0 KD lablifeb jfOf .org Jak mění kooperativita vazby tvar sigmoidy? https://en.wikipedia.ora/wiki/H ill_equation_(biochemistry) 0.1 1 10 100 1000 Logaritmus koncentrace proteinu log 10 [B] Poznejte svůj detektor - lineární rozsah detektoru = přesná kvantitativní měření Celkově má detekční křivka průběh sigmoidy. Pro přesné kvantitativní měření je nezbytné, aby byl přírůstek signálu přímo úměrný přírůstku koncentrace komplexů protein-protein. To je splněno pro lineární rozsah detektoru - oblast detekce, kde po zvýšení koncentrace např. dvakrát zvýší hodnota signálu také dvakrát. Oblast pod lineárním rozsahem - jsme blízko minimálnímu detekčnímu limitu = nelineární odezva. Oblast nad lineárním rozsahem - detektor je zahlcen signálem - saturován, velká změna koncentrace způsobí relativně malé a nelineární zvýšení signálu. o CD CD "O O) 00 Saturace detektoru Lineární rozsah detektoru Detekční limit Koncentrace lablifeb Vždy si zjistit lineární rozsah detektoru. Při kvantitativních měřeních je org nezbytné, aby se měřené hodnoty nacházely v lineárním rozsahu detektoru. Fluorescenční stanovení vazebné affinity z anizotropie Anisotropie fluorescence - princip „Usměrněnosť emitovaného světla se zvýší po vytvoření komplexu protein-protein; po excitaci lineárně polarizovaným zářením dochází k emisi fluorescence značené molekuly převážně v jednom směru. Prakticky - značíme menší z proteinů. - stačí naznačit 100 jig proteinu v kyvetě. - přidávaný protein není značený. - celková koncentrace přidávaného proteinu je minimálně 10x větší než koncentrace značeného proteinu Excitace v jednom čas od excitace po emisi fluorescence O t ~ ns Emise fluorescence nízká anizotropie vysoká anizotropie usměrněnosť 0 0 100 75 co 50 > i_ ô 8 t t 25 0 i Složení roztoku v měřící kyvetě 0 20 40 60 80 100 Koncentrace přidávaného proteinu Anisotropie fluorescence měření r = hl-1!. IVV~IVH IlI + 2I± Iyy + 2IVH ť" I. analyzátor detektor polarizátor Hodnota anizotropie r je podíl Prakticky - Přístroj - fluorometr s polarizátorem excitačního světla a otočným polarizátorem = analyzátorem vyzářené fluorescence pro zjištění intenzity v různých směrech. - Potřebujeme ~ 10x vyšší koncentraci než na měření klasické fluorescence lw+2lVH ve 3D všech třech směrech fluorescence - polarizátory propouští lOx měně světla, šíření fluorescence. - Hodnota anisotropie r je bezrozměrná veličina (podíl čísel). rozdílu lw- lVH intenzity fluorescence při rovnoběžném (vertikálním) a kolmém (horizontálním) natočení analyzátoru vůči excitačnímu polarizátoru a celkové intenzity lablifeb .org n/i u n i SCI IMicroscale thermophoresis MST Princip MST Vytvoříme lokální teplotní gradient - ozáříme vzorek v kapiláře infračerveným laserem. Vzorek zároveň osvětlujeme excitačním světlem pro fluorofor, kterým je značený menší protein. Detekujeme pohyb fluorescenčně značených molekul jako změnu fluorescence v mikrooblasti osvětlené IR laserem. Při konstantní koncentraci fluorescenčně značeného proteinu zvyšujeme koncentraci přidávaného neznačeného proteinu = ligandu. Sledujeme snížení míry poklesu fluorescence v čase se vzrůstající koncentrací ligandu. I lablifeb https://en.wikipedia.org/wiki/Microscale_thermophoresis Čas ozařování vzorku ~ 20 s IUI Ulli SCI Prakticky MST měření protein-protein interakce Fluorescenčně naznačíme menší protein. Vytvoříme ředící řadu druhého proteinu = ligandu jeho postupným ředěním 2x. Smícháme roztoky tak, že koncentrace značeného proteinu je stejná, ale koncentrace ligandu se mění v rozsahu 5 řádů. Vzorky nasajeme do kapilár (5uL). Měříme změnu fluorescence po zapnutí IR laseru. Vyneseme změnu fluorescence v závislosti na logaritmu koncentrace ligandu. Z inflexního bodu sigmoidy určíme disociační konstantu vzniku komplexu protein-ligand. lablifeb .org 1 IR-laser on Ugand Fluorescent molecule Saturation 4 20i 1 15 o c f IR-laser off 10 5 0 Baseline .4 I I I HIHI—I I I HIHI—I I I ■ 111 ■!—I I I M 111 10 10 0.01 0.1 Ligand (nM) 10 Obrázek laskavě poskytl Dr. Josef Houser, CORE FACILITY Biomolecular Interactions and Crystallization http://bic.ceitec.cz/cs mi u n i s c I MST - Microscale Thermophoresis Glass capillary IR laser OFF A 1 1. 2. Initial state - initial fluorescence of sample. Thermophoresis - change in fluorescence due to the thermophoretic motion of molecules. 3. Steady state - local concentration of molecules decreases in the heated region until it reaches a steady-state distribution. Back-diffusion - fluorescence recovery driven by mass diffusion of molecules. 4. Time připravil Tomáš Janovic Analyzing protein-protein interaction with MST Measuring MST for ligand serial dilution Evaluating interaction affinity * F Time o D Ligand concentration připravil Tomáš Janovic IInterakce protein-protein na povrchu Surface plasmon resonance - SPR Evanescentní vlna plazmonů - rezonujících elektronů na povrchu = surface resonance plasmons, které absorbují část světla Princip Na přechodu mezi sklem a zlatou vrstvou ideálně o tloušťce 50 nm dochází k odrazu světla - laseru. Při rezonančním úhlu 0 dochází ke zvýšené absorpci, která je zaznamenána detektorem. Vzniká evanescentní (mizející) vlna rezonančních elektronů = plazmonů, která se vzdáleností od povrchu postupně slábne. Dosah evanescentní vlny je přibližně 100 nm do prostoru roztoku. Plazmony jsou velmi citlivé na změny prostředí, ve kterém se pohybují. SPR tak umožňuje detekovat změny díky vazbě proteinů na povrchu zlaté vrstvy. Zlato je pokryto dextranem, na který se imobilizuje jeden interakční protein. Druhý protein je přidáván do pufru, kterým je promýván povrch s imobilizovaným proteinem. Po vzniku komplexu protein-protein na povrchu dochází ke změně rezonančního úhlu 0, kterou detekujeme. Sledujeme kinetiku vzniku komplexů v reálném čase. průtok 0 o * o o „ U c Zdroj světla -laser Au 50 nm T Rezonanční úhel, kdy vznikají plazmony Detektor Skleněný hranol SPR prakticky Imobilizujeme protein L - ligand na SPR čip. Nasytíme vazebná místa na povrchu bez průtok imobilizovaného proteinu L. Promyjeme čip pufrem. Promýváme čip druhým proteinem A - analyt. Detekujeme změnu signálu. Počáteční část křivky ukazuje kinetiku asociace obou proteinů. Závěrečná část křivky popisuje kinetiku disociace obou proteinů. Fitovaním vazebných modelů určíme hodnoty rychlostní asociační ka a disociační kd konstanty. Asociační rychlostní konstanta ka popisuje rychlost tvorby komplexů, tj. počet komplexů LA vytvořených za sekundu v jednomolárním roztoku L a A. Jednotka ka MV1 v biologických systémech je hodnota ka mezi 1.103 a 1.107. Disociační rychlostní konstanta kd popisuje stabilitu komplexu, tj. podíl komplexů, které se rozpadnou za sekundu. Jednotka kd je s-1 a v biologických systémech se obvykle pohybuje mezi 1.10 1 a 1.106. Když kd l,10-2s 1 = 0,01 s_1. To znamená, že 1 % komplexů se rozpadne za sekundu. Asociace Saturace Disociace .0 o průtok O o 0 © 0 o ® í) 0 © (Do o o Q (Q) o (D 1 Čas (s) Z poměru kd a ka určíme rovnovážnou disociační konstantu KD www.sprpaaes.nl ITC - Izotermálnítitrační kalorimetrie popis interakce měřením reakčního tepla Princip Měříme reakční teplo, které se uvolní nebo spotřebuje po přidání proteinu injektorem do roztoku proteinu v měřící cele. Injektor má tvar lodního šroubu, který míchá směs v měřící cele. Teplota cely se vzorkem je srovnávána s teplotou referenční cely, která obsahuje pouze pufr. Když dojde ke změně teploty mezi celami, dojde k zahřátí nebo ochlazení cely se vzorkem. Teplo, které je vyměněno pro vyrovnání teplot je zapsáno po každém přídavku proteinu z injektoru. Výsledkem je titrační křivka - sigmoida. Ze známých molárních koncentrací a změny tepla určíme molární vazebnou entalpii - teplo vazby proteinů. http://www.youtube.com/watch?v=cYj5IOELaVI https://voutu.be/o lpWcWKNXI?t=44 ITC prakticky Určíme co nejpřesněji koncentrace proteinů. Změříme „blank" titraci - pufr v injektoru, protein v cele při 25°C. Dáme do injektoru druhý protein s desetkrát vyšší koncentrací, než je první protein v cele. Změříme titrační křiku. Odečteme „blank" titraci od titrační křivky. Normalizujeme na koncentrace proteinů v cele a injektoru. Proložíme výslednou sigmoidu vhodným modelem vazby. Výška křivky udává vazebnou entalpii, sklon odpovídá rovnovážné asociační konstantě a inflexní bod odpovídá molárnímu poměru vazby proteinů. Z jednoho měření lze získat kompletní termodynamický popis vazby AH, AS, AG, KA a stechiometrii vazby N. lablifeb .org Time (min) -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 1 i 1 90 0- % -1 J 0- < Q "Ö .E 1 -80 -I -100-1 -120 i 1 i 1 i 1 i 1 i i 1 i —i—i—i—i—i—i—r AH = -108 kcal moľ "20H Ä3 = -317calK1moľ .40 j K= 1.63 107 N = 0.25 -60 H —I-1-1-1-1--T1-1-1-1-1— 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 Molar ratio 0.5 Vazebná entalpie AH Stechiometrie N Vazebná konstanta Ka Volná energie AG vypočtena z AG = -RT\r\Ka Změna entropie AS vypočtena z AG = AH -TAS I HUNI SCI 9 I Srovnání kvantitativních I metod 01 23456789 10 ■ Spotřeba vzorku ■ Délka přípravy vzorku a měření ■ Přesnost určení KD ■ Uživatelská přívětivost Modifikace proteinu 9 Ano - značenífluoroforem SPR 7 Ano - imobilizace na povrchu Kde se můžete dozvědět více? C7230 Fluorescenční metody ve vědách o životě -cesta od molekuly k buňce C7235 cvičení Teoretická vysvětlení principů fluorescence a praktická výuka aplikace fluorescenčních přístupů Podzim 2021 F9070 Experimentální metody biofyziky Přednášky odborníků a exkurze do výzkumných laboratoří mezinárodně uznávaných společností Podzim 2021 IPrakticky - fitování vazebné křivky pro chytré hlavy Vyzkoušet, jak se mění tvar vazebné křivky ^ v závislosti na KD si můžete v souboru KD_vliv_na_tvar_krivkv.xlsx když ručně změníte hodnotu KD na řádku 16. Automatické fitování dat v Excel minimalizací součtu druhých mocnin odchylek měřených dat a fitovaných hodnot za použití doplňku Řešitel (Solver) si můžete vyzkoušet v souboru Automat_KD_fit.xlsx Videonávod, jak aktivovat doplněk Řešitel (Solver) v programu Excel je v souboru Resitel_Solver_0N.mp4 http://www.lablifeb.org/courses/ 1 c Protein [x] fit hodnot % vaiby [y] y=100ex/(x+KD) 2 C 0 0.00 100 3 2 17 1.9& 90 SO 70 SC 5í 4C 30 20 >-i 4 5 33| 4.76 Z ,5 43 6.98 • ^ 10 50 9.09 • q_ 15 ~6o1 13.04 s g 23 30 70 IS.70 75 23.08 -• 10 45 82 31.03 li &0 8&| 37.50 • 12 SO 89 44.44 í 100 91 50.00 • KE 17 •- 10 Iß 19 0 1 20 Kor centra c e proteinu [B] 21 1 ? 3 c Protein fx] % vazby [y) fit hodnot residuals y=100:tx/(x+KD) J_fit-y square residuals (fit V)2 0 0 0.00 0.00 O.Öoj 100 í 17 1.96 15.M 226.18 90 5 7.5 43 6.9s 36.02 1297.67 i • * ej 10 50 9.09 40.91 1673.55 bu • 7 15 60 13.04 46.96 2204.91 f 50 8 li 70 18.70 51.30 263-1.77 45 82 31.03 50.97 2597.48 60 36 37.50 43.50 235-2.25 12 13 ao e 44.44 44.56 1985.2c 40 • 100 92 50.00 42.00 1764.00 14 '5 '6 17 SUM o"ľ square residuals 30 20 KD 20226.42 • - 18 0 19 20 koncentrace proteinu [B] Návod vznikl na základě videa - autor Karl Zuvela https://youtu.be/4jpoCGWmfeM