Experimentální embryologie
Bi1130
Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 1
Mgr. Jakub Harnoš, Ph.D.
JS 2023 28.4.2023
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 12
Proteiny
̶ Jedna ze čtyř skupin
biologických
makromolekul
̶ Kromě stavební funkce,
proteiny mají jedinečnou
a nezastupitelnou roli v
intra- a inter-celulární
signalizaci
https://www.chegg.com/
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 13
Proteiny
Buněčná signalizace ve vývoji: nezastupitelná role proteinů
Hikasa et Sokol, 2013.
Wnt signaling in vertebrate axis specification.
Cold Spring Harb Perspect Biol.
Funyama et al., 1995.
Embryonic axis induction by the
armadillo repeat domain of betacatenin:
evidence for intracellular
signaling.
JCB
a) Analýza výstupů proteinových sign. drah
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 14
Proteiny
Made by James Harnos
Buněčná signalizace ve vývoji: nezastupitelná role proteinů
Kanonická signalizace WNT:
b) Analýza proteinů v sign. drahách
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 15
Proteiny
Made by James Harnos
Buněčná signalizace ve vývoji: nezastupitelná role proteinů
b) Analýza proteinů v sign. drahách:
a) Analýza výstupů proteinových sign. drah:
Pokryto vesměs přednáškami z Vývoj. biologie
Náplň této přednášky
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 16
Osnova
̶ Meziproteinové interakce (PPI)
Made by James Harnos
̶ Proteiny
̶ Analýza proteinů
(lokalizace, konformace, aktivita)
̶ Post-translační modifikace (PTM)
Dnes: analýza proteinu Dishevelled (DVL) v kanonické signalizace WNT
̶ Vytváření pracovní hypotézy
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 17
Úvod
̶ Dobrý příklad proteinu fungujícím v buněčné signalizaci (WNT)
̶ Téma mého studia za posledních 10 let
Wallingford JB, Habas R. 2005
The developmental biology of
Dishevelled: an enigmatic protein
governing cell fate and cell polarity.
Development.
Proč Dishevelled (DVL)?
dishevelled hair style
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 18
Osnova
̶ Meziproteinové interakce (PPI)
Made by James Harnos
̶ Proteiny
̶ Analýza proteinů
(lokalizace, konformace, aktivita)
̶ Post-translační modifikace (PTM)
Dnes: analýza proteinu Dishevelled (DVL) v kanonické signalizace WNT
̶ Vytváření pracovní hypotézy
Harnos et al., 2019.
Dishevelled-3 conformation dynamics analyzed by FRETbased
biosensors reveals a key role of casein kinase 1.
Nat Comm
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 19
Analýza proteinů: lokalizace
̶ Fluorescence
jev, kdy molekulární systém absorbuje a poté emituje světlo.
Made by James Harnos
Detekce?
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 110
Analýza proteinů: lokalizace
̶ Fluorescence
jev, kdy molekulární systém absorbuje a poté emituje světlo.
GFP
(přednáška 13)
Detekce?
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 111
Analýza proteinů: lokalizace
̶ Fluorescence: druhy/typy/pojmy
̶ epi-fluorescence vs. imuno-fluorescence
̶ proteiny: endogenní vs. exogenní
̶ mikroskopie živých buněk („live-imaging“) vs. fixace vzorku
̶ Světelná mikroskopie se širokým zorným polem („wide-field“) vs.
konfokální mikroskopie (…více příště)
Princip: GFP a deriváty: přednáška 13 (značení protilátkámi: příště)
Princip: klonovací techniky, př. CRISPR: přednáška 12 (transfekce, injikace DNA/RNA apod.: přednáška 12)
Možnosti: pouze epi-fluorescence (přednáška 13) jak epi-, tak imuno-fluorescence
Detekce?
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 112
Analýza proteinů: lokalizace
̶ Fluorescence: příklad
Protein Dishevelled (DVL)
Harnos et al., 2019.
Dishevelled-3 conformation dynamics analyzed by FRET-based
biosensors reveals a key role of casein kinase 1.
Nat Comm
pohled
shora
na buňku
DVL DVL DVL
Lokalizace proteinu může mnohdy napovědět o jeho funkci
Detekce?
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 113
Analýza proteinů: lokalizace
̶ „Hrubá“ alternativa k fluorescenci: použití frakcionačních kitů
(+ vizualizace frakcí např. pomocí WB – příště)
Lokalizace proteinu může mnohdy napovědět o jeho funkci
https://www.abcam.com/
Detekce 2?
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 114
Osnova
̶ Meziproteinové interakce (PPI)
Made by James Harnos
̶ Proteiny
̶ Analýza proteinů
(lokalizace, konformace, aktivita)
̶ Post-translační modifikace (PTM)
Dnes: analýza proteinu Dishevelled (DVL) v kanonické signalizace WNT
̶ Vytváření pracovní hypotézy
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 115
Analýza proteinů: konformace
Malé molekuly Velké molekuly
www.stereoelectronics.org
www.quora.com
Proč konformace?
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 116
Analýza proteinů: konformace
̶ FRET: Förster/ fluorescence resonance energy transfer
Made by James Harnos
Neradiativní
přenos energie
mezi dvěma
blízkými fluorofory
Detekce?
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 117
Analýza proteinů: konformace
̶ FRET: Förster/ fluorescence resonance energy transfer
Konformace (dnes)Meziproteinové interakce (příště)
Neradiativní
přenos energie
mezi dvěma
blízkými fluorofory
Detekce?
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 118
Analýza proteinů: konformace
̶ FRET: Förster/ fluorescence resonance energy transfer
Neradiativní
přenos energie
mezi dvěma
blízkými fluorofory
Detekce?
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 119
Analýza proteinů: konformace
̶ FRET: Förster/ fluorescence resonance energy transfer
Made by James Harnos
Protein
Dishevelled
(DVL)
Detekce?
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 120
Analýza proteinů: konformace
̶ FRET: Förster/ fluorescence resonance energy transfer
Harnos et al., 2019.
Dishevelled-3 conformation dynamics analyzed by FRET-based
biosensors reveals a key role of casein kinase 1.
Nat Comm
Protein Dishevelled (DVL)
Detekce?
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 121
Analýza proteinů: konformace
̶ FRET: Förster/ fluorescence resonance energy transfer
Harnos et al., 2019.
Dishevelled-3 conformation dynamics analyzed by FRET-based
biosensors reveals a key role of casein kinase 1.
Nat Comm
Protein Dishevelled (DVL)
Detekce?
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 122
Analýza proteinů: konformace
̶ FRET: Förster/ fluorescence resonance energy transfer
Abe et al., 2013.
Non-Invasive In Vivo Imaging of Near Infrared-labeled
Transferrin in Breast Cancer Cells and Tumors Using
Fluorescence Lifetime FRET.
Plos One
In vivo!
Jen v buňkách?
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 123
Osnova
̶ Meziproteinové interakce (PPI)
Made by James Harnos
̶ Proteiny
̶ Analýza proteinů
(lokalizace, konformace, aktivita)
̶ Post-translační modifikace (PTM)
Dnes: analýza proteinu Dishevelled (DVL) v kanonické signalizace WNT
̶ Vytváření pracovní hypotézy
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 124
Analýza proteinů: aktivita
̶ Vysvětlení pojmů: aktivita vs. „aktivita“
Př.: Enzym – enzymatická reakce Jiné proteiny (několik příkladů):
Vazba na jiné proteiny (PPI – dnes/příště)
„Scaffold“ proteiny – platforma pro mnoho PPI
Vazba na DNA ( TF)
Změny aktivity/“aktivity“?
− Úroveň (př. makroskopická, …, molekulární)
− Kvalitativní vs. Kvantitativní
− ….
Co je to aktivita?
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 125
Analýza proteinů: aktivita
̶ Příklad 1: duplikace tělní osy (embryo Xenopus laevis)
Př. přidání DVL
Harnos et al., 2019.
Dishevelled-3 conformation dynamics analyzed by FRET-based
biosensors reveals a key role of casein kinase 1.
Nat Comm
(pozn. unikátní pro každou sign. dráhu)
Makroskopická kvalitativní změna: duplikace tělní osy
Wallingford JB, Habas R. 2005
The developmental biology
of Dishevelled: an enigmatic
protein governing cell fate and
cell polarity.
Development.
Detekce?
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 126
Analýza proteinů: aktivita
̶ Příklad 2: reportérová esej (pozn. unikátní pro každou sign. dráhu)
WNT: TopFlash Př. přidání DVL
Harnos et al., 2019.
Dishevelled-3 conformation dynamics analyzed by FRET-based
biosensors reveals a key role of casein kinase 1.
Nat Comm
Molekulární kvantitativní změna: množství β-kateninu
Detekce?
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 127
Osnova
̶ (Meziproteinové) interakce (PPI)
Made by James Harnos
̶ Proteiny
̶ Analýza proteinů
(lokalizace, konformace, aktivita)
̶ Post-translační modifikace (PTM)
Dnes: analýza proteinu Dishevelled (DVL) v kanonické signalizace WNT
̶ Vytváření pracovní hypotézy
Fosforylace
̶ První popsaná PTM proteinů (E. P. Kennedy, 1954)
̶ Reverzibilní (enzymy: fosfatázy)
̶ Připojení malé anorganické skupiny PO4
3- (neg.)
̶ Aminokyseliny: Ser, Thr, Tyr
̶ Enzymy: kinázy + ATP (substrát i zdroj E)
̶ Funkce: „rychlá“ regulace + signalizace (sign. dráhy)
Posttranslační modifikace proteinů
Molekula ATP
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 128
Fosforylace
̶ Př. 1: elektroforetický posun (shift) molekuly DVL pomocí WB (příště)
Posttranslační modifikace proteinů
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 129
Harnos et al., 2019.
Dishevelled-3 conformation dynamics analyzed by FRET-based
biosensors reveals a key role of casein kinase 1.
Nat Comm
Velikost
proteinů
Detekce?
-
+
Fosforylace
̶ Př. 2: analýza PTM pomocí hmotnostní spektrometrie (přednáška 7)
Posttranslační modifikace proteinů
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 130
Harnos et al., 2019.
Dishevelled-3 conformation dynamics analyzed by FRET-based
biosensors reveals a key role of casein kinase 1.
Nat Comm
Detekce?
Chugunova et al., 2018.
Mining for Small Translated
ORFs.
J Proteome Res
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 131
Osnova
̶ (Meziproteinové) interakce (PPI)
Made by James Harnos
̶ Proteiny
̶ Analýza proteinů
(lokalizace, konformace, aktivita)
̶ Post-translační modifikace (PTM)
Dnes: analýza proteinu Dishevelled (DVL) v kanonické signalizace WNT
̶ Vytváření pracovní hypotézy
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 132
Proteinové interakce
a) Ko-imunoprecipitace (co-IP)
̶ Inkubace lyzátu s protilátkou (Ab)
̶ Imunoprecipitace („vychytání“) částicemi/kuličkami s proteinem A/G
̶ Separace částic od zbytku lyzátu? Centrifugace vs. magnetismus
̶ Analýza vzorku: SDS-PAGE + Western blot (příště)
Detekce?
co-IP = studium fyzické interakce proteinů
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 133
Proteinové interakce
Harnos et al., 2019.
Dishevelled-3 conformation dynamics analyzed by FRET-based
biosensors reveals a key role of casein kinase 1.
Nat Comm
co-IP = studium fyzické interakce proteinů
Vytváření delečních DNA konstruktů:
a) Ko-imunoprecipitace (co-IP)
Detekce?
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 134
Proteinové interakce
b) Proteinové čipy
̶ Matrice s peptidy odvozenými od proteinu zájmu
̶ Přidání vazebného proteinu, tzv. partnera
̶ Detekce partnera pomocí protilátek (příště)
+ Analýza velkého množství interakcí zároveň
- Ovlivnění struktury a vlastností připojením na
matrici, spíše in vitro metoda, náročná tvorba
čipů: finance + čas
Harnos et al., 2019.
Dishevelled-3 conformation dynamics analyzed by FRET-based
biosensors reveals a key role of casein kinase 1.
Nat Comm
Detekce?
Výstup:
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 135
Proteinové interakce
Harnos et al., 2019.
Dishevelled-3 conformation dynamics analyzed by FRET-based
biosensors reveals a key role of casein kinase 1.
Nat Comm
b) Proteinové čipy – DVL3
Detekce?
Příklad
kvantifikace
signálu:
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 136
Osnova
̶ (Meziproteinové) interakce (PPI)
Made by James Harnos
̶ Proteiny
̶ Analýza proteinů
(lokalizace, konformace, aktivita)
̶ Post-translační modifikace (PTM)
Dnes: analýza proteinu Dishevelled (DVL) v kanonické signalizace WNT
̶ Vytváření pracovní hypotézy
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 137
Vytváření pracovní hypotézy
Harnos et al., 2019.
Dishevelled-3 conformation dynamics analyzed by FRET-based
biosensors reveals a key role of casein kinase 1.
Nat Comm
a) „aktivita“ DVL
ve WNT:
Postup 1: je Váš protein aktivní/“aktivní“ v
signalizaci Vašeho zájmu?
b) „aktivita“ DVL
ve WNT:
Kvalitativně: duplikace tělní osy Kvantitativně: množství β-kateninu
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 138
Vytváření pracovní hypotézy
Harnos et al., 2019.
Dishevelled-3 conformation dynamics analyzed by FRET-based
biosensors reveals a key role of casein kinase 1.
Nat Comm
Postup 2: Závisí na něčem (známém) jeho aktivita/“aktivita“?
a) „aktivita“ DVL ve
WNT závislá na
aktivitě CK1ε:
b) „aktivita“ DVL ve
WNT závislá na
aktivitě CK1ε:
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 139
Vytváření pracovní hypotézy
Harnos et al., 2019.
Dishevelled-3 conformation dynamics analyzed by FRET-based
biosensors reveals a key role of casein kinase 1.
Nat Comm
Postup 3: Interaguje fyzicky protein Vašeho zájmu
s pozitivní kontrolou (již známý protein)?
a) co-IP: b) peptidové knihovny:
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 140
Vytváření pracovní hypotézy
Harnos et al., 2019.
Dishevelled-3 conformation dynamics analyzed by FRET-based
biosensors reveals a key role of casein kinase 1.
Nat Comm
Postup 4: Dochází ke změně lokalizace, PTM, či konformace?
př. fluorescence př. posun na WB př. FRET
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 141
Vytváření pracovní hypotézy
Harnos et al., 2019.
Dishevelled-3 conformation dynamics analyzed by FRET-based
biosensors reveals a key role of casein kinase 1.
Nat Comm
Postup 5: udělejte závěr z Vašich exper. dat:
Příklad:
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 142
Shrnutí
Made by James Harnos
̶ Proteiny
̶ Analýza proteinů
(lokalizace – Fluorescence, konformace – FRET, aktivita – funkční eseje)
̶ Post-translační modifikace (PTM)
fosforylace
̶ Vytváření pracovní hypotézy
Dnes: analýza proteinu Dishevelled (DVL) v kanonické signalizace WNT
̶ Meziproteinové interakce (PPI)
co-IP, peptidové čipy
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii 243
Osnova pro příště
̶ (Meziproteinové) interakce (PPI)
Made by James Harnos
̶ Proteiny
̶ Analýza proteinů
(lokalizace, konformace, aktivita)
̶ Post-translační modifikace (PTM)
Příště: další PTM, techniky studujících PPI a několik příkladů z Vývoj. biologie
Bi1130 - Metody analýzy proteinů využívané ve Vývojové biologii44
Děkuji Vám za pozornost